레티닐리덴 단백질 생성에서 비타민 A 막 수용체 및 옵신 단백질과 리간드의 상호 작용을 연구하기 위한 방법론

요약

여기에서는 비타민 A 막 수용체와 광 수용체 옵신과 각각의 생리학적 리간드와 단백질-리간드 상호 작용을 연구하기 위한 두 가지 정량적 방법을 설명합니다.

초록

식이 비타민 A/전-트랜스 레티놀(ROL)이 몸 전체에 분포하는 것은 말초 조직에서 레티노이드 기능을 유지하고 시각 기능을 위한 레티닐리덴 단백질을 생성하는 데 중요합니다. RBP4-ROL은 혈액에 존재하는 레티놀 결합 단백질 4(RBP4)와 ROL의 복합체입니다. 간에서 레티놀 결합 단백질 4 수용체 2(RBPR2)와 눈에서 레티노산 6 레티놀(STRA6)에 의해 STimulated 된 두 개의 막 수용체는 순환계 RBP4와 결합하며 이 메커니즘은 ROL을 세포에 내재화하는 데 중요합니다. 수용체-리간드 동역학을 조사하는 방법을 확립하는 것은 레티노이드 항상성에 대한 비타민 A 수용체의 생리학적 기능을 이해하는 데 필수적입니다. SPR(Surface Plasmon Resonance) 분석을 사용하여 생리학적 리간드 RBP4와 함께 비타민 A 막 수용체의 결합 친화도 및 운동 매개변수를 분석할 수 있습니다.

이러한 방법론은 비타민 A 결핍의 병리학적 상태를 이해하는 데 중요한 RBPR2 및 STRA6의 RBP4 결합 모티프에 대한 새로운 구조 및 생화학적 정보를 밝힐 수 있습니다. 눈에서 내재화된 ROL은 광수용체의 옵신과 결합하여 레티닐리덴 단백질인 로돕신을 형성하는 시각적 발색단인 11-시스 레티날로 대사됩니다. 빛의 흡광도는 11-시스 레티널의 cis-to-trans 이성질체화를 일으켜 로돕신의 구조적 변화를 유도하고 그에 따른 광전달 캐스케이드의 활성화를 유발합니다. 혈청 및 안구 ROL의 농도 감소는 레티닐리덴 단백질 형성에 영향을 미칠 수 있으며, 이는 로돕신 국소화 오류, 아포단백 옵신 축적, 야맹증 및 광수용체 외부 분절 변성을 유발하여 색소성 망막염 또는 레베르 선천성 색소변증을 유발할 수 있습니다.

따라서 망막에서 G 단백질 결합 수용체 opsin-11-cis 망막 복합체를 정량화하기 위한 분광광도계 방법론은 위에서 언급한 병리학적 상태에서 망막 세포 변성의 메커니즘을 이해하는 데 중요합니다. 이러한 포괄적인 방법론을 통해 조사관은 인간의 시각 기능을 유지하는 데 중요한 광수용체에서 레티닐리덴 단백질 농도를 생성하고 유지하는 데 중요한 전신 및 안구 레티노이드 항상성을 유지하는 데 있어 식이 비타민 A 공급을 더 잘 평가할 수 있습니다.

서문

식이요법으로 얻은 비타민 A/all-trans 레티놀/ROL은 시각 기능에 중요한 역할을 하는 구성 요소입니다 ^1,2. 식이 비타민 A의 대사 산물인 발색단 11-시스 레티날은 G 단백질 결합 수용체(GPCR) 옵신에 결합하여 광수용체에서 레티닐리덴 단백질인 로돕신을 생성합니다. 빛이 눈에 내리쬐면 로돕신의 구성은 11-cis-retinal 구성 요소가 all-trans-retinal로 전환됨으로써 근본적인 변화를 겪습니다. 이 구성 변화는 간상 광수용체 내에서 광전달 캐스케이드를 유발하여 빛을 전기 신호로 변환하고, 이 신호는 시신경 3,4,5,6,7,8,9,10을 통해 뇌의 시각 피질로 전달됩니다

프로토콜

1. 표면 플라즈몬 공명(SPR) 방법론

1. 마우스 RBP4 단백질의 준비 및 정제
   1. 전장 마우스 RBP4(msRBP4) cDNA(NCBI 참조 서열: NM_001159487.1)를 생성하기 위한 프라이머를 설계합니다. msRBP4 cDNA를 pET28a His-tag 카나마이신 내성 발현 벡터로 클로닝하고 BL-21 DE3 세포에서 발현합니다(재료 표).
   2. BL-21 DE3 유능한 세포(제조업체의 프로토콜에 따름)를 ligated msRBP4-pET28a 벡터로 형질전환한 다음 Kanamycin 50μg/mL^30,37을 함유한 Luria-Bertani(LB) 브로스 한천 플레이트에 플레이트합니다. 인큐베이터에서 37°C에서 밤새 플레이트를 배양하고 다음 날 양성 콜로니를 스크리닝합니다.
   3. 단일 콜로니를 선택하고 카나마이신 50μg/mL를 함유한 LB 육수 5mL에서 37°C에서 밤새 배양합니다.
   4. 카나마이신 50μg/mL를 함유한 LB 육수 ....

토론

프로토콜의 중요한 단계
SPR 방법론
인실리코 모델링 및 도킹 분석: RBPR2(https://alphafold.ebi.ac.uk/entry/Q9DBN1) 및 STRA6의 예측된 구조와 msRBP4 PDB 데이터베이스(RSCB PDB ID: 2wqa)에 대해 알려진 구조를 도킹 연구^29,31에 사용해야 합니다. 또한 비타민 A 수용체(RBPR2 및 STRA6)에 대한 추정 결합 부위와 .......

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
2-D Quant Kit	Cytiva	80648356
Amine Coupling Kit	Cytiva	BR100050
Biacore evaluation software	Biacore S200	Version 1.1
Biacore Sensor chip CM5	Cytiva	BR100530
Bis tris propane	Sigma	B6755-25G	20 mM
BL21 DE3 competent cells	Thermo Scientific	EC0114
CD spectrophotometer	Jasco	J-815 Spectropolarimeter
Glycine HCL	Fisher Bioreagents	BP381-1
GraphPad Prism			Model fitting, data analysis
LB broth	Fisher Bioreagents	BP1426-500
n-dodecyl-β-d-maltoside (DDM)	EMD Millipore	324355-1GM	2-20 mM
pET28a His-tag Kanamycin-resistant expression vector	Addgene	69864-3
Plasmid purification kit	Qiagen	27106
Rho1D4 MagBeads	CubeBiotech	33299
Slide-A_Lyzer 10K dialysis cassette	Thermo Scientific	66810
Tween20	Fisher Bioreagents	BP337-500	0.05%
UV vis Spectrophotometer	Agilent	Cary 60 UV-Vis
Peptide name	Peptide sequence	HPLC-purity	Mass Spec
Mouse Rbpr2 (42)	HVRDKLDMFEDKLESYLTHM NETGTLTPIILQVKELISVTKG	92.14%	Conforms
Mouse Stra6 (40)	SVVPTVQKVRAGINTDVSYL LAGFGIVLSEDRQEVVELVK	90.84%	Conforms
Mouse Rbpr2 mutant S294A (42)	HVRDKLDMFEDKLEAYLTHM NETGTLTPIILQVKELISVTKG	0.92%	Conforms