高分化型および分極した網膜色素上皮培養における酸素消費速度の長期モニタリング

要約

私たちは、網膜色素上皮(RPE)培養における酸素消費率(OCR)を測定するための新しいデバイスを紹介します。このデバイスは、プレートが標準細胞培養インキュベーター内にある間に、標準培地で標準細胞培養プレートで成長したRPEで一度に数週間OCRを測定できます。

要約

ミトコンドリアの代謝は、光受容体の生存に重要な網膜の細胞の単層である網膜色素上皮(RPE)の正常な機能にとって重要です。RPEミトコンドリア機能障害は、先進国における不可逆的な失明の主な原因である加齢性黄斑変性症(AMD)と、網膜剥離の失明を伴う合併症である増殖性硝子体網膜症(PVR)の特徴です。RPEの変性条件は、 in vivo RPEを模倣するために高度に分化され、分極されたRPE培養システムによって十分にモデル化されています。しかし、ミトコンドリア機能の代理である酸素消費率(OCR)のモニタリングは、理想的なRPEの分極と分化を促進する条件ではOCR測定が容易ではないため、このような培養システムでは困難でした。

ここでは、標準的な細胞培養インキュベーターで最適な増殖基質と生理学的培養培地上のRPEを維持しながら、高分化型RPE培養で一度に数週間OCRをモニターする新しいシステムResipherを紹介します。このシステムは、細胞上の培地に存在する酸素濃度勾配を測定することによりOCRを計算します。OCRを検出するための他の方法と比較した場合のこのシステムの利点と、RPE培養でOCRを測定するためのシステムのセットアップ方法について説明します。システムの使用に関する重要なヒントとコツ、データの解釈に関する注意、予期しない結果のトラブルシューティングに関するガイドラインについて説明します。

また、システムによって検出された細胞上の培地中の酸素勾配に基づいて、低酸素症、正常酸素症、または高酸素症のRPE培養の経験のレベルを推定するためのオンライン計算機も提供しています。最後に、PVRモデルにおけるRPE細胞の代謝状態の測定と、RPEが低酸素症にどのように代謝的に適応するかを理解するという、システムの2つのアプリケーションについて概説します。このシステムを高度に分極し分化したRPE培養に使用することで、生理学的および疾患的状態の両方でのRPEミトコンドリア代謝の理解が深まると期待しています。

概要

網膜色素上皮(RPE)は、機能的に有糸分裂後の高度に分極された上皮細胞の単層であり、網膜の光感受性光受容体とその血液循環との間の障壁を形成します。これは、絨毛毛細血管と呼ばれる毛細血管床です。グリア支持ニューロンの役割と同様に、RPEは、視細胞の外側セグメントの食作用、光受容体の栄養素の輸送と代謝サポート、視覚機能の維持に不可欠な成長因子の分泌など、光受容体をサポートするための無数の機能を実行します。

RPEの変性は、視覚のいくつかの一般的な変性疾患の根底にあります。加齢黄斑変性症(AMD)は、世界で最も多い難治性視力喪失の原因の一つであり、RPEが死滅し、その上にある光受容体が二次変性を起こします。増殖性硝子体網膜症(PVR)では、RPEは代わりに通常は静止している有糸分裂後の状態から抜け出し、増殖して間葉系状態(いわゆる上皮間葉系への移行[EMT])に脱分化し、代謝が変化します。RPEの脱分化は、光受容体へのRPEサポートの喪失を引き起こすと同時に、より線維化した状態を引き起こします。これにより、視細胞の変性とRPE誘発性の瘢痕化の両方が起こり、どちらも視力低下を引き起こします^1,2。

