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요약

여기에서는 비타민 A 막 수용체와 광 수용체 옵신과 각각의 생리학적 리간드와 단백질-리간드 상호 작용을 연구하기 위한 두 가지 정량적 방법을 설명합니다.

초록

식이 비타민 A/전-트랜스 레티놀(ROL)이 몸 전체에 분포하는 것은 말초 조직에서 레티노이드 기능을 유지하고 시각 기능을 위한 레티닐리덴 단백질을 생성하는 데 중요합니다. RBP4-ROL은 혈액에 존재하는 레티놀 결합 단백질 4(RBP4)와 ROL의 복합체입니다. 간에서 레티놀 결합 단백질 4 수용체 2(RBPR2)와 눈에서 레티노산 6 레티놀(STRA6)에 의해 STimulated 된 두 개의 막 수용체는 순환계 RBP4와 결합하며 이 메커니즘은 ROL을 세포에 내재화하는 데 중요합니다. 수용체-리간드 동역학을 조사하는 방법을 확립하는 것은 레티노이드 항상성에 대한 비타민 A 수용체의 생리학적 기능을 이해하는 데 필수적입니다. SPR(Surface Plasmon Resonance) 분석을 사용하여 생리학적 리간드 RBP4와 함께 비타민 A 막 수용체의 결합 친화도 및 운동 매개변수를 분석할 수 있습니다.

이러한 방법론은 비타민 A 결핍의 병리학적 상태를 이해하는 데 중요한 RBPR2 및 STRA6의 RBP4 결합 모티프에 대한 새로운 구조 및 생화학적 정보를 밝힐 수 있습니다. 눈에서 내재화된 ROL은 광수용체의 옵신과 결합하여 레티닐리덴 단백질인 로돕신을 형성하는 시각적 발색단인 11-시스 레티날로 대사됩니다. 빛의 흡광도는 11-시스 레티널의 cis-to-trans 이성질체화를 일으켜 로돕신의 구조적 변화를 유도하고 그에 따른 광전달 캐스케이드의 활성화를 유발합니다. 혈청 및 안구 ROL의 농도 감소는 레티닐리덴 단백질 형성에 영향을 미칠 수 있으며, 이는 로돕신 국소화 오류, 아포단백 옵신 축적, 야맹증 및 광수용체 외부 분절 변성을 유발하여 색소성 망막염 또는 레베르 선천성 색소변증을 유발할 수 있습니다.

따라서 망막에서 G 단백질 결합 수용체 opsin-11-cis 망막 복합체를 정량화하기 위한 분광광도계 방법론은 위에서 언급한 병리학적 상태에서 망막 세포 변성의 메커니즘을 이해하는 데 중요합니다. 이러한 포괄적인 방법론을 통해 조사관은 인간의 시각 기능을 유지하는 데 중요한 광수용체에서 레티닐리덴 단백질 농도를 생성하고 유지하는 데 중요한 전신 및 안구 레티노이드 항상성을 유지하는 데 있어 식이 비타민 A 공급을 더 잘 평가할 수 있습니다.

서문

식이요법으로 얻은 비타민 A/all-trans 레티놀/ROL은 시각 기능에 중요한 역할을 하는 구성 요소입니다 1,2. 식이 비타민 A의 대사 산물인 발색단 11-시스 레티날은 G 단백질 결합 수용체(GPCR) 옵신에 결합하여 광수용체에서 레티닐리덴 단백질인 로돕신을 생성합니다. 빛이 눈에 내리쬐면 로돕신의 구성은 11-cis-retinal 구성 요소가 all-trans-retinal로 전환됨으로써 근본적인 변화를 겪습니다. 이 구성 변화는 간상 광수용체 내에서 광전달 캐스케이드를 유발하여 빛을 전기 신호로 변환하고, 이 신호는 시신경 3,4,5,6,7,8,9,10을 통해 뇌의 시각 피질로 전달됩니다 . 혈청 및 안구 ROL의 농도 감소는 레티닐리덴 단백질 형성에 영향을 미칠 수 있으며, 이는 다시 옵신 국소화 오류, 아포단백 옵신 축적, 야맹증 및 광수용체 OS 변성을 유발하여 색소성 망막염 또는 Leber 선천성 무뇨증을 유발할 수 있으며, 이는 실명을 유발할 수 있습니다 3,10.

