مراقبة طويلة الأجل لمعدلات استهلاك الأكسجين في الثقافات الظهارية الصبغية الشبكية شديدة التمايز والاستقطاب

Summary

نقدم جهازا جديدا لقياس معدلات استهلاك الأكسجين (OCR) في الثقافات الظهارية الصبغية في شبكية العين (RPE). يمكن للجهاز قياس التعرف الضوئي على الحروف لأسابيع في كل مرة على RPE نمت على لوحات زراعة الخلايا القياسية مع الوسائط القياسية بينما تكون اللوحات في حاضنة زراعة الخلايا القياسية.

Abstract

يعد استقلاب الميتوكوندريا أمرا بالغ الأهمية للوظيفة الطبيعية لظهارة صبغة الشبكية (RPE) ، وهي طبقة أحادية من الخلايا في شبكية العين مهمة لبقاء المستقبلات الضوئية. يعد خلل الميتوكوندريا RPE سمة مميزة للتنكس البقعي المرتبط بالعمر (AMD) ، وهو السبب الرئيسي للعمى الذي لا رجعة فيه في العالم المتقدم ، واعتلال الشبكية الزجاجي التكاثري (PVR) ، وهو أحد المضاعفات المسببة للعمى لانفصال الشبكية. تم تصميم الظروف التنكسية RPE بشكل جيد من خلال أنظمة زراعة RPE المتباينة للغاية والاستقطاب لتقليد RPE في الجسم الحي . ومع ذلك ، فإن مراقبة معدلات استهلاك الأكسجين (OCR) ، وهي وكيل لوظيفة الميتوكوندريا ، كانت صعبة في أنظمة الاستزراع هذه لأن الظروف التي تعزز الاستقطاب والتمايز المثاليين RPE لا تسمح بقياسات OCR سهلة.

هنا ، نقدم نظاما جديدا ، Resipher ، لمراقبة التعرف الضوئي على الحروف لأسابيع في كل مرة في ثقافات RPE متباينة جيدا مع الحفاظ على RPE على ركائز النمو المثلى ووسائط الثقافة الفسيولوجية في حاضنة زراعة الخلايا القياسية. يحسب هذا النظام OCR عن طريق قياس تدرج تركيز الأكسجين الموجود في الوسائط فوق الخلايا. نناقش مزايا هذا النظام على الطرق الأخرى للكشف عن التعرف الضوئي على الحروف وكيفية إعداد نظام قياس التعرف الضوئي على الحروف في ثقافات RPE. نحن نغطي النصائح والحيل الرئيسية لاستخدام النظام ، والحذر بشأن تفسير البيانات ، وإرشادات لاستكشاف النتائج غير المتوقعة وإصلاحها.

نوفر أيضا آلة حاسبة عبر الإنترنت لاستقراء مستوى تجربة ثقافات نقص الأكسجة أو النورموكسيا أو فرط التأكسج RPE بناء على تدرج الأكسجين في الوسائط فوق الخلايا التي اكتشفها النظام. أخيرا ، نراجع تطبيقين للنظام ، قياس الحالة الأيضية لخلايا RPE في نموذج PVR وفهم كيفية تكيف RPE الأيضي مع نقص الأكسجة. نتوقع أن استخدام هذا النظام على ثقافات RPE شديدة الاستقطاب والتمايز سيعزز فهمنا لعملية التمثيل الغذائي للميتوكوندريا RPE في كل من الحالات الفسيولوجية والمرضية.

Introduction

ظهارة الشبكية الصبغية (RPE) هي طبقة أحادية من الخلايا الظهارية بعد الميتوتيكية وظيفيا وشديدة الاستقطاب والتي تشكل حاجزا بين المستقبلات الضوئية الحساسة للضوء في شبكية العين والدورة الدموية ، وهو سرير شعري يسمى المشيمة الشعرية. مثل دور الخلايا العصبية الداعمة للخلايا الدبقية ، يقوم RPE بوظائف لا تعد ولا تحصى لدعم المستقبلات الضوئية ، بما في ذلك البلعمة للأجزاء الخارجية للمستقبلات الضوئية ، ونقل العناصر الغذائية والدعم الأيضي للمستقبلات الضوئية ، وإفراز عوامل النمو الأساسية ، وكلها ضرورية للحفاظ على الوظيفة البصرية.