RPEの光受容体に対するサポートの大部分は代謝性であり、代謝調節不全はAMDやPVRを含む多くの網膜疾患の重要な要素です。RPEは、光受容体とその酸素および栄養素の供給源である絨毛毛細血管との間の調節障壁として機能します。したがって、RPEが代謝するために選択するものと、RPEが絨毛細血管から光受容体を通過するために選択するものが、光受容体の代謝と生存を強く支配します。多くの研究により、RPEは正常な健康のためにミトコンドリア代謝に大きく依存しており、光受容体は代わりに解糖系に大きく依存していることが示されています³。これにより、光受容体とRPEとの間の補完的で絡み合った代謝状態の概念が導入されました。具体的には、RPEは、好ましい視細胞代謝基質の代謝を減少させ、代わりに、光受容体が消費しない代謝産物と組み合わせた光受容体代謝の副産物を利用します。PVRやAMDなどの疾患では、RPEがより解糖性が高くなり、ミトコンドリア代謝への依存度が低くなるという証拠が強く示唆されています。このRPE解糖系へのシフトは、必要な代謝物の光受容体を飢えさせ、変性を引き起こす可能性があります^4,5,6。RPEと光受容体代謝がどれほど相互依存的であるか、そして代謝の変化が網膜疾患の根底にあるかを考えると、治療目的でRPE代謝をモデル化および操作することに強い関心が寄せられています。

RPEミトコンドリア代謝をin vivoで研究することは理想的ですが、RPEミトコンドリア代謝の多くの側面は、in vitro培養システムでしか実際に調査できません。過去数十年の間に、忠実度の高いRPE培養に向けた大きな進歩が見られ、現在では最も慎重に手入れされたRPE培養物がヒト臨床試験の細胞補充療法に使用されています⁷。このような忠実度の高い培養を維持するためには、実験の数か月前に、RPEを特定の培地の特定の基質上で増殖させる必要があります。これらの条件により、RPE培養物は最大限に分化および分極され、in vivo RPEに近似します。残念ながら、現在、in vivo の RPE からミトコンドリア代謝を特異的に測定できる機器はありません。網膜毛細血管網の酸素モニタリングは、電子常磁性共鳴(EPR)酸素濃度計⁸を使用してin vivoで達成されていますが、これはRPE分析では不可能です。in vivoとin vitroのRPE代謝の違いは十分に説明されていませんが、RPE培養物はin vivoのRPEと同様に高いミトコンドリア活性を持つことが示されています^3,9、これは、忠実度の高いRPE培養を使用してRPEミトコンドリア代謝に関する重要な洞察を得ることができることを示唆しています。

すべてのミトコンドリア代謝は酸素消費につながるため、RPE酸素消費率(OCR)の測定はミトコンドリア代謝の忠実な代理です。RPEの分極と分化を最大にする条件では、タツノオトシゴアナライザーなどの現在利用可能な技術では長期にわたる正確なOCR測定ができないことが多いため、RPE培養におけるOCRの測定は困難でした。この手法論文では、Resipher(以下、「システム」)と呼ばれる新しいデバイスが導入され、偏光と分化を最大限に促進する条件下で成長したRPEでOCRを数週間にわたって連続的に測定できます。RPEの分化と分極を最大限促進するRPE培養条件において、このシステムによるOCRの測定の容易さは、既存のOCR測定デバイスの中でも独特です。

このホワイト ペーパーでは、RPE カルチャでシステムを使用するためのヒントとコツを提供し、その後に 2 つの特定のアプリケーションのデモを示します。まず、PVRを模倣したRPE EMTは、トランスフォーミング成長因子ベータ(TGFβ)1,10,11,12への曝露によって引き起こされます。このシステムは、EMTプロセス中にRPE代謝がどのように進化するかを監視するために使用されます。第二に、RPE代謝における低酸素症の役割は、このシステムを使用して調査されます。低酸素症は、絨毛細血管が^13,14 歳で薄くなるため、AMD の病因に重要な貢献をしています。このシステムを低酸素チャンバーと組み合わせることで、RPEミトコンドリア代謝の変化と、加齢に伴う微妙な低酸素症をモデル化することができます。最後に、Resipherデータを使用したオンライン計算機が導入され、RPE培養物が低酸素、正常酸素、または高酸素のいずれの状態にあるかを判断できます。このような情報は、in vitro RPE培養研究からRPE代謝に関する結論を導き出すために重要です。

プロトコル

ヒト初代培養またはiPSC-RPE培養を確立するためのプロトコルについては、以下の参考文献15,16,17,18を参照してください。これらのプロトコルのためのヒト組織の取得と使用は、ミシガン大学の治験審査委員会(HUM00105486)によって審査され、許可されました。