All-trans 레티놀은 식이 비타민 A의 기본 수송 형태이며 모든 기능성 레티노이드 및 식이 비타민 A 대사 산물이 파생되는 공급원입니다. 간은 식이 비타민 A를 저장하는 주요 기관 역할을 합니다. 간 레티놀은 레티놀 결합 단백질 4(RBP4)와 복합체로 혈청을 통해 운반됩니다. 주로 간에서 발현되는 RBP4는 레티놀 기질과 트랜스티레틴(TTR)과 함께 홀로그램 복합체를 형성하여 순환계(11,12,13,14,15,16,17)로 들어갑니다. 1970년대에 RBP4에 대한 세포 표면 수용체에 대한 보고는 막 수송 단백질이 레티노이드의 세포 안팎으로의 수송을 돕는다는 가설로 이어졌습니다. RBP4 결합 레티놀(RBP4-ROL)의 세포 표면 수용체는 눈의 망막 색소 상피(RPE)에서 레티노산 6 레티놀(STRA6)에 의해 STimulated된 것으로 확인되었습니다. STRA6는 순환성 holo-RBP4 복합체에 결합하고 RBP4-bound 레티놀을 RPE를 통해 셔틀하여 광수용체에 의해 활용되도록 합니다18,19. STRA6의 돌연변이는 안구 ROL 농도 감소와 관련된 수많은 질병 및 표현형을 유발할 수 있습니다. 발달 중 STRA6 돌연변이는 Matthew-Wood 증후군 20,21,22,23,24,25,26,27과 관련된 표현형과 겹치는 무안구증, 소안구 및 기타 비안구 증상을 유발할 수 있습니다. STRA6는 눈의 RPE와 같은 다른 장기 및 조직에서 발현되지만 모든 조직에서 발현되는 것은 아닙니다26,27. 레티노이드 저장의 주요 부위는 간이지만, STRA6는 간에서 발현되지 않습니다.

Alapatt와 동료들은 레티놀 결합 단백질 4 수용체 2 (RBPR2)가 높은 친화력으로 RBP4와 결합하고 RPE28의 STRA6와 유사하게 간에서 RBP4 결합 레티놀의 흡수를 담당한다는 것을 발견했습니다. RBPR2는 STRA6 29,30,31과 구조적 상동성을 공유하는 것으로 보고되었습니다. RBP4는 RBPR2와 STRA6 사이뿐만 아니라 29,30,31 사이에서 부분적으로 보존된 아미노산 결합 도메인인 RBPR2의 잔기 S294, Y295 및 L296에 결합하는 것으로 제안됩니다. 이러한 연구에서 하나 이상의 세포외 결합 잔기/도메인을 포함하는 STRA6 및 RBPR2와 같은 비타민 A 막 수용체가 순환 RBP4-ROL과 상호 작용하는 것으로 제안되었습니다. 따라서 막 수용체는 간과 눈과 같은 표적 조직으로의 ROL 내재화를 위해 순환 RBP4에 대한 수용체 결합에 중요한 역할을 합니다.

이 연구의 첫 번째 부분에서는 SPR(Surface Plasmon Resonance)을 사용하여 두 개의 비타민 A 막 수용체(RBPR2 및 STRA6)와 생리학적 리간드 RBP431의 상호 작용을 조사했습니다. 리간드 복합체에 대한 단백질의 결합 친화도 및 결합/해리 역학은 SPR을 사용하여 실시간으로 측정할 수 있습니다. 이 방법론은 비타민 A 결핍증31,32의 병리학적 상태를 이해하는 데 중요한 RBPR2 및 STRA6의 RBP4 결합 모티프에 대한 중요한 역학적, 구조적 및 생화학적 정보를 제공하는 것을 목표로 했습니다. 위에서 언급한 바와 같이, 순환 ROL은 STRA6를 통해 RPE에 내재화되어 발색단 11-시스 망막을 생성하고, 이 발색단은 옵신에 결합하여 광수용체(33)에서 레티닐리덴 단백질인 로돕신을 생성합니다. 우리는 분광광도법 방법론을 사용하여 쥐 망막 용해물에서 GPCR-opsin 및 그 리간드 11-시스 망막 복합체를 정량화했으며, 이는 색소성 망막염 또는 Leber 선천성 무모증 안구 병리학적 상태에서 감소된 레티닐리덴 단백질, 로돕신의 메커니즘을 이해하는 데 중요합니다34. 일반적으로 이러한 프로토콜은 전신 및 안구 비타민 A 항상성에 영향을 미치는 돌연변이 RBP4, STRA6 또는 RBPR2의 생리학적 결과 또는 돌연변이 로돕신 또는 레티노이드 주기 단백질이 시각 기능에 미치는 영향을 시험관에서 연구하는 데 적용할 수 있습니다35,36.

