مراقبة طويلة الأجل لمعدلات استهلاك الأكسجين في الثقافات الظهارية الصبغية الشبكية شديدة التمايز والاستقطاب

Qitao Zhang; Daisy Y. Shu; Richard A. Bryan; John Y. S. Han; Gillian A. Gulette; Kin Lo; Leo A. Kim; Jason M. L. Miller

doi:10.3791/67038

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

Summary

نقدم جهازا جديدا لقياس معدلات استهلاك الأكسجين (OCR) في الثقافات الظهارية الصبغية في شبكية العين (RPE). يمكن للجهاز قياس التعرف الضوئي على الحروف لأسابيع في كل مرة على RPE نمت على لوحات زراعة الخلايا القياسية مع الوسائط القياسية بينما تكون اللوحات في حاضنة زراعة الخلايا القياسية.

Abstract

يعد استقلاب الميتوكوندريا أمرا بالغ الأهمية للوظيفة الطبيعية لظهارة صبغة الشبكية (RPE) ، وهي طبقة أحادية من الخلايا في شبكية العين مهمة لبقاء المستقبلات الضوئية. يعد خلل الميتوكوندريا RPE سمة مميزة للتنكس البقعي المرتبط بالعمر (AMD) ، وهو السبب الرئيسي للعمى الذي لا رجعة فيه في العالم المتقدم ، واعتلال الشبكية الزجاجي التكاثري (PVR) ، وهو أحد المضاعفات المسببة للعمى لانفصال الشبكية. تم تصميم الظروف التنكسية RPE بشكل جيد من خلال أنظمة زراعة RPE المتباينة للغاية والاستقطاب لتقليد RPE في الجسم الحي . ومع ذلك ، فإن مراقبة معدلات استهلاك الأكسجين (OCR) ، وهي وكيل لوظيفة الميتوكوندريا ، كانت صعبة في أنظمة الاستزراع هذه لأن الظروف التي تعزز الاستقطاب والتمايز المثاليين RPE لا تسمح بقياسات OCR سهلة.

هنا ، نقدم نظاما جديدا ، Resipher ، لمراقبة التعرف الضوئي على الحروف لأسابيع في كل مرة في ثقافات RPE متباينة جيدا مع الحفاظ على RPE على ركائز النمو المثلى ووسائط الثقافة الفسيولوجية في حاضنة زراعة الخلايا القياسية. يحسب هذا النظام OCR عن طريق قياس تدرج تركيز الأكسجين الموجود في الوسائط فوق الخلايا. نناقش مزايا هذا النظام على الطرق الأخرى للكشف عن التعرف الضوئي على الحروف وكيفية إعداد نظام قياس التعرف الضوئي على الحروف في ثقافات RPE. نحن نغطي النصائح والحيل الرئيسية لاستخدام النظام ، والحذر بشأن تفسير البيانات ، وإرشادات لاستكشاف النتائج غير المتوقعة وإصلاحها.

نوفر أيضا آلة حاسبة عبر الإنترنت لاستقراء مستوى تجربة ثقافات نقص الأكسجة أو النورموكسيا أو فرط التأكسج RPE بناء على تدرج الأكسجين في الوسائط فوق الخلايا التي اكتشفها النظام. أخيرا ، نراجع تطبيقين للنظام ، قياس الحالة الأيضية لخلايا RPE في نموذج PVR وفهم كيفية تكيف RPE الأيضي مع نقص الأكسجة. نتوقع أن استخدام هذا النظام على ثقافات RPE شديدة الاستقطاب والتمايز سيعزز فهمنا لعملية التمثيل الغذائي للميتوكوندريا RPE في كل من الحالات الفسيولوجية والمرضية.

Introduction

ظهارة الشبكية الصبغية (RPE) هي طبقة أحادية من الخلايا الظهارية بعد الميتوتيكية وظيفيا وشديدة الاستقطاب والتي تشكل حاجزا بين المستقبلات الضوئية الحساسة للضوء في شبكية العين والدورة الدموية ، وهو سرير شعري يسمى المشيمة الشعرية. مثل دور الخلايا العصبية الداعمة للخلايا الدبقية ، يقوم RPE بوظائف لا تعد ولا تحصى لدعم المستقبلات الضوئية ، بما في ذلك البلعمة للأجزاء الخارجية للمستقبلات الضوئية ، ونقل العناصر الغذائية والدعم الأيضي للمستقبلات الضوئية ، وإفراز عوامل النمو الأساسية ، وكلها ضرورية للحفاظ على الوظيفة البصرية.

يكمن انحطاط RPE وراء العديد من الاضطرابات التنكسية الشائعة في الرؤية. في التنكس البقعي المرتبط بالعمر (AMD) ، وهو أحد الأسباب الأكثر شيوعا لفقدان البصر غير القابل للشفاء في العالم ، يموت RPE ، وبالتالي تعاني المستقبلات الضوئية العلوية من تنكس ثانوي. في اعتلال الشبكية الزجاجي التكاثري (PVR) ، يخرج RPE بدلا من ذلك من حالته الهادئة عادة بعد الانقسام ، ويتكاثر ويفوز إلى حالة اللحمة المتوسطة (ما يسمى بالانتقال الظهاري إلى اللحمة المتوسطة [EMT]) مع تغيرات في عملية التمثيل الغذائي. يؤدي عدم تمايز RPE إلى فقدان دعم RPE للمستقبلات الضوئية مع تحفيز حالة أكثر تليفية. ينتج عن هذا تنكس المستقبلات الضوئية والتندب الناجم عن RPE ، وكلاهما يؤدي إلى فقدان البصر ^1,2.