1. RPE文化へのシステムの一般的な適用

1. システム適合の96ウェルプレートにヒト誘導多能性幹細胞(iPSC)由来のRPE細胞または初代ヒトRPE細胞をプレート化します。
   1. 既存の成熟培養物を24ウェル細胞培養プレートで培養したと仮定すると、細胞をリン酸緩衝生理食塩水(PBS)で一度洗浄した後、500 μLの0.25%トリプシン-EDTAを加えます(材料表)。細胞培養インキュベーターで10〜40分間インキュベートし、細胞が丸くなり、ほぼ剥離する準備ができるまで5〜10分ごとにチェックします。
   2. 培地を細胞上に静かにピペットで移し、細胞培養プラスチックから取り除いた後、3倍容量の細胞培養培地(24ウェルあたり1,500μL)に移し、遠心分離機で250 × g 、室温で5分間スピンダウンします。
      注:RPE細胞培養培地のレシピは表1に詳述されており、以前に公開された参考文献^{9,15,16,17,18}で入手できます。
   3. 15%ウシ胎児血清(FBS)を含むRPE細胞培養培地に細胞を再懸濁し、血球計算盤で細胞をカウントします。
   4. 96ウェルプレートの各ウェル(通常225-300 × 10⁵ 細胞/cm²)に対して、製造元の指示に従って高度に特殊化された細胞外マトリックスコーティング基質(材料表)でコーティングした後、74,000個の細胞を播種します。
      注:シードセルは、Resipher適合プレート(材料表)および検出蓋(32チャンネル蓋の列3、4、9、および10列)上のプローブアレイに対応するウェルのみに存在します。システムのセンシングリッドには、4チャンネル、32チャンネル、または96チャンネルのセンサー(図1A-Dのセンサー位置を参照)が用意されており、さまざまな標準細胞培養プレートに対応しています。
   5. エッジウェルは蒸発しやすく、酸素の利用可能性に大きく影響するため、OCRの読み取り値には、すべてのエッジウェル(96ウェルプレートの行AおよびH)に細胞を播種しないようにします。さらに、96ウェルプレートの各空ウェルに200μLの滅菌水を加えて、蒸発の影響を減らします。
   6. プレートを安定したテーブル面に10分間置いて、セルが落ち着くようにします。その後、それをインキュベーターに戻します。24〜72時間後に培地を交換し、5%FBSを含む標準のRPE培養培地と交換します。少なくとも4週間培養し、週に2回メディアを交換します。
      注:細胞は、色素が入り、丸石で、非常にコンパクトになると、実験の準備が整います(図1E)。
2. システムによるデータのセットアップと集録
   1. 空の96ウェルレシーバープレートにセンシング蓋を置き、これを細胞培養インキュベーターに戻します。デバイスをセンシングリッドに位置合わせして取り付け、付属のUSBケーブルでハブに接続します。これにより、Resipher の "サンドイッチ " が作成されます (図 2A)。
   2. Lucid ラボの Web サイト アプリケーション (https://lab.lucidsci.com/) に移動し、右上隅にある [新しい実験 ] ボタンをクリックして新しい実験を作成します。
   3. 実験のタイトルを記入し、特定の研究に関連する実験ノート(使用しているiPSC-RPEの通過番号など)を入力します。
   4. 井戸条件と処理グループを作成します。例えば、OCRで培地中の異なる血清濃度の影響をテストする場合は、グループ名で「Serum」を選択し、使用する培地の血清濃度を入力し、「+」ボタンをクリックして血清パーセント値を追加します。特定の血清の割合を受け取るウェルを割り当て、それらのウェルのカラーパターンを選択します。必要に応じて、グループの追加ボタンをクリックして、グループ(テストする別の実験変数など)を追加します。
   5. プレート設定を定義し、対応するデバイスとプレート スタイルを選択します。[プレートの追加]ボタンをクリックして、[デバイス]を選択します。プレートタイプを選択します。治療を選択し、対応するウェルをクリックします。
   6. [ 今すぐ開始 ] ボタンをクリックして、実験を開始します。のインジケーターを確認してください webサイトとハブのLEDが 緑色に点灯しています。
   7. システムを15〜60分間稼働させて、各センサーが適切に校正され、大気中の酸素を正確に検出し、5%_CO2 を含む完全加湿細胞培養インキュベーターで~200μMの濃度であることを確認してください(図2Bi)。