프로토콜

1. 표면 플라즈몬 공명(SPR) 방법론

  1. 마우스 RBP4 단백질의 준비 및 정제
    1. 전장 마우스 RBP4(msRBP4) cDNA(NCBI 참조 서열: NM_001159487.1)를 생성하기 위한 프라이머를 설계합니다. msRBP4 cDNA를 pET28a His-tag 카나마이신 내성 발현 벡터로 클로닝하고 BL-21 DE3 세포에서 발현합니다(재료 표).
    2. BL-21 DE3 유능한 세포(제조업체의 프로토콜에 따름)를 ligated msRBP4-pET28a 벡터로 형질전환한 다음 Kanamycin 50μg/mL30,37을 함유한 Luria-Bertani(LB) 브로스 한천 플레이트에 플레이트합니다. 인큐베이터에서 37°C에서 밤새 플레이트를 배양하고 다음 날 양성 콜로니를 스크리닝합니다.
    3. 단일 콜로니를 선택하고 카나마이신 50μg/mL를 함유한 LB 육수 5mL에서 37°C에서 밤새 배양합니다.
    4. 카나마이신 50μg/mL를 함유한 LB 육수 500mL에서 2차 배양의 경우 1% 부피의 1차 배양액(1.1.3단계에서)을 사용하고 37°C에서 3-4시간 동안 배양합니다. 분광 광도계를 사용하여 광학 밀도를 확인하십시오. 이상적으로는 OD 값이 0.6과 1 사이인 경우 진행하여 하룻밤 동안 24°C에서 0.5mM IPTG로 단백질 발현을 유도합니다.
    5. 0.1-1 mM 및 16-30 °C 온도 범위의 여러 IPTG 농도를 사용하여 msRBP4 발현 및 안정성을 최적화합니다.
    6. 배양액을 16,000× g 에서 10분 동안 원심분리하고(1.1.5단계에서) 상층액을 버리고 펠릿을 얼음 위에 유지합니다.
    7. 용해 완충액(50mM Tris-HCl, 150mM NaCl, 0.1%(v/v) Triton X-100, 10% 글리세롤, 0.5mM PMSF 및 프로테아제 억제제[pH 8.0])로 펠릿을 균질화합니다. 250 와트 출력 및 40-50 % 20 kHz 출력 주파수의 균질화기를 사용하여 15 초 ON 및 30 초 OFF 사이클 동안 용해물을 초음파 처리합니다. 5회 반복합니다.
    8. 세포 파편과 용해되지 않은 세포를 16,000×g에서 20 분 동안 원 심분리하여 제거합니다. 용해물의 상층액을 완충액 평형 니켈 NTA 컬럼을 통과시킵니다.
    9. 30mM 이미다졸을 함유한 용해 완충액(1.1.8단계)으로 컬럼을 세척합니다.
    10. 250mM 이미다졸을 함유한 완충액을 사용하여 결합된 msRBP4 단백질을 분획으로 용리합니다. 용리된 분획을 실행하고 12% SDS 폴리아크릴아미드 겔로 단백질 양을 육안으로 모니터링하고, 메탄올:물:아세트산(45:45:10) 용액에서 Coomassie Brilliant Blue R-250으로 염색하고 Coomassie 염색 메탄올:물:아세트산(45:45:10)이 없는 용액으로 탈색합니다.
    11. 사용하지 않는 분획을 합동하고 10kDa MWCO의 10K 투석 카세트로 합동된 분획을 투석합니다.
    12. 12% SDS-PAGE 겔에서 투석된 분획의 품질을 평가하고 단백질 농도를 정량화합니다.
      참고: Apo-RBP4 단백질이 SPR 분석에 사용되었습니다. holo-RBP4 (RBP4-retinol)를 생성하기 위해, 다른 곳에 게시된 상세한 프로토콜을 참조하라36,37.
  2. 트립토판 형광 분석 및 원형 이색법(CD) 분광법에 의한 구조 및 상호 작용에 대한 RBP4를 사용한 RBPR2 및 STRA6 펩타이드의 초기 검증
    1. 트립토판 형광 분석
      1. 온라인 단백질 조성 분석 도구(https://web.expasy.org/protparam/)를 사용하고 아미노산 염기서열을 한 글자 코드에 붙여넣어 재조합 RBP4 단백질의 구조적 조성과 RBPR2 및 STRA6의 개별 펩타이드를 평가하여 개별 펩타이드 및 단백질의 트립토판 아미노산 잔기를 측정합니다(재료 표).
      2. 파라미터 계산 버튼을 클릭하고 트립토판(Trp) 잔류물에 대한 아미노산 조성을 평가합니다.
        참고: 트립토판 잔류물은 분석 중인 개별 펩타이드 또는 단백질에 존재해야 합니다.
      3. 개별 RBPR2 및 STRA6 펩타이드를 다양한 마이크로몰 농도로 희석하고 실온에서 5분 동안 96웰 플레이트에 3μg msRBP4로 개별적으로 배양합니다. 290nm에서 혼합물을 excitation하고 300nm에서 400nm 파장의 방출을 스캔합니다.
      4. Blank(완충액만, 펩타이드 및 단백질 없음) 및 펩타이드 제어 조건(단백질 없음)을 사용하여 데이터를 정규화하고 플롯합니다.
        참고: 낮거나 높은 펩타이드 농도에 노출될 때 트립토판 형광 증가는 두 개의 개별 펩타이드와 RBP4 단백질 사이에 긍정적인 상호 작용이 있음을 시사합니다.
    2. Circular dichroism (CD) 분광법
      1. 개별 펩타이드와 재조합 RBP4 단백질을 1x PBS 완충액(pH 7.0)에 희석합니다. 아래 설명과 같이 다양한 농도의 RBPR2 및 STRA6 펩타이드와 RBP4 단백질을 0.1 - 10 μg/mL로 사용하여 품질을 확인합니다.
      2. 0.1cm 경로 길이의 큐벳에 개별 희석된 펩타이드와 단백질을 추가하고 CD 분광광도계(195-250nm)를 사용하여 CD 흡광도/타원도를 측정합니다. 아래 공식을 사용하여 평균 잔차 타원도(θ)를 계산합니다.
        [v] = (S × mRw) / (10cl)
        S는 CD 신호를 mθ 단위로 나타냅니다. mRw는 평균 잔류 질량을 나타냅니다. c는 단백질의 농도를 mg/mL 단위로 나타냅니다. l은 경로 길이(cm)를 나타냅니다.
      3. CD 분광법(https://bestsel.elte.hu)에 의한 단백질 폴드 예측에 대한 BeStSel 2차 구조 분석을 사용하여 분자 구조의 변화율을 계산합니다.
        참고: 2차 구조는 상호 작용 연구 및 상호 작용 결과에 중요한 적절한 접기 및 보존된 확인을 나타냅니다. 영역의 예측된 구조를 검사하고 상호 작용 연구를 계속 진행합니다.