جزء كبير من دعم RPE للمستقبلات الضوئية هو التمثيل الغذائي ، وعدم التنظيم الأيضي هو عامل حاسم في العديد من أمراض الشبكية ، بما في ذلك AMD و PVR. يعمل RPE كحاجز تنظيمي بين المستقبلات الضوئية ومصدرها للأكسجين والمواد المغذية ، المشيمية. وبالتالي ، فإن ما يختاره RPE لاستقلاب مقابل ما يختار RPE المرور من المشيمية إلى المستقبلات الضوئية يحكم بقوة استقلاب المستقبلات الضوئية والبقاء على قيد الحياة. أظهرت العديد من الدراسات أن RPE يعتمد بشكل كبير على استقلاب الميتوكوندريا لصحته الطبيعية ، وأن المستقبلات الضوئية تعتمد بدلا من ذلك بشكل كبير على تحلل السكر³. وقد أدخل هذا مفهوم الحالات الأيضية التكميلية والمتشابكة بين المستقبلات الضوئية و RPE. على وجه التحديد ، يقلل RPE من عملية التمثيل الغذائي للركائز الأيضية المفضلة للمستقبلات الضوئية ويستخدم بدلا من ذلك المنتجات الثانوية لعملية التمثيل الغذائي للمستقبلات الضوئية جنبا إلى جنب مع المستقلبات التي لا تستهلكها المستقبلات الضوئية. في أمراض مثل PVR و AMD ، تشير الأدلة بقوة إلى أن RPE يصبح أكثر تحلل للسكر وأقل اعتمادا على استقلاب الميتوكوندريا. قد يؤدي هذا التحول نحو تحلل السكر RPE إلى تجويع المستقبلات الضوئية للمستقلبات التي يحتاجها ، مما يؤدي إلى تنكس⁴^،⁵^،⁶. بالنظر إلى مدى ترابط RPE واستقلاب المستقبلات الضوئية ومقدار الأيض المتغير الذي يكمن وراء مرض الشبكية ، هناك اهتمام قوي بنمذجة ومعالجة استقلاب RPE لأغراض علاجية.

في حين أن دراسة استقلاب الميتوكوندريا RPE في الجسم الحي مثالية ، لا يمكن فحص العديد من جوانب استقلاب الميتوكوندريا RPE عمليا إلا في نظام الثقافة في المختبر. تم إحراز تقدم كبير نحو ثقافات RPE عالية الدقة في العقود العديدة الماضية ، لدرجة أن ثقافات RPE الأكثر عناية يتم استخدامها الآن للعلاج باستبدال الخلايا في التجارب السريرية البشرية⁷. للحفاظ على مثل هذه الثقافات عالية الدقة ، يجب أن تنمو RPE على ركائز معينة في وسائط معينة لعدة أشهر قبل التجريب. مع هذه الظروف ، يتم تمييز ثقافات RPE واستقطابها إلى أقصى حد ، وتقترب في RPE في الجسم الحي. لسوء الحظ ، لا توجد معدات متاحة حاليا يمكنها قياس استقلاب الميتوكوندريا على وجه التحديد من RPE في الجسم الحي. في حين تم تحقيق مراقبة الأكسجين لشبكة الشعيرات الدموية في شبكية العين في الجسم الحي باستخدام قياس التأكسج^{بالرنين} المغنطيسي الإلكتروني (EPR) 8 ، فإن هذا غير ممكن لتحليل RPE. لم يتم وصف الاختلافات بين استقلاب RPE في الجسم الحي وفي المختبر بشكل جيد ، ولكن ثبت أن ثقافات RPE لها نشاط ميتوكوندريا مرتفع ، على غرار RPE في الجسم الحي ^3,9 ، مما يشير إلى أنه يمكن الحصول على نظرة ثاقبة مهمة في استقلاب RPE للميتوكوندريا باستخدام ثقافات RPE عالية الدقة.

نظرا لأن جميع عمليات التمثيل الغذائي للميتوكوندريا تؤدي إلى استهلاك الأكسجين ، فإن قياس معدلات استهلاك الأكسجين RPE (OCR) هو وكيل مخلص لعملية التمثيل الغذائي للميتوكوندريا. كان قياس التعرف الضوئي على الحروف في ثقافات RPE أمرا صعبا ، حيث أن الظروف التي تعزز أقصى استقطاب وتمايز RPE غالبا ما تمنع قياسات OCR الدقيقة على المدى الطويل باستخدام التقنيات المتاحة حاليا ، مثل محلل فرس البحر. في ورقة الأساليب هذه ، يتم تقديم جهاز جديد ، يسمى Resipher (يشار إليه فيما يلي باسم "النظام") ، والذي يسمح بالقياس المستمر ل OCR على مدار أسابيع في RPE نمت في ظل ظروف تعزز الاستقطاب والتمايز إلى أقصى حد. إن السهولة التي يمكن بها قياس التعرف الضوئي على الحروف بواسطة هذا النظام في ظروف ثقافة RPE التي تعزز إلى أقصى حد تمايز RPE والاستقطاب فريدة من نوعها بين أجهزة قياس التعرف الضوئي على الحروف الحالية.

تقدم هذه الورقة نصائح وحيل لاستخدام النظام مع ثقافات RPE ، متبوعة بعرض توضيحي لتطبيقين معينين. أولا ، يتم تشغيل RPE EMT ، الذي يحاكي PVR ، من خلال التعرض لتحويل عامل النمو بيتا (TGFβ) ¹^،¹⁰^،¹¹^،¹². يستخدم النظام لمراقبة كيفية تطور استقلاب RPE أثناء عملية EMT. ثانيا ، يتم استكشاف دور نقص الأكسجة في استقلاب RPE باستخدام هذا النظام. نقص الأكسجة هو مساهم مهم في التسبب في AMD ، حيث تضعف المشيمية مع سن^13,14. الجمع بين هذا النظام مع غرف نقص الأكسجة يسمح للمرء بنمذجة التمثيل الغذائي للميتوكوندريا RPE المتغير مع نقص الأكسجة الخفي الذي يصاحب الشيخوخة. أخيرا ، يتم تقديم آلة حاسبة عبر الإنترنت باستخدام بيانات Resipher للسماح للشخص بتحديد ما إذا كانت ثقافات RPE في ظروف نقص الأكسجين أو النورموكسيك أو فرط التأكسج. هذه المعلومات ضرورية لاستخلاص أي استنتاجات حول استقلاب RPE من دراسات ثقافة RPE في المختبر.