      注:標準的な細胞培養インキュベーターのセットアップで、いずれかのセンサーが他のセンサーの平均から20%以上ずれている場合は、センサーが故障しているため、データ解析でその井戸を除外することを検討してください(図2Bii)。
      注:すべてのセンサーが他のセンサーの平均から20%以上ずれており、標準的な細胞培養インキュベーターのセットアップで200μMと報告された予想される大気O₂ から外れている場合は、センシングの蓋が何度も使用されています。新しいセンシングリッドと交換します(図2Biii)。
      注:実験を開始する前に空気中のO₂ 測定値を取得すると、実験後のトラブルシューティングが大幅に改善されます。実験が行われた後に特定の井戸が外れ値として表示され、その井戸にキャリブレーションされていないセンサーがある場合、問題は生物学的複製ではなくセンサーにある可能性があります。
   8. デバイスをセンシングカバーから取り外します(ただし、USBケーブルをデバイスから取り外さないでください)。デバイスをインキュベーターに逆さまに置き、デバイスのモーターをリセットできるようにします。すべてのモーター音が停止するまで(約20〜30秒)、デバイスを再利用しないでください。
      注:実験中は、デバイスがセンシングリッドから外れているときでも、常にデバイスをUSBケーブルでハブに接続しておくことが重要です。これにより、デバイスは細胞培養インキュベーター環境を継続的に監視し、報告することができます。
   9. センシング蓋付きのプレートを細胞培養フードに戻し、RPE培養物を含む96ウェルプレートをセットします。すべてのウェルについて同じ培地と同じ容量のRPE培養でプレート内の培地を交換し、各ウェルのベースラインOCR値を取得します。RPEを含まないすべてのウェルには、蒸発を防ぐために滅菌水を入れてください。
      注:一般的に、培地の量が少ないと栄養素が急速に枯渇するが、培地の量が多いと不注意な低酸素症につながることを示すデータに基づいて、96ウェルあたり60〜100μLのRPE培地を推奨^{します9。}
   10. 検出蓋を細胞培養物入りプレートに移し、細胞培養物入りプレート上の標準(非免疫)蓋を空の96ウェルレシーバープレートに移して、実験中のさまざまなポイントで必要となる標準蓋の無菌性を維持します。
   11. 細胞培養とセンシング蓋を入れたプレートを細胞培養インキュベーターに戻します。もう一度、デバイスをセンシングリッドに位置合わせして取り付け、付属のUSBケーブル(「サンドイッチ」の組み立て)を介してハブに接続します。のインジケーターを確認します webサイトインターフェイスとハブがすべて 緑色に点灯しています。
       注:O₂ 濃度データはすぐに表示されますが、OCRデータは十分なO₂ データが収集された後(約1時間)にのみ表示されます。
   12. デバイスで各ウェルのOCRを少なくとも12〜24時間測定して、ベースラインOCRをキャプチャさせます。
       注:ベースラインOCRは、細胞に適用される培地の種類など、多くの要因によって異なります。 図 2C では、FBS の量が異なる標準 RPE 培地 (0%、5%、15%) の OCR 値はわずかに異なります。さらに、FBSを多く含む培養物は、培地を細胞に適用した後、ミトコンドリア代謝物の枯渇によりOCRが低下する前に、ミトコンドリアの活性をより長く維持することができます(曲線の右側)。
   13. ベースラインOCRが得られたら、ステップ1.2.8-1.2.12を繰り返しますが、RPE培養物を含むプレート上の培地を実験条件に変更します(通常は、薬物±または異なる培地条件の比較)。
       メモ: 定期的なメディア交換も同じ方法で処理できます。細胞培養インキュベーターを開くと、温度、湿度、CO₂ 濃度、およびインキュベーターのドアが開くと一時的に中断されるその他の要因に依存するため、OCRの読み取りに大きな混乱が生じることが予想されます。デバイスをセンシングの蓋から取り外す際は、実験をオンラインで一時停止する必要はありません。細胞培養インキュベーターのドアを開けた後、またはプローブ対象のプレート上で培地を交換した後、酸素勾配を再確立し、正確なOCRの測定を開始するには、通常2〜4時間かかります。
   14. データを取得した後、実験条件が適用された後、OCRから各ウェルの ベースライン OCRを差し引き、治療によってトリガーされる デルタOCR を決定します。