2. 생리학적 리간드 RBP4와 비타민 A 막 수용체(RBPR2 및 STRA6)의 결합 친화도 및 운동 매개변수를 결정하기 위한 SPR 분석

  1. CM5 칩 표면 설정에서 RBP4의 고정을 위해 금 표면에 공유 결합되어 ~100nm 크기로 확장된 카르복시메틸 덱스트란 링커를 운반하는 SPR 센서 칩을 사용합니다. 1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필) 카르보디이미드 염산염(EDC)이 있는 경우 N-하이드록시숙신이미드(NHS)는 칩 표면의 카르복실기를 N-하이드록시숙신이미드 에스테르로 변환하여 아미노산 및 단백질의 아민기와 자발적으로 반응하여 리간드가 칩 표면에 공유 결합하도록 합니다(재료표).
    1. 정제된 msRBP4 단백질을 센서 칩에 고정시킵니다(그림 1 및 그림 2). 소프트웨어 실행 메뉴에서 마법사를 선택하고 고정 옵션을 진행합니다. 고정화 완충액(10mM 아세트산 나트륨 완충액, pH 5.0)에 리간드(1.1단계에서 얻은 msRBP4 단백질)를 10μg/mL(리간드 4μL + 완충액 396μL)로 희석하고 커플링 시약을 바이알에 분주합니다. 소프트웨어 제어에서 Immobilization Setup 마법사 창을 열고 CM5 Chip을 선택한 다음 Kinetic Study and Wash solution에서 Rmax 30 RU를 달성하기 위한 Immobilize flow cell 2 및 1,200 Response Unit (RU)의 목표 수준: Ethanolamine을 선택합니다. RBP4라는 이름을 입력하고 다음을 클릭합니다.
      참고: 선택 사항: 실행 중인 버퍼 PBST(0.05% Tween 20 세제 용액이 포함된 인산염 완충 식염수)를 사용한 프라이밍을 이전에 수행한 경우 실행 전 프라임 옵션에 대한 시스템 준비 대화 상자가 필요하지 않습니다.
    2. Rack position(랙 위치) 대화 상자에서 Eject Rack(랙 꺼내기)을 클릭합니다. 랙을 가져와서 각 시약에 대해 할당된 부피(156μL의 msRBP4, 177μL의 에탄올아민, 89μL의 EDC, 89μL의 NHS 및 빈 바이알)가 있는 바이알을 놓습니다. 샘플 바이알이 있는 랙을 삽입하고 OK(확인)와 Next(다음)를 클릭합니다.
    3. Prepare Run Protocol(실행 프로토콜 준비) 대화 상자에서 Start and Save(시작 및 저장)를 클릭합니다.
  2. RBPR2 및 STRA6 펩타이드 kinetic assay setup
    1. 마우스 RBPR2, 돌연변이 RBPR2 및 STRA6 펩타이드(이전에 화학적으로 합성되고 이전에31 번 및 재료 표에 나열됨)를 0.8-26.6μM 범위의 러닝 버퍼에서 직렬로 희석합니다.
    2. 제어 소프트웨어를 열고 Kinetics/Affinity wizard를 선택합니다. 파일 | 템플릿을 열고 Kinetics/Affinity를 선택합니다. 주입 시퀀스 대화 상자 흐름 경로 2-1(플로우 셀 2는 활성, 플로우 셀 1은 참조)을 입력하고 칩 유형 CM5를 확인한 후 다음을 클릭합니다. 설정 대화 상자에서 Run startup cycles(시작 주기 실행)를 확인하고 Solution: buffer and cycles:(솔루션: 버퍼 및 주기:)를 입력한 후 Next(다음)를 클릭합니다.
    3. 주입 파라미터 대화 상자에서 샘플 파라미터 값을 입력합니다: 접촉 시간: 120초, 유량 30μL/min, 해리 시간 300초; 재생 파라미터: 재생 솔루션 이름: Glycine-HCl(pH 2.5), 접촉 시간: 30초, 유속: 30μL/min을 입력하고 다음을 클릭합니다.
    4. samples 대화 상자에서 펩타이드의 이름, 분자량 및 농도를 입력하고 next(다음)를 클릭합니다. 랙 위치 대화 상자에서 희석된 펩타이드를 1 - 100 μM 및 ~230 μL의 완충액, ~120 μL의 완충액, ~1,000 μL의 글리신, pH 2.5의 다양한 농도의 개별 ~120 μL 샘플로 랙의 위치에 할당합니다. Eject Rack(랙 추출)을 클릭하고 모든 바이알을 삽입합니다. Next(다음)를 클릭하고 Prepare Run Protocol(실행 프로토콜 준비) 대화 상자에서 Start(시작)를 클릭하고 파일 이름을 입력한 다음 Save(저장)를 클릭합니다(그림 2).
    5. 소프트웨어에서 시작 메뉴를 클릭하고 평가를 선택합니다. 소프트웨어에서 파일 열기를 선택하고 드롭다운 선택 메뉴에서 Fc2-1을 선택하여 msRBP4 및 돌연변이 msRBPR2 및 msSTRA6 펩타이드의 결합 및 해리 단계에 대한 참조 셀 빈 값 활성 센서그램을 분석합니다.
    6. Kinetics/Affinity 드롭다운을 클릭하고 Surface bound를 선택합니다. Select Curves 대화상자를 열려면 테이블에 include column을 선택하고 Next를 클릭합니다. 데이터 선택 대화 상자를 선택하여 비어 있는 센서그램을 표시합니다. 운동학(Kinetics) 및 선호도(Affinity)를 클릭하고 기본 매개변수를 유지한 다음 커브 피팅을 위한 맞춤(Fit) 옵션을 클릭합니다. 보고서 탭에서 평형 해리 상수 Kd 및 Ka 또는 K를 연관 속도에서 검사하고 Kd 또는 K 에서 해리 속도를확인합니다. Kinetics 데이터 센서그램.txt 탭으로 구분된 형식으로 저장하고 값을 사용하여 그래프를 그립니다(그림 3).
    7. 친화성 역학 상수 Kd (평형 상태에서 수용체의 절반에 결합하는 리간드 농도)를 결정하기 위해 소프트웨어에 사용된 XY 플롯에 대한 평가에서 생성된 .txt 형식 파일의 데이터 열을 복사하여 붙여넣습니다. 분석 및 비선형 회귀 분석(곡선 맞춤)을 클릭하고 데이터 열을 확인한 다음 확인을 클릭합니다. 매개 변수 대화 상자에서 Binding saturation 및 One site Specific binding fitting model 을 클릭하여 다음 공식을 확인합니다.
      Y= (B최대*X)/(Kd + X)
      여기서 Bmax는 결합 부위의 최대 수(반응 단위), X는 펩타이드의 농도, Y는 결합 부위(반응 단위)입니다(그림 3).