Protocol

للاطلاع على بروتوكولات إنشاء ثقافات بشرية أولية أو iPSC-RPE ، راجع المراجع التالية¹⁵^،¹⁶^،¹⁷^،¹⁸. تمت مراجعة اقتناء واستخدام الأنسجة البشرية لهذه البروتوكولات والسماح بها من قبل مجلس المراجعة المؤسسية بجامعة ميشيغان (HUM00105486).

1. التطبيق العام للنظام على ثقافة RPE

صفيحة الخلايا الجذعية متعددة القدرات المستحثة بالإنسان (iPSC) المشتقة من RPE أو خلايا RPE البشرية الأولية في لوحات 96 بئرا متوافقة مع النظام.
1. بافتراض وجود مزارع ناضجة موجودة بالفعل نمت على ألواح زراعة خلايا 24 بئرا ، اغسل الخلايا بمحلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS) مرة واحدة ثم أضف 500 ميكرولتر من 0.25٪ trypsin-EDTA (جدول المواد). احتضان لمدة 10-40 دقيقة في حاضنة زراعة الخلايا ، والتحقق كل 5-10 دقائق حتى يتم تقريب الخلايا وجاهزة تقريبا للانفصال.
2. قم بتدوير وسائط الماصة برفق فوق الخلايا لفصلها عن بلاستيك زراعة الخلايا ، متبوعا بالنقل إلى حجم 3x من وسائط زراعة الخلايا (1500 ميكرولتر لكل 24 بئرا) ، وتدور لأسفل في جهاز طرد مركزي عند 250 × جم لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
  ملاحظة: وصفة وسائط زراعة الخلايا RPE مفصلة في الجدول 1 ومتاحة في المراجع المنشورة سابقا⁹^،¹⁵^،¹⁶^،¹⁷^،¹⁸.
3. أعد تعليق الخلايا في وسائط زراعة الخلايا RPE باستخدام مصل بقري جنيني بنسبة 15٪ (FBS) وعد الخلايا باستخدام مقياس الدم.
4. بذر 74000 خلية لكل بئر من صفيحة 96 بئرا (بشكل عام 225-300 × 10⁵ خلايا / سم²) ، بعد الطلاء بركائز طلاء مصفوفة خارج الخلية عالية التخصص (جدول المواد) باتباع تعليمات الشركة المصنعة.
  ملاحظة: خلايا البذور فقط على لوحة متوافقة مع Resipher (جدول المواد) وفقط في الآبار المقابلة لمصفوفة المسبار على غطاء الاستشعار (الأعمدة 3 و 4 و 9 و 10 للغطاء المكون من 32 قناة ؛ انظر جدول المواد). يتوفر غطاء استشعار النظام مع مستشعرات ذات 4 أو 32 أو 96 قناة (انظر مواقع المستشعر في الشكل 1A-D) ، ومجموعة من لوحات زراعة الخلايا القياسية متوافقة.
5. نظرا لأن آبار الحافة عرضة للتبخر ، مما يؤثر بشكل كبير على توافر الأكسجين ، وبالتالي ، قراءات OCR ، تجنب خلايا البذر في جميع آبار الحافة (الصفان A و H من لوحة 96 بئرا). علاوة على ذلك ، أضف 200 ميكرولتر من الماء المعقم في كل من الآبار الفارغة للوحة 96 بئرا لتقليل آثار التبخر.
6. احتفظ باللوحة على سطح طاولة ثابت لمدة 10 دقائق للسماح للخلايا بالاستقرار ؛ ثم أعده إلى الحاضنة. قم بتغيير الوسائط بعد 24-72 ساعة ، مع استبدال وسائط ثقافة RPE القياسية بنسبة 5٪ FBS. الثقافة لمدة 4 أسابيع على الأقل ، وتغيير الوسائط 2x في الأسبوع.
  ملاحظة: تكون الخلايا جاهزة للتجربة عندما تكون مصطبغة ومرصوفة بالحصى ومضغوطة للغاية (الشكل 1E).
إعداد البيانات والحصول عليها باستخدام النظام
1. ضع غطاء الاستشعار على لوحة استقبال فارغة ذات 96 بئرا ثم ضعها مرة أخرى في حاضنة زراعة الخلايا. قم بمحاذاة الجهاز وتركيبه على غطاء الاستشعار وقم بتوصيله بلوحة التحكم عبر كبل USB المرفق. هذا يخلق "شطيرة" ريسيفر. (الشكل 2 أ).
2. انتقل إلى تطبيق موقع مختبر Lucid (https://lab.lucidsci.com/) وانقر فوق الزر تجربة جديدة في الزاوية العلوية اليمنى لإنشاء تجربة جديدة.
3. قم بتسمية عنوان التجربة وأدخل أي ملاحظات تجريبية ذات صلة للدراسة المعينة (على سبيل المثال ، رقم مرور iPSC-RPE الذي يستخدمه المرء).
4. خلق ظروف جيدة ومجموعات العلاج. على سبيل المثال ، في حالة اختبار تأثيرات تركيزات المصل المختلفة في الوسائط على OCR ، حدد المصل في اسم المجموعة ، ثم أدخل تركيزات مصل الوسائط المراد استخدامها ، مع إضافة المزيد من قيم النسبة المئوية للمصل بالنقر فوق الزر +. قم بتعيين الآبار التي ستحصل على نسبة مصل معينة وحدد نمط لون لتلك الآبار. أضف المزيد من المجموعات (على سبيل المثال ، متغير تجريبي مختلف للاختبار) حسب الحاجة بالنقر فوق الزر "إضافة مجموعة".
5. حدد إعداد اللوحة وحدد الجهاز المقابل ونمط اللوحة. انقر فوق زر إضافة لوحة واختر الجهاز ؛ حدد نوع اللوحة. حدد العلاج وانقر على البئر المقابلة.
6. انقر فوق الزر ابدأ الآن لبدء التجربة. تحقق من أن المؤشر الموجود على موقع الويب ومؤشر LED على لوحة التحكم باللون الأخضر الثابت.
7. اسمح للنظام بالعمل لمدة 15-60 دقيقة لضمان معايرة كل مستشعر بشكل صحيح واكتشاف الأكسجين الجوي بدقة ، والذي يجب أن يكون بتركيز ~ 200 ميكرومتر في حاضنة زراعة خلايا مرطبة بالكامل مع 5٪ CO₂ (الشكل 2Bi).