   15. 実験が完了したら、センシング蓋を滅菌して再利用します(3〜5回再利用できますが、繰り返し使用すると性能が低下します)。センシングリッドを滅菌するには、リッド全体を70%エタノールに10分間細胞培養フードに浸し、その後、浸漬から取り出してキャビネットプローブ側を上にして休ませ(デリケートなプローブチップに触れないように)、エタノールと水を完全に蒸発させてから、新しい96ウェルレシーバープレートにセンシングリッドを置きます。
3. 明視野画像を撮影して、OCR値をセル番号に正規化します。
   注:RPEにおけるメラニン蓄積は、明視野顕微鏡を用いた生体培養中の細胞数の単純なカウントに基づくOCRの正常化を促進します。
   1. 手順1.2.8のように、デバイスを取り外して逆さまに置きます。細胞培養フードで、RPE培養プレートの検出蓋を標準の96ウェル蓋と交換します。
   2. 標準的な倒立顕微鏡を使用して、各ウェルの明視野画像を撮影します。
      注:エリア1の画像は、ウェル間で一貫性を保ちます(ウェル内の相対位置と客観的な倍率)。
   3. 細胞培養フードで、RPE培養プレートの標準的な96ウェル蓋をセンシング蓋に交換し、インキュベーターに戻してさらにモニタリングします。
   4. ImageJなどのソフトウェアで各ウェルの細胞数をカウントします。
   5. OCRをさまざまな実験グループの細胞番号に正規化します。OCRは、断面積単位面積当たりの消費量をfmol・(^mm2)^-1・^s-1-の単位で報告します。したがって、細胞あたりのOCRを正規化するには、OCRを(ウェルあたりの細胞数ではなく)mm^あたりの 細胞数2で除算します。同様に、システムによって報告されたOCRにウェルの断面積(標準的な96ウェルプレートで約31 mm² )を掛けて、fmol・^s-1・^well-1の単位でOCRを算出します。
4. RPE生体エネルギーパラメータを決定するための制御。
   注:システムおよびRPE培養物が予測可能な方法でミトコンドリア操作に応答していることを確認するために、ミトコンドリアの酸化的リン酸化の特定のステップを標的とする確立された特定の小分子を試験することができます。これらの試験は、タツノオトシゴ^{アナライザー10} を使用したミトコンドリアストレス試験で実施されるステップに類似しており、RPE培養の生体エネルギープロファイルを提供します。
   1. RPE細胞を5% FBSを含む65 μLの標準RPE培養培地で培養し、OCRを24時間測定してベースラインを確立します。
   2. 培養培地を吸引し、5% FBSおよびミトコンドリアアンカプラー(3 μM カルボニルシアン化物-p-トリフルオロメトキシフェニルヒドラゾン[FCCP]または500 nM Bam15、 材料表)を含む65 μLの標準RPE培養培地を加えます。一晩インキュベートします。
      注:ミトコンドリアアンカプラーはOCRを大幅に増加させるはずです。増加したOCRが、標準的な培養条件で65μLの培地に対して理論上の最大拡散制限OCRである約275 fmol・(mm²)^-1・^s-1 に近づいていないことを確認してください。一般的に使用されるさまざまなメディアボリュームの最大OCRは、ディスカッションセクションで利用できます。
   3. 一晩インキュベートした後、ミトコンドリアアンカプラーで培地を吸引し、5% FBSを含む65 μLの標準RPE培地と交換します。プレートをさらに24時間観察して、薬物の除去後のRPE OCRの回復を決定します。
   4. 治療前に得られたOCRから治療後に得られたOCRを差し引いて、OCRに対するアンカプラーの影響を計算します(図3)。
      注:ミトコンドリアアンカプラーの追加によるOCRの増加は、細胞¹⁹の予備的なミトコンドリア呼吸能力を意味する。
   5. タツノオトシゴ分析計によるミトコンドリアストレステストで通常取得される他のミトコンドリアパラメータを測定するには、以下の化合物を使用して上記と同じ手順を実行します(図4)。
      1. オリゴマイシンを1 μMで使用して、ATP関連呼吸を評価します。
      2. アンチマイシンAとロテノンを1 μMで使用して、非ミトコンドリア呼吸を評価します。
         注:FCCP、オリゴマイシン、アンチマイシンA、およびロテノンはRPEに対して毒性がある可能性があります。それらが重大な細胞死を誘発する場合、OCR測定は正確ではありません。したがって、OCR測定は、明らかな細胞死がない時点、通常は薬物が追加されてから最初の数時間以内にのみ取得する必要があります(図4)。