3. 망막 용해물에서 GPCR-11- 시스 망막 단백질 복합체(레티닐리덴 단백질 로돕신)를 정량화하는 분광광도법 방법론

  1. 성체 WT-C57BL/6J 마우스로 구성된 미리 결정된 마우스 그룹을 암실로 운반합니다.
  2. 12-16 시간 동안 밤새 생쥐를 어둡게 적응시키고 빨간불 아래에서 생쥐를 안락사 챔버에 넣고 조절기의 CO2 가스 밸브를 ~ 5 분 동안 5L / min으로 엽니 다. 뒤로 당겨진 목과 꼬리에 압력을 가하여 사망을 보장합니다(경추 탈구).
  3. 안구를 절삭하고 20mM 비스-트리스 프로판(1,3-bis(트리스(하이드록시메틸)메틸아미노)프로판)을 함유한 얼음처럼 차가운 완충액에서 눈을 균질화합니다. BTP) pH 7.4, 150mM NaCl, 1mM EDTA 및 프로테아제 억제제 포함(재료표).
  4. 4 ° C에서 16000 x g 에서 15 분 동안 균질액을 원심 분리하고 수용성 세포질 단백질을 함유 한 상층액을 버립니다. 20mM n-dodecyl-β-d-maltoside(DDM), 20mM bis-tris propane(BTP) pH 7.4, 100mM NaCl, 1mM EDTA를 함유하고 회전 플랫폼에서 4°C에서 1시간 동안 프로테아제 억제제를 포함하는 완충액에 펠릿화된 멤브레인 및 멤브레인 단백질을 재현탁 및 용해시킵니다.
  5. 16000 x g, 4 °C에서 1시간 동안 재용해된 멤브레인 분획을 원심분리합니다. 상층액을 30μL의 Rho 1D4 항체 비드와 혼합하고 회전 플랫폼에서 4°C에서 1시간 동안 배양합니다.
  6. 마그네틱 스탠드를 사용하여 비드를 사용하여 풀다운을 분리하고 상층액을 버리고 완충액 20mM 비스트리스 프로판(BTP) pH 7.4, 500mM NaCl 및 2mM DDM으로 비드를 세척합니다.
  7. 완충액 20mM 비스-트리스 프로판(BTP) pH 7.4, 100mM NaCl, 0.2mg/mL 1D4 펩타이드(-TETSQVAPA)를 포함하는 2mM DDM을 사용하여 실온에서 5-10분 동안 배양하여 로돕신 단백질을 용리합니다(그림 4 및 그림 5).
  8. 경사 광도계를 사용한 빠른 스캔 설정에서 직사각형, 서브 마이크로, 석영, 2mm 조리개, 10mm 경로 길이, 50μL 큐벳을 사용하여 200nm에서 800nm까지의 흡광도에 대한 용리를 분석합니다.
    알림: 고품질 Quartz 큐벳만 사용하십시오(그림 4).
  9. 품질을 검증하고 결정하려면 용리를 확인하고 1분 동안 밝은 빛에 노출시킨 다음 3.8단계를 반복합니다.
  10. Blank 흡광도를 빼고 11-cis 망막 결합 옵신의 경우 500nm, 빛에 노출된 all-trans 망막 결합 opsin의 경우 380nm, 리간드가 없는 Apo-Opsin 단백질의 경우 280nm에서 흡광도를 가진 분석된 흡광도 스펙트럼의 비율을 계산합니다(그림 6). 리간드 망막이 없는 자유 옵신은 500nm에서 기준선 흡광도를 제공합니다.
  11. 로돕신 농도를 정량화하려면 Beer-Lambert의 법칙을 사용하십시오.
    답=ε· C·l 또는 C=A/ε·l
    여기서 A 는 흡광도이고 ε 몰 흡광 계수 (로돕신 ε500 = 40,600 M−1 cm−1 유리 Apo Opsin ε280 = 81,200 M−1 cm−1), C 는 농도이고 l 경로 길이입니다.
  12. 리간드 옵신을 백분율로 정량화하려면 A280/A500의 비율을 사용하십시오.
  13. 공백 빼기 흡광도 스펙트럼을 플로팅하고 자유 옵신 값32를 계산합니다.
  14. 흡광 계수 ε500 = 40600 M−1 cm−1을 사용하여 로돕신의 농도를 계산합니다. 리간드가 없는 옵신의 농도는 흡광 계수ε 280 = 81,200 M−1 cm−1을 사용하여 Beer-Lambert 법칙으로 계산됩니다.

결과

비타민 A 막 수용체와 광수용체 옵신과 각각의 생리학적 리간드와의 단백질-리간드 상호 작용을 연구하기 위해 정량적 방법이 설명되어 있습니다. 재조합 마우스 RBP4는 E. coli 에서 발현되어야 하며 정제된 단백질은 SPR 칩에서 접합 리간드로 사용되어야 합니다. ~40 아미노산 펩타이드의 화학적으로 합성된 RBPR2, STRA6 및 돌연변이 S294A RBPR2 "SYL motif RBP4 상호 작용 세포 ...

토론

프로토콜의 중요한 단계
SPR 방법론
인실리코 모델링 및 도킹 분석: RBPR2(https://alphafold.ebi.ac.uk/entry/Q9DBN1) 및 STRA6의 예측된 구조와 msRBP4 PDB 데이터베이스(RSCB PDB ID: 2wqa)에 대해 알려진 구조를 도킹 연구29,31에 사용해야 합니다. 또한 비타민 A 수용체(RBPR2 및 STRA6)에 대한 추정 결합 부위와 ...

공개

저자는 이해 상충이 없음을 선언합니다. 자금 제공자는 연구 설계에 아무런 역할도 하지 않았습니다. 데이터의 수집, 분석 또는 해석에서; 원고를 작성할 때, 또는 결과를 출판하기로 결정할 때.