  ملاحظة: إذا كان أي من المستشعرات أقل من 20٪ من متوسط المستشعرات الأخرى في إعداد حاضنة زراعة الخلايا القياسي ، ففكر في استبعاد ذلك جيدا في تحليل البيانات ، لأن المستشعر معيب (الشكل 2Bii).
  ملاحظة: إذا كانت جميع المستشعرات أكثر من 20٪ من متوسط أجهزة الاستشعار الأخرى ومن الغلاف الجوي المتوقع O₂ المبلغ عنه على أنه 200 ميكرومتر في إعداد حاضنة زراعة الخلايا القياسية ، فقد تم استخدام غطاء الاستشعار عدة مرات ؛ استبدله بغطاء استشعار جديد (الشكل 2Biii).
  ملاحظة: يؤدي الحصول على قراءات O₂ في الهواء قبل بدء التجربة إلى تحسين استكشاف الأخطاء وإصلاحها بشكل كبير بعد ذلك. إذا ظهر بئر معين كقيمة شاذة بعد إجراء التجربة وكان هذا البئر يحتوي على مستشعر خارج المعايرة ، فقد تكون المشكلة في المستشعر ، وليس النسخ البيولوجي المتماثل.
8. قم بإزالة الجهاز من غطاء الاستشعار (ولكن لا تفصل كبل USB عن الجهاز). ضع الجهاز رأسا على عقب في الحاضنة للسماح بإعادة ضبط المحرك الموجود على الجهاز. لا تقم بإعادة استخدام الجهاز حتى تتوقف جميع أصوات المحرك (حوالي 20-30 ثانية).
  ملاحظة: من المهم إبقاء الجهاز متصلا بلوحة التحكم عبر كبل USB في جميع الأوقات أثناء التجربة، حتى عندما يكون الجهاز خارج غطاء الاستشعار. يسمح ذلك للجهاز بالمراقبة المستمرة والإبلاغ عن بيئة حاضنة زراعة الخلايا.
9. ضع اللوحة مع غطاء الاستشعار مرة أخرى في غطاء زراعة الخلية ، جنبا إلى جنب مع لوحة 96 بئرا تحتوي على مزارع RPE. قم بتغيير الوسائط في اللوحة باستخدام ثقافات RPE بنفس الوسائط ونفس الحجم لجميع الآبار للحصول على قيم OCR الأساسية لكل بئر. تأكد من ملء جميع الآبار بدون RPE بالماء المعقم للمساعدة في منع التبخر.
  ملاحظة: بشكل عام، نوصي باستخدام 60-100 ميكرولتر من وسائط زراعة RPE لكل 96 بئرا، استنادا إلى البيانات التي توضح أن انخفاض أحجام الوسائط يؤدي إلى استنفاد سريع للمغذيات ولكن أحجام الوسائط الأعلى تؤدي إلى نقص الأكسجة غير المقصود⁹.
10. انقل غطاء الاستشعار إلى اللوحة التي تحتوي على مزارع الخلايا والغطاء القياسي (غير Resipher) على اللوحة التي تحتوي على مزارع الخلايا إلى لوحة الاستقبال الفارغة المكونة من 96 بئرا للحفاظ على عقم الغطاء القياسي ، والذي سيكون مطلوبا في نقاط مختلفة أثناء التجريب.
11. ضع اللوحة مع مزارع الخلايا وغطاء الاستشعار مرة أخرى في حاضنة زراعة الخلايا. مرة أخرى ، قم بمحاذاة الجهاز وتركيبه على غطاء الاستشعار وقم بتوصيله بلوحة التحكم عبر كبل USB المرفق (تجميع "الساندويتش"). تحقق من أن المؤشرات الموجودة على واجهة موقع الويب والمركز كلها خضراء خالصة.
  ملاحظة: ستظهر بيانات تركيز O₂ على الفور ، بينما لن تظهر بيانات OCR إلا بعد جمع بيانات O₂ كافية ، حوالي 1 ساعة.
12. دع الجهاز يقيس OCR على كل بئر لمدة 12-24 ساعة على الأقل لالتقاط OCR أساسي.
  ملاحظة: سيختلف التعرف الضوئي على الحروف الأساسي وفقا للعديد من العوامل، بما في ذلك نوع الوسائط التي يتم تطبيقها على الخلايا. في الشكل 2C ، تحتوي وسائط ثقافة RPE القياسية بكميات مختلفة من FBS (0٪ ، 5٪ ، 15٪) على قيم OCR مختلفة قليلا. علاوة على ذلك ، يمكن للمزارع التي تحتوي على المزيد من FBS الحفاظ على نشاط الميتوكوندريا لفترة أطول بعد تطبيق الوسائط على الخلايا قبل انخفاض OCR بسبب استنفاد مستقلبات الميتوكوندريا (الجانب الأيمن من المنحنى).
13. بمجرد الحصول على OCR الأساسي ، كرر الخطوات 1.2.8-1.2.12 ، ولكن قم بتغيير الوسائط الموجودة على اللوحة باستخدام ثقافات RPE إلى الظروف التجريبية للفرد (عادة ، ± دواء أو مقارنة بين ظروف الوسائط المختلفة).
  ملاحظة: يمكن أيضا التعامل مع التغييرات الروتينية للوسائط بنفس الطريقة. في أي وقت يتم فيه فتح حاضنة زراعة الخلايا ، توقع اضطرابا كبيرا في قراءات التعرف الضوئي على الحروف ، لأنها تعتمد على درجة الحرارة والرطوبة وتركيزات CO₂ وعوامل أخرى تتعطل جميعها مؤقتا مع فتح باب الحاضنة. أثناء أي إزالة للجهاز من غطاء الاستشعار ، ليست هناك حاجة لإيقاف التجربة مؤقتا عبر الإنترنت. بعد فتح باب حاضنة زراعة الخلايا أو تغيير الوسائط على اللوحة التي يتم فحصها ، سيستغرق الأمر عموما 2-4 ساعات لإعادة إنشاء تدرج الأكسجين والبدء في قياس OCR دقيق.
14. بعد الحصول على البيانات ، اطرح خط الأساس OCR لكل بئر من OCR بعد تطبيق الحالة التجريبية ، لتحديد Delta OCR الناجم عن العلاج.