2. 救急救命士のRPEにおけるミトコンドリア代謝の変化測定

1. セクション 1.2 で概説されているのと同じプロトコルに従います。
2. ベースラインのOCR測定値を取得した後にEMTを誘導するには、TGF-β2(10 ng / mL)をRPE培養物に添加し、OCRを3週間にわたってモニターします。2〜3日ごとに新しいTGFβ2でメディアをリフレッシュしてください(図5)。
3. 少なくとも週に2回、セクション1.3のように明視野画像を取得して、細胞数が変化していないことを確認します。カウントが変化した場合は、OCR値を各ウェルのセル番号に正規化します。
   注:同じプロトコルをEMTの他のインデューサーに使用して、細胞がインキュベーター内にある間の培養期間を通じて長期的なOCR変化をモニターすることができます。

3. 低酸素RPEにおけるミトコンドリア代謝の変化測定

注:低酸素、正常酸素、または高酸素条件下でのシステムの適用は、標準的な細胞培養インキュベーターに置かれた低酸素チャンバー(材料表)に「サンドイッチ」を保持することを除いて、セクション1.2と同じです。

1. 低酸素チャンバーの蓋に穴を開けてUSB Type-cケーブルを取り付け、シリコンまたはパテで密封します(図6A)。
2. フード内の細胞培養プレートでセンシング蓋を組み立て、低酸素チャンバーに移します。
3. 「サンドイッチ」(プレート、センシングリッド、デバイス)を低酸素チャンバーにセットします。また、低酸素チャンバーに滅菌水を入れたシャーレを入れて、湿度を維持します。最後に、ポータブルO₂ センサーを低酸素チャンバーに入れます(材料の表)。セットアップを 図 6A に示します。
4. チャンバーを密閉し、低酸素濃度O₂ および標準細胞培養濃度CO₂ (例:1% O₂ および5% CO₂)のガスボンベに接続します。
5. 酸素センサーが目的のO₂濃度(通常は1%から10%)を示すまで、低酸素チャンバー内の空気をシリンダー内の1%O₂/5%CO₂空気とゆっくりと交換します。
   注:ポータブルO₂ センサーは平衡化に時間がかかるため、シリンダーからのガスをゆっくりと低酸素チャンバーに追加する必要があります。
6. 低酸素チャンバーの入口バルブと出口バルブを閉じ、チャンバー全体をインキュベーターに移します。
7. セクション 1.2 のように実験を設定して開始します。
   注:細胞に添加する前に低酸素チャンバー内で培地を事前に平衡化することで、細胞単層が真の低酸素状態を経験するのにかかる時間を短縮できます(図6B)。

4. RPE単層でのO₂ 濃度を計算して、細胞が低酸素、正常酸素、または高酸素状態にあるかどうかを判断します

注:このシステムは、標準プレートが単層培養に対応する推奨センシング蓋とともに使用されると仮定して、デフォルトでウェルの底から約1〜1.5 mm上のO₂ 濃度を測定します(https://lucidsci.com/docs/LucidScientific_Sensing_Lid_Selection_Guide.pdf を参照)。細胞単層でのO₂ 濃度は直接測定されませんが、システムのデータを使用してRPEレベルでのO₂ 濃度を推定できます。具体的には、O₂ が利用可能な培地カラムの上部とO₂ が消費されている培地カラムの下部との間に酸素勾配が存在することがわかっているため、Fickの拡散の法則を測定されたOCRレートと組み合わせて、細胞単層のO₂ レベルを推定できます。この見積もりの計算機はオンラインで提供されています:https://lucidsci.com/notes?entry=oxygen_diffusion(そして、https://observablehq.com/@lucid/oxygen-diffusion-and-flux-in-cell-culture のオープンソースのインタラクティブノートブックの形で、この計算機のソースコードは https://github.com/lucidsci/oxygen-diffusion-calculator にあります)。