감사의 말

저자는 로돕신 흡착 프로토콜에 대한 조언을 해준 Beata Jastrzebska 박사(오하이오주 케이스 웨스턴 리저브 대학교 약리학과)에게 감사를 표합니다. 이 연구는 NIH-NEI 보조금(EY030889 및 3R01EY030889-03S1)과 미네소타 대학의 G.P.L.에 대한 창업 자금의 지원을 받았습니다.

자료

NameCompanyCatalog NumberComments
2-D Quant KitCytiva80648356
Amine Coupling KitCytivaBR100050
Biacore evaluation softwareBiacore S200Version 1.1
Biacore Sensor chip CM5CytivaBR100530
Bis tris propaneSigmaB6755-25G20 mM
BL21 DE3 competent cellsThermo ScientificEC0114
CD spectrophotometerJascoJ-815 Spectropolarimeter
Glycine HCLFisher BioreagentsBP381-1
GraphPad Prism Model fitting, data analysis
LB brothFisher BioreagentsBP1426-500
n-dodecyl-β-d-maltoside (DDM)EMD Millipore324355-1GM2-20 mM
pET28a His-tag Kanamycin-resistant expression vector Addgene69864-3
Plasmid purification kitQiagen27106
Rho1D4 MagBeadsCubeBiotech33299
Slide-A_Lyzer 10K dialysis cassetteThermo Scientific66810
Tween20Fisher BioreagentsBP337-5000.05%
UV vis SpectrophotometerAgilent Cary 60 UV-Vis
Peptide namePeptide sequenceHPLC-purityMass Spec
Mouse Rbpr2 (42)HVRDKLDMFEDKLESYLTHM
NETGTLTPIILQVKELISVTKG		92.14%Conforms
Mouse Stra6 (40)SVVPTVQKVRAGINTDVSYL
LAGFGIVLSEDRQEVVELVK		90.84%Conforms
Mouse Rbpr2 mutant S294A (42)HVRDKLDMFEDKLEAYLTHM
NETGTLTPIILQVKELISVTKG		0.92%Conforms