15. بعد اكتمال التجربة ، قم بتعقيم وإعادة استخدام غطاء الاستشعار (والذي يمكن إعادة استخدامه 3-5x ، على الرغم من أن الأداء يتدهور مع الاستخدام المتكرر). لتعقيم غطاء الاستشعار ، اغمر الغطاء بالكامل في 70٪ من الإيثانول لمدة 10 دقائق في غطاء زراعة الخلايا ، ثم أخرجه من الغمر واستريح في جانب مسبار الخزانة لأعلى (تجنب لمس أطراف المسبار الحساسة) ، واترك الإيثانول والماء يتبخران تماما قبل وضع غطاء الاستشعار على لوحة استقبال جديدة ذات 96 بئرا.
التقط صور برايتفيلد لتطبيع قيم OCR إلى رقم الخلية.
ملاحظة: يسهل تراكم الميلانين في RPE تطبيع التعرف الضوئي على الحروف بناء على عدد بسيط من أعداد الخلايا في المزارع الحية باستخدام مجهر برايت فيلد.
1. قم بإزالة الجهاز ووضعه رأسا على عقب ، كما في الخطوة 1.2.8. في غطاء زراعة الخلايا ، قم بتبديل غطاء الاستشعار الموجود على لوحة زراعة RPE بغطاء قياسي من 96 بئرا.
2. باستخدام مجهر مقلوب قياسي ، التقط صورا برايت فيلد لكل بئر.
  ملاحظة: حافظ على تناسق صور المنطقة بين الآبار (الموقع النسبي في البئر والتكبير الموضوعي).
3. في غطاء زراعة الخلايا ، استبدل الغطاء القياسي المكون من 96 بئرا على لوحة زراعة RPE بغطاء الاستشعار وضعه مرة أخرى في الحاضنة لمزيد من المراقبة.
4. احسب رقم الخلية في كل بئر باستخدام ImageJ أو برامج أخرى.
5. تطبيع OCR إلى رقم الخلية في المجموعات التجريبية المختلفة. يبلغ النظام عن التعرف الضوئي على الحروف بوحدات fmol∙ (mm²) ^-1∙^s-1- الاستهلاك لكل وحدة وحدة مقطع عرضي. لذلك ، لتطبيع OCR لكل خلية ، قسم OCR على عدد الخلايا لكل مم² (بدلا من عدد الخلايا لكل بئر). وبالمثل ، اضرب OCR الذي أبلغ عنه النظام في مساحة المقطع العرضي للبئر (حوالي 31 مم² للوحة 96 بئرا قياسية) لإنتاج OCR بوحدات fmol∙^s-1∙^well-1.
ضوابط لتحديد معلمات الطاقة الحيوية RPE.
ملاحظة: للتأكد من أن النظام وثقافات RPE تستجيب للتلاعب بالميتوكوندريا بطرق يمكن التنبؤ بها ، يمكن للمرء اختبار بعض الجزيئات الصغيرة الراسخة لاستهداف خطوات معينة من الفسفرة التأكسدية للميتوكوندريا. هذه الاختبارات مماثلة للخطوات التي يتم إجراؤها في اختبار إجهاد الميتوكوندريا باستخدام محلل فرس البحر¹⁰ وتوفر ملف تعريف للطاقة الحيوية لثقافات RPE.
1. خلايا RPE الثقافية في 65 ميكرولتر من وسائط ثقافة RPE القياسية مع 5٪ FBS وقياس OCR لمدة 24 ساعة لإنشاء خط أساس.
2. نضح الوسائط المستزرعة وأضف 65 ميكرولتر من وسائط زراعة RPE القياسية مع 5٪ FBS ومع مفككات الميتوكوندريا (3 ميكرومتر كربونيل السيانيد-p-ثلاثي فلورو روميثوكسي فينيل هيدرازون [FCCP] أو 500 نانومتر Bam15 ، جدول المواد). احتضان بين عشية وضحاها.
  ملاحظة: يجب أن تزيد أجهزة فك التوصيل الميتوكوندريا بشكل كبير من التعرف الضوئي على الحروف. تأكد من أن OCR المتزايد ليس عند أو بالقرب من الحد الأقصى النظري للانتشار محدود OCR البالغ حوالي 275 fmol∙ (mm²) ^-1∙^s-1 ل 65 ميكرولتر من الوسائط في ظروف الاستزراع القياسية. يتوفر الحد الأقصى OCR لوحدات تخزين الوسائط المختلفة شائعة الاستخدام في قسم المناقشة.
3. بعد الحضانة الليلية ، قم بشفط الوسائط باستخدام أجهزة فك اقتران الميتوكوندريا واستبدلها ب 65 ميكرولتر من وسائط زراعة RPE القياسية بنسبة 5٪ FBS. راقب اللوحة لمدة 24 ساعة أخرى لتحديد استرداد RPE OCR بعد إزالة الأدوية.
4. احسب تأثيرات أجهزة فك التوصيل على OCR عن طريق طرح OCR الذي تم الحصول عليه بعد العلاج من OCR الذي تم الحصول عليه قبل العلاج (الشكل 3).
  ملاحظة: تشير الزيادة في التعرف الضوئي على الحروف مع إضافة أجهزة فك ارتباط الميتوكوندريا إلى القدرة التنفسية الاحتياطية للميتوكوندريا للخلية¹⁹.
5. لقياس معلمات الميتوكوندريا الأخرى التي يتم التقاطها عادة أثناء اختبار إجهاد الميتوكوندريا باستخدام محلل فرس البحر ، قم بتنفيذ نفس الخطوات المذكورة أعلاه باستخدام المركبات التالية (الشكل 4).
  1. استخدم أوليغومايسين عند 1 ميكرومتر لتقييم التنفس المرتبط بالأدينوسين الثلاثي الفوسفات (ATP).
  2. استخدم مضاد الميسين A والروتينون عند 1 ميكرومتر لتقييم أي تنفس غير ميتوكوندريا.
    ملاحظة: FCCP ، oligomycin ، antimycin A ، والروتينون يمكن أن تكون سامة ل RPE. إذا تسببت في موت الخلايا بشكل كبير ، فلن تكون قياسات التعرف الضوئي على الحروف دقيقة. وبالتالي ، يجب الحصول على قياسات التعرف الضوئي على الحروف فقط في نقطة زمنية لا يوجد فيها موت واضح للخلايا ، بشكل عام خلال الساعات العديدة الأولى بعد إضافة الأدوية (الشكل 4).