يكمن انحطاط RPE وراء العديد من الاضطرابات التنكسية الشائعة في الرؤية. في التنكس البقعي المرتبط بالعمر (AMD) ، وهو أحد الأسباب الأ....

Protocol

للاطلاع على بروتوكولات إنشاء ثقافات بشرية أولية أو iPSC-RPE ، راجع المراجع التالية^{15،16،17،18}. تمت مراجعة اقتناء واستخدام الأنسجة البشرية لهذه البروتوكولات والسماح بها من قبل مجلس المراجعة المؤسسية بجامعة ميشيغان (HUM00105486).

1. التطبيق العام للنظام على ثقافة RPE

1. صفيحة الخلايا الجذعية متعددة القدرات المستحثة بالإنسان (iPSC) المشتقة من RPE أو خلايا RPE البشرية الأولية في لوحات 96 بئرا متوافقة مع النظام.
   1. بافتراض وجود مزارع ناضجة موجودة بالفعل نمت على ألواح زراعة خلايا 24 بئرا ، اغ....

النتائج

يوضح الشكل 2 أ إعداد "الساندويتش" لتجربة Resipher. توجد أغطية استشعار مع 32 مجسا تقابل الأعمدة 3 و 4 و 9 و 10 على لوحة 96 بئرا بين لوحة الخلية والجهاز. بعد الاتصال بلوحة التحكم ، يقوم الجهاز بتنشيط المحركات لتحريك غطاء الاستشعار لأعلى ولأسفل ، وقياس تركيز O₂ في عمود الوسائط على نط.......

Discussion

يلعب استقلاب الميتوكوندريا في RPE دورا مهما في التسبب في أمراض الشبكية الشائعة المسببة للعمى ، بما في ذلك AMD و PVR. تسمح نمذجة استقلاب الميتوكوندريا RPE في المختبر للمرء بعزل حالته الأيضية عن تلك الموجودة في الأنسجة المحيطة ، إلى جانب تعريض الأنسجة لإهانات مختلفة تحاكي المرض بطريقة خاضعة .......

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.25% Trypsin-EDTA	Gibco	#25-200-056
3,3',5-triiodo-L-thyronine sodium salt	Sigma	T5516
32-channel Resipher lid	Lucid Scientific	NS32-101A for Falcon
Antimycin A from streptomyces sp.	Sigma	A8674-25MG	Inhibitor of Complex III of the electron transport chain
BAM15	Sigma	SML1760-5MG	Uncoupling agent to increase mitochondrial respiration
DMSO, cell culture grade	Sigma-aldrich	D4540-100ML	Vehicle for reconstituting mitochondrial drugs
Extracellular matrix coating substrates: Synthemax II-SC	Corning	#3535	Extracellular matrix for hfRPE
Extracellular matrix coating substrates: Vitronectin	Gibco	A14700	Extracellular matrix for iPSC-RPE
FCCP	Sigma	C2920-10MG	Uncoupling agent to increase mitochondrial respiration
Fetal Bovine Serum (Bio-Techne S11550H)	Bio-Techne	S11550H
Hydrocortisone-Cyclodextrin	Sigma	H0396
Hypoxia chamber	Embrient Inc.	MIC-101
N1 Media Supplement	Sigma	N6530
Non-Essential Amino Acids Solution	Gibco	11140050
O2 sensor	Sensit technology or Forensics Detectors	P100 or FD-90A-O2
Penicillin-Streptomycin	Gibco	15140-122
Recombinant human TGFβ2	Peprotech	100-35B	Transforming growth factor beta-2 to induce epithelial-mesenchymal transition
Rotenone	Sigma	R8875-1G	Inhibitor of Complex I of the electron transport chain
System-compatible plate	Corning	#353072
Taurine	Sigma	T8691
αMEM (Alpha Modification of Eagle's Media)	Corning	15-012-CV