참고문헌

  1. Dowling, J. E., Wald, G. Vitamin A deficiency and night blindness. Proc Natl Acad Sci U S A. 44 (7), 648-6618 (1958).
  2. Dowling, J. E., Wald, G. The biological function of vitamin A acid. Proc Natl Acad Sci U S A. 46 (5), 587-608 (1960).
  3. Kiser, P. D., Palczewski, K. Retinoids and retinal diseases. Annu Rev Vis Sci. 2 (1), 197-234 (2016).
  4. Harrison, E. H. Mechanisms involved in the intestinal absorption of dietary vitamin A and provitamin A carotenoids. Biochim Biophys Acta. 1821 (1), 70-77 (2012).
  5. Harrison, E. H. Carotenoids, β-apocarotenoids, and retinoids: the long and the short of it. Nutrients. 14 (7), 1411 (2022).
  6. Li, Y., Wongsiriroj, N., Blaner, W. S. The multifaceted nature of retinoid transport and metabolism. Hepatobiliary Surg Nutr. 3 (3), 126-139 (2014).
  7. O'Byrne, S. M., Blaner, W. S. Retinol and retinyl esters: biochemistry and physiology. J Lipid Res. 54 (7), 1731-1743 (2013).
  8. Blomhoff, R. Transport and metabolism of vitamin A. Nutr Rev. 52 (2 Pt 2), S13-S23 (2009).
  9. Chelstowska, S., Widjaja-Adhi, M. A. K., Silvaroli, J. A., Golczak, M. Molecular basis for vitamin A uptake and Storage in Vertebrates. Nutrients. 8 (11), 676 (2016).
  10. Martin Ask, N., Leung, M., Radhakrishnan, R., Lobo, G. P. Vitamin A transporters in visual function: A mini review on membrane receptors for dietary vitamin A uptake, storage, and transport to the eye. Nutrients. 13 (11), 3987 (2021).
  11. Yamamoto, Y., et al. Interactions of transthyretin (TTR) and retinol-binding protein (RBP) in the uptake of retinol by primary rat hepatocytes. Exp Cell Res. 234 (2), 373-378 (1997).
  12. Chen, C. C., Heller, J. Uptake of retinol and retinoic acid from serum retinol-binding protein by retinal pigment epithelial cells. J Biol Chem. 252 (15), 5216-5221 (1977).
  13. Gjøen, T., et al. Liver takes up retinol-binding protein from plasma. J Biol Chem. 262 (23), 10926-10930 (1987).
  14. Blomhoff, R., Norum, K. R., Berg, T. Hepatic uptake of [3H]retinol bound to the serum retinol binding protein involves both parenchymal and perisinusoidal stellate cells. J Biol Chem. 260 (25), 13571-13575 (1985).
  15. Kanai, M., Raz, A., Goodman, D. S. Retinol-binding protein: The transport protein for vitamin A in human plasma. J Clin Invest. 47 (9), 2025-2044 (1968).
  16. Quadro, L., et al. The role of extrahepatic retinol binding protein in the mobilization of retinoid stores. J Lipid Res. 45 (11), 1975-1982 (2004).
  17. Blaner, W. S. STRA6, a cell-surface receptor for retinol-binding protein: The plot thickens. Cell Metab. 5 (3), 164-166 (2007).
  18. Kawaguchi, R., et al. Membrane receptor for retinol binding protein mediates cellular uptake of vitamin A. Science. 315 (5813), 820-825 (2007).
  19. Kawaguchi, R., Zhong, M., Kassai, M., Ter-Stepanian, M., Sun, H. STRA6-catalyzed vitamin A influx, Efflux, and Exchange. J. Membr. Biol. 245 (11), 731-745 (2012).
  20. Pasutto, F., et al. Mutations in STRA6 cause a broad spectrum of malformations including anophthalmia, congenital heart defects, diaphragmatic hernia, alveolar capillary dysplasia, lung hypoplasia, and mental retardation. Am J Hum Genet. 80 (3), 550-560 (2007).