2. قياس التغيرات في استقلاب الميتوكوندريا في RPE يخضع ل EMT

اتبع نفس البروتوكول كما هو موضح في القسم 1.2.
للحث على EMT بعد الحصول على قياسات OCR الأساسية ، أضف TGF-β2 (10 نانوغرام / مل) إلى ثقافات RPE وراقب OCR على مدار 3 أسابيع. قم بتحديث الوسائط باستخدام TGFβ2 جديد كل 2-3 أيام (الشكل 5).
على الأقل 2x في الأسبوع ، احصل على صور برايتفيلد كما في القسم 1.3 للتأكد من أن عدد الخلايا لا يتغير. إذا تغير العدد ، فقم بتطبيع قيم OCR إلى رقم الخلية في كل بئر.
ملاحظة: يمكن استخدام نفس البروتوكول لمحفزات أخرى من EMT لمراقبة تغيرات التعرف الضوئي على الحروف على المدى الطويل طوال فترة المزرعة أثناء وجود الخلايا في الحاضنة.

3. قياس التغيرات في استقلاب الميتوكوندريا في RPE نقص الأكسجين

ملاحظة: تطبيق النظام في ظل ظروف نقص الأكسجين أو المعيارية أو فرط التأكسج هو نفسه القسم 1.2 ، باستثناء الاحتفاظ ب "الساندويتش" في غرفة نقص الأكسجة (جدول المواد) الموضوعة في حاضنة زراعة الخلايا القياسية.

احفر ثقبا على غطاء غرفة نقص الأكسجة لتركيب كابل USB من النوع c وختمه بالسيليكون أو المعجون (الشكل 6 أ).
قم بتجميع غطاء الاستشعار مع لوحة زراعة الخلايا في الغطاء ونقلها إلى غرفة نقص الأكسجة.
قم بإعداد "الساندويتش" (اللوحة ، غطاء الاستشعار ، الجهاز) في غرفة نقص الأكسجة. ضع أيضا في غرفة نقص الأكسجة طبق بتري بالماء المعقم للمساعدة في الحفاظ على الرطوبة. أخيرا ، ضع مستشعر O₂ محمول في غرفة نقص الأكسجة (جدول المواد). يتم عرض الإعداد في الشكل 6A.
أغلق الحجرة وقم بتوصيلها بأسطوانة غاز بتركيز نقص الأكسجين من O₂ وتركيز زراعة الخلايا القياسي لثاني أكسيد_{الكربون (على} سبيل المثال ، 1٪ O₂و 5٪ CO₂).
استبدل الهواء ببطء في غرفة نقص الأكسجة_{مع هواء CO} 2 بنسبة 1٪ O₂/5٪ في الأسطوانة حتى يظهر مستشعر الأكسجين تركيز O₂ المطلوب ، عادة في مكان ما بين 1٪ و 10٪.
ملاحظة: يتطلب مستشعر O₂ المحمول وقتا للتوازن ، لذلك يجب إضافة الغاز من الأسطوانة إلى غرفة نقص الأكسجة ببطء.
أغلق صمامات مدخل ومخرج غرفة نقص الأكسجة وانقل الغرفة بأكملها إلى الحاضنة.
قم بإعداد التجربة وبدء تشغيلها كما في القسم 1.2.
ملاحظة: يمكن أن تؤدي وسائط التوازن المسبق في غرفة نقص الأكسجة قبل إضافتها إلى الخلايا إلى تقليل الوقت الذي تستغرقه الطبقة الأحادية للخلية لتجربة نقص الأكسجة الحقيقي (الشكل 6 ب).

4. حساب تركيز O₂ في طبقة RPE الأحادية لتحديد ما إذا كانت الخلايا في ظروف نقص الأكسجين أو النورموكسيك أو فرط التأكسج

ملاحظة: يقيس النظام تركيز O₂ بين حوالي 1 إلى 1.5 مم فوق قاع البئر افتراضيا بافتراض استخدام لوحة قياسية مع غطاء الاستشعار الموصى به المقابل للزراعة أحادية الطبقة (راجع https://lucidsci.com/docs/LucidScientific_Sensing_Lid_Selection_Guide.pdf). في حين أن تركيز O₂ في الطبقة الأحادية للخلية لا يتم قياسه مباشرة ، يمكن استخدام البيانات من النظام لتقدير تركيز O₂ على مستوى RPE. على وجه التحديد ، مع العلم بوجود تدرج أكسجين بين الجزء العلوي من عمود الوسائط ، حيث يتوفر O₂ ، وأسفل عمود الوسائط ، حيث يتم استهلاك O₂ ، يمكن دمج قوانين انتشار Fick مع معدل OCR المقاس لاستقراء مستويات O₂ في الطبقة الأحادية للخلية. يتم توفير آلة حاسبة لهذا التقدير عبر الإنترنت: https://lucidsci.com/notes?entry=oxygen_diffusion (وفي شكل دفتر ملاحظات تفاعلي مفتوح المصدر في https://observablehq.com/@lucid/oxygen-diffusion-and-flux-in-cell-culture ، يمكن العثور على الكود المصدري لهذه الآلة الحاسبة في https://github.com/lucidsci/oxygen-diffusion-calculator).