1. 計算機にアクセスしたら、 メディア容量をマイクロリットル( 100μLなど)で入力します。
2. 気液界面(細胞の上の培地列の上部)での飽和酸素濃度を入力します。この値は、標準大気圧、O₂ 5%、湿度95%で~185 μMです。
   注:これは、培地のみのウェル(ウェルの底にセルがない)のシステムプローブによるO₂ 測定からも決定できます。
3. 「Flux」入力に、システムによって報告された「Flux/OCR」を入力します。
4. これらの値に基づいて、 培地列の各高さにおける定常状態の酸素濃度 が計算され、プロットに示されます(図7)。プロットの x 軸 は、 ウェルの底からの高さ (mm 単位) です。 y軸 は、 その高さで計算されたO₂ 濃度 (μM)です。
5. ウェルの底部(細胞がある場所)のO₂ 濃度は、プロットの下の線で報告されています。
   注:一般に、 in vivo でのRPEは4〜9%のO₂ 濃度を見ると推定されています。標準的な大気条件で各10μMの_O2 は、約1%の_O2に相当します。したがって、細胞レベルでの正常酸素は、O₂の約40〜90μMである。メディアカラムが高いほど、O₂ はRPE単層⁹のレベルで低くなります。したがって、細胞が低酸素状態にあるように見える場合、培地の量を減らすことができます。細胞が高酸素状態にあるように見える場合は、培地の量を増やすことができます。

結果

Resipher実験の「サンドイッチ」セットアップを 図2Aに示します。96ウェルプレート上のカラム3、4、9、および10に対応する32個のプローブを備えたセンシングリッドが、セルプレートとデバイスの間に配置されています。ハブに接続した後、デバイスはモーターを作動させてセンシングリッドを上下に動かし、セル単層(通常は1〜1.5 mm)上の高さの範囲でメディアカラム内?...

ディスカッション

RPEのミトコンドリア代謝は、AMDやPVRなどの一般的な失明性網膜疾患の病因に重要な役割を果たします。RPEミトコンドリア代謝 をin vitro でモデル化することで、その代謝状態を周囲の組織から分離するとともに、組織を制御された方法でさまざまな疾患をシミュレートする侮辱にさらすことができます。このようなRPEミトコンドリア代謝の in vitro モデリングは、 in vivoでRPE...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.25% Trypsin-EDTA	Gibco	#25-200-056
3,3',5-triiodo-L-thyronine sodium salt	Sigma	T5516
32-channel Resipher lid	Lucid Scientific	NS32-101A for Falcon
Antimycin A from streptomyces sp.	Sigma	A8674-25MG	Inhibitor of Complex III of the electron transport chain
BAM15	Sigma	SML1760-5MG	Uncoupling agent to increase mitochondrial respiration
DMSO, cell culture grade	Sigma-aldrich	D4540-100ML	Vehicle for reconstituting mitochondrial drugs
Extracellular matrix coating substrates: Synthemax II-SC	Corning	#3535	Extracellular matrix for hfRPE
Extracellular matrix coating substrates: Vitronectin	Gibco	A14700	Extracellular matrix for iPSC-RPE
FCCP	Sigma	C2920-10MG	Uncoupling agent to increase mitochondrial respiration
Fetal Bovine Serum (Bio-Techne S11550H)	Bio-Techne	S11550H
Hydrocortisone-Cyclodextrin	Sigma	H0396
Hypoxia chamber	Embrient Inc.	MIC-101
N1 Media Supplement	Sigma	N6530
Non-Essential Amino Acids Solution	Gibco	11140050
O2 sensor	Sensit technology or Forensics Detectors	P100 or FD-90A-O2
Penicillin-Streptomycin	Gibco	15140-122
Recombinant human TGFβ2	Peprotech	100-35B	Transforming growth factor beta-2 to induce epithelial-mesenchymal transition
Rotenone	Sigma	R8875-1G	Inhibitor of Complex I of the electron transport chain
System-compatible plate	Corning	#353072
Taurine	Sigma	T8691
αMEM (Alpha Modification of Eagle's Media)	Corning	15-012-CV