  21. Golzi, C., et al. Matthew-Wood Syndrome is caused by truncating mutations in the retinol-binding protein receptor gene STRA6. Am J Hum Genet. 80 (14), 1179-1187 (2007).
  22. Isken, A., et al. RBP4 disrupts vitamin A uptake homeostasis in a STRA6-deficient animal model for Matthew-Wood Syndrome. Cell Metab. 7 (3), 258-268 (2008).
  23. Ruiz, A., et al. Retinoid content, visual responses, and ocular morphology are compromised in the retinas of mice lacking the retinol-binding protein receptor, STRA6. Investig Opthalmol Vis Sci. 53 (6), 3027-3039 (2012).
  24. Kelly, M., von Lintig, J. STRA6: Role in cellular retinol uptake and efflux. Hepatobiliary Surg Nutr. 4 (4), 229 (2015).
  25. Berry, D. C., et al. The STRA6 receptor is essential for retinol-binding protein-induced insulin resistance but not for maintaining vitamin A homeostasis in tissues other than the eye. J Biol Chem. 288 (34), 24528-24539 (2013).
  26. Amengual, J., et al. STRA6 is critical for cellular vitamin A uptake and homeostasis. Hum Mol Genet. 23 (20), 5402-5417 (2014).
  27. Steinhoff, J. S., Lass, A., Schupp, M. Retinoid homeostasis and beyond: How retinol binding protein 4 contributes to health and disease. Nutrients. 14 (6), 1236 (2022).
  28. Alapatt, P., et al. Liver retinol transporter and receptor for serum retinol-binding protein (RBP4). J Biol Chem. 288 (2), 1250-1265 (2013).
  29. Radhakrishnan, R., et al. Mice lacking the systemic vitamin A receptor RBPR2 show decreased ocular retinoids and loss of visual function. Nutrients. 14 (12), 2371 (2022).
  30. Solanki, A. K., et al. A functional binding domain in the Rbpr2 receptor is required for vitamin A transport, ocular retinoid homeostasis, and photoreceptor cell survival in zebrafish. Cells. 9 (5), 1099 (2020).
  31. Radhakrishnan, R., Leung, M., Solanki, A. K., Lobo, G. P. Mapping of the extracellular RBP4 ligand binding domain on the RBPR2 receptor for vitamin A transport. Front Cell Dev Biol. 11 (11), 1105657 (2023).
  32. Ramkumar, S., et al. The vitamin A transporter STRA6 adjusts the stoichiometry of chromophore and opsins in visual pigment synthesis and recycling. Hum Mol Genet. 31 (4), 548-560 (2022).
  33. Tian, H., Sakmar, T. P., Huber, T. The energetics of chromophore binding in the visual photoreceptor rhodopsin. Biophys J. 113 (1), 60-72 (2017).
  34. Fan, J., Rohrer, B., Frederick, J. M., Baehr, W., Crouch, R. K. Rpe65-/- and Lrat-/- mice: comparable models of leber congenital amaurosis. Invest Ophthalmol Vis Sci. 49 (6), 2384-2389 (2008).
  35. Breen, C. J., et al. Production of functional human vitamin A transporter/RBP receptor (STRA6) for structure determination. PLoS One. 10 (3), e0122293 (2015).
  36. Kawaguchi, R., Zhong, M., Sun, H. Real-time analyses of retinol transport by the membrane receptor of plasma retinol binding protein. J Vis Exp. 28 (71), e50169 (2013).
  37. Shi, Y., Obert, E., Rahman, B., Rohrer, B., Lobo, G. P. The retinol binding protein receptor 2 (Rbpr2) is required for photoreceptor outer segment morphogenesis and visual function in zebrafish. Sci Rep. 7 (1), 16207 (2017).

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