بمجرد الوصول إلى الآلة الحاسبة ، أدخل حجم الوسائط بالميكرولتر (على سبيل المثال ، 100 ميكرولتر).
أدخل تركيز الأكسجين المشبع في واجهة الهواء السائل (الجزء العلوي من عمود الوسائط أعلى الخلايا). هذه القيمة هي ~ 185 ميكرومتر عند الضغط الجوي القياسي مع رطوبة 5٪ O₂ و 95٪.
ملاحظة: يمكن أيضا تحديد ذلك من قياسات O₂ بواسطة مجسات النظام في آبار الوسائط فقط (مع عدم وجود خلايا في قاع البئر).
في إدخال Flux ، أدخل Flux / OCR الذي أبلغ عنه النظام.
بناء على هذه القيم ، يتم حساب تركيز الأكسجين في الحالة المستقرة عند كل ارتفاع في عمود الوسائط ويظهر في الرسم (الشكل 7). المحور السيني للمؤامرة هو الارتفاع بالملليمتر فوق قاع البئر. المحور ص هو تركيز O₂ المحسوب عند هذا الارتفاع (بالميكرومتر).
يتم الإبلاغ عن تركيز O₂ في قاع البئر (حيث توجد الخلايا) في السطر الموجود أسفل قطعة الأرض.
ملاحظة: بشكل عام ، تشير التقديرات إلى أن RPE في الجسم الحي يرى تركيز O₂ بنسبة 4-9٪. كل 10 ميكرومتر من O₂ في الظروف الجوية القياسية يتوافق مع حوالي 1٪ O₂. وبالتالي ، فإن normoxia على مستوى الخلايا حوالي 40-90 ميكرومتر من O₂. كلما ارتفع عمود الوسائط ، انخفض O₂ عند مستوى الطبقة الأحادية^{RPE 9}. وبالتالي ، إذا بدت الخلايا في ظروف نقص الأكسجين ، فيمكن تقليل حجم الوسائط. إذا بدت الخلايا في ظروف فرط التأكسج ، فيمكن زيادة حجم الوسائط.

النتائج

يوضح الشكل 2 أ إعداد "الساندويتش" لتجربة Resipher. توجد أغطية استشعار مع 32 مجسا تقابل الأعمدة 3 و 4 و 9 و 10 على لوحة 96 بئرا بين لوحة الخلية والجهاز. بعد الاتصال بلوحة التحكم ، يقوم الجهاز بتنشيط المحركات لتحريك غطاء الاستشعار لأعلى ولأسفل ، وقياس تركيز O₂ في عمود الوسائط على نط...

Discussion

يلعب استقلاب الميتوكوندريا في RPE دورا مهما في التسبب في أمراض الشبكية الشائعة المسببة للعمى ، بما في ذلك AMD و PVR. تسمح نمذجة استقلاب الميتوكوندريا RPE في المختبر للمرء بعزل حالته الأيضية عن تلك الموجودة في الأنسجة المحيطة ، إلى جانب تعريض الأنسجة لإهانات مختلفة تحاكي المرض بطريقة خاضعة ...

Disclosures

ريتشارد أ. بريان وكين لو موظفان في Lucid Scientific ، التي تصنع نظام Resipher.

Acknowledgements

نشكر الدكتور دانيال هاس وجيم هيرلي على فكرة اختبار قابلية ذوبان O₂ في الوسائط الجديدة مقابل الوسائط المشروطة كعنصر تحكم. نشكر الدكتور ماغالي سانت جينييز على مساهمته التحريرية في المخطوطة. نشكر سكوت سزالاي في مركز الأدوات والخدمات الإلكترونية ، مركز كيلوغ للعيون ، على تعديل غرفة نقص الأكسجة بكابل Resipher USB. لم يتم استخدام أي أموال فيدرالية لأبحاث HFT. يتم دعم نواة الخدمات الإلكترونية من قبل P30 EY007003 من المعهد الوطني للعيون. يتم دعم هذا العمل من خلال منحة إدارية غير مقيدة من أبحاث الوقاية من العمى (RPB). يتم دعم J.M.L.M. من قبل مبادرة جيمس جروسفيلد للتنكس البقعي المرتبط بالعمر الجاف ، ومؤسسة E. Matilda Ziegler للمكفوفين ، ومنحة بنك العيون Eversight ، ومنحة K08EY033420 من المعهد الوطني للعيون ، ودعم من Dee و Dickson Brown بالإضافة إلى مؤسسة David and Lisa Drews لاكتشاف الأمل. يتم دعم D.Y.S. من قبل برنامج العلوم بجامعة نيو ساوث ويلز. يتم دعم L.A.K. من قبل جائزة Iraty ، و Monte J. Wallace ، و Michel Plantevin ، ومنحة R01EY027739 من المعهد الوطني للعيون ، ونشاط اكتساب البحوث الطبية للجيش التابع لوزارة الدفاع VR220059.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.25% Trypsin-EDTA	Gibco	#25-200-056
3,3',5-triiodo-L-thyronine sodium salt	Sigma	T5516
32-channel Resipher lid	Lucid Scientific	NS32-101A for Falcon
Antimycin A from streptomyces sp.	Sigma	A8674-25MG	Inhibitor of Complex III of the electron transport chain
BAM15	Sigma	SML1760-5MG	Uncoupling agent to increase mitochondrial respiration
DMSO, cell culture grade	Sigma-aldrich	D4540-100ML	Vehicle for reconstituting mitochondrial drugs
Extracellular matrix coating substrates: Synthemax II-SC	Corning	#3535	Extracellular matrix for hfRPE
Extracellular matrix coating substrates: Vitronectin	Gibco	A14700	Extracellular matrix for iPSC-RPE
FCCP	Sigma	C2920-10MG	Uncoupling agent to increase mitochondrial respiration
Fetal Bovine Serum (Bio-Techne S11550H)	Bio-Techne	S11550H
Hydrocortisone-Cyclodextrin	Sigma	H0396
Hypoxia chamber	Embrient Inc.	MIC-101
N1 Media Supplement	Sigma	N6530
Non-Essential Amino Acids Solution	Gibco	11140050
O2 sensor	Sensit technology or Forensics Detectors	P100 or FD-90A-O2
Penicillin-Streptomycin	Gibco	15140-122
Recombinant human TGFβ2	Peprotech	100-35B	Transforming growth factor beta-2 to induce epithelial-mesenchymal transition
Rotenone	Sigma	R8875-1G	Inhibitor of Complex I of the electron transport chain
System-compatible plate	Corning	#353072
Taurine	Sigma	T8691
αMEM (Alpha Modification of Eagle's Media)	Corning	15-012-CV

References

Shu, D. Y., Butcher, E., Saint-Geniez, M. EMT and EndMT: emerging roles in age-related macular degeneration. Int J Mol Sci. 21 (12), 4271 (2020).
Shu, D. Y., Lovicu, F. J. Myofibroblast transdifferentiation: the dark force in ocular wound healing and fibrosis. Prog Retin Eye Res. 60, 44-65 (2017).
Hurley, J. B. Retina metabolism and metabolism in the pigmented epithelium: a busy intersection. Annu Rev Vis Sci. 7, 665-692 (2021).
Wu, W., et al. Deficient RPE mitochondria energetics leads to subretinal fibrosis in age-related macular degeneration. Invest Ophthalmol Vis Sci. 64 (8), 2420 (2023).
Hansman, D. S., et al. Metabolic reprogramming of the retinal pigment epithelium by cytokines associated with age-related macular degeneration. Biosci Rep. 44 (4), BSR20231904BSR20231904 (2024).
Li, K. X., et al. Modulation of pyruvate kinase M2 activity as a therapy in a primary RPE cell culture model of proliferative vitreoretinopathy. Invest Ophthalmol Vis Sci. 62 (8), 2213 (2021).
Gupta, S., et al. Progress in stem cells-based replacement therapy for retinal pigment epithelium: in vitro differentiation to in vivo delivery. Stem Cells Transl Med. 12 (8), 536-552 (2023).
Wilson, D. F., et al. Oxygen distribution and vascular injury in the mouse eye measured by phosphorescence-lifetime imaging. Appl Opt. 44 (25), 5239-5248 (2005).
Hass, D. T., et al. Medium depth influences O2 availability and metabolism in human RPE cultures. Invest Ophthalmol Vis Sci. 64 (14), 4 (2023).
Shu, D. Y., Butcher, E. R., Saint-Geniez, M. Suppression of PGC-1α drives metabolic dysfunction in TGFβ2-Induced EMT of retinal pigment epithelial cells. Int J Mol Sci. 22 (9), 4701 (2021).
Shu, D. Y., et al. Dimethyl fumarate blocks tumor necrosis factor-alpha-driven inflammation and metabolic rewiring in the retinal pigment epithelium. Front Mol Neurosci. 15, 896786 (2022).
Ng, P. Q., Saint-Geniez, M., Kim, L. A., Shu, D. Y. Divergent metabolomic signatures of TGFβ2 and TNFα in the induction of retinal epithelial-mesenchymal transition. Metabolites. 13 (2), 213 (2023).
Kar, D., et al. Choriocapillaris impairment is associated with delayed rod-mediated dark adaptation in age-related macular degeneration. Invest Ophthalmol Vis Sci. 64 (12), 41 (2023).
Curcio, C. A., Kar, D., Owsley, C., Sloan, K. R., Ach, T. Age-related macular degeneration, a mathematically tractable disease. Invest Ophthalmol Vis Sci. 65 (3), 4 (2024).
Maminishkis, A., et al. Confluent monolayers of cultured human fetal retinal pigment epithelium exhibit morphology and physiology of native tissue. Invest Ophthalmol Vis Sci. 47 (8), 3612-3624 (2006).
Maminishkis, A., Miller, S. S. Experimental models for study of retinal pigment epithelial physiology and pathophysiology. J Vis Exp: JoVE. (45), e2032 (2010).
Zhang, Q., et al. A platform for assessing outer segment fate in primary human fetal RPE cultures. Exp Eye Res. 178, 212-222 (2019).
Sharma, R., Bose, D., Montford, J., Ortolan, D., Bharti, K. Triphasic developmentally guided protocol to generate retinal pigment epithelium from induced pluripotent stem cells. STAR Protoc. 3 (3), 101582 (2022).
Marchetti, P., Fovez, Q., Germain, N., Khamari, R., Kluza, J. Mitochondrial spare respiratory capacity: Mechanisms, regulation, and significance in non-transformed and cancer cells. FASEB J. 34 (10), 13106-13124 (2020).
Rosenfeld, P. J., Trivizki, O., Gregori, G., Wang, R. K. An update on the hemodynamic model of age-related macular degeneration. Am J Ophthalmol. 235, 291-299 (2022).
Fitch, T. C., et al. Real-time analysis of bioenergetics in primary human retinal pigment epithelial cells using high-resolution respirometry. J Vis Exp: JoVE. (192), (2023).
Calton, M. A., Beaulieu, M. O., Benchorin, G., Vollrath, D. Method for measuring extracellular flux from intact polarized epithelial monolayers. Mol Vis. 24, 425-433 (2018).
Grumbine, M. K., et al. Maintaining and assessing various tissue and cell types of the eye using a novel pumpless fluidics system. J Vis Exp: JoVE. (197), (2023).
Mu, C., Shearer, J. Protocol for measuring respiratory function of mitochondria in frozen colon tissue from rats. STAR Protoc. 4 (4), 102560 (2023).
Rocha, D. S., Manucci, A. C., Bruni-Cardoso, A., Kowaltowski, A. J., Vilas-Boas, E. A. A practical and robust method to evaluate metabolic fluxes in primary pancreatic islets. Mol Metab. 83, 101922 (2024).
Kanaan, M. N., et al. Cystine/glutamate antiporter xCT controls skeletal muscle glutathione redox, bioenergetics and differentiation. Redox Biol. 73, 103213 (2024).
da Veiga Moreira, J., et al. Methylene blue metabolic therapy restrains in vivo ovarian tumor growth. Cancers. 16 (2), 355 (2024).
McNally, L. A., Altamimi, T. R., Fulghum, K., Hill, B. G. Considerations for using isolated cell systems to understand cardiac metabolism and biology. J Mol Cell Cardiol. 153, 26-41 (2021).
Misare, K. R., et al. The consequences of tetraploidy on Caenorhabditis elegans physiology and sensitivity to chemotherapeutics. Sci Rep. 13 (1), 18125 (2023).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

210 RPE OCR AMD

This article has been published

Video Coming Soon

Keep me updated: