Monitoramento de longo prazo das taxas de consumo de oxigênio em culturas epiteliais pigmentares retinianas altamente diferenciadas e polarizadas

Resumo

Apresentamos um novo dispositivo para medir as taxas de consumo de oxigênio (OCR) em culturas epiteliais pigmentares da retina (RPE). O dispositivo pode medir o OCR por semanas a fio em RPE cultivado em placas de cultura de células padrão com meio padrão, enquanto as placas estão em uma incubadora de cultura de células padrão.

Resumo

O metabolismo mitocondrial é crítico para a função normal do epitélio pigmentar da retina (EPR), uma monocamada de células na retina importante para a sobrevivência dos fotorreceptores. A disfunção mitocondrial do EPR é uma marca registrada da degeneração macular relacionada à idade (DMRI), a principal causa de cegueira irreversível no mundo desenvolvido, e da vitreorretinopatia proliferativa (RVP), uma complicação ofuscante dos descolamentos de retina. As condições degenerativas do EPR foram bem modeladas por sistemas de cultura de EPR que são altamente diferenciados e polarizados para mimetizar o EPR in vivo . No entanto, o monitoramento das taxas de consumo de oxigênio (OCR), um proxy para a função mitocondrial, tem sido difícil em tais sistemas de cultura porque as condições que promovem a polarização e diferenciação ideais do RPE não permitem medições fáceis de OCR.

Aqui, apresentamos um novo sistema, o Resipher, para monitorar o OCR por semanas a fio em culturas de EPR bem diferenciadas, mantendo o EPR em substratos de crescimento ideais e meios de cultura fisiológicos em uma incubadora de cultura de células padrão. Este sistema calcula o OCR medindo o gradiente de concentração de oxigênio presente no meio acima das células. Discutimos as vantagens deste sistema sobre outros métodos para detectar OCR e como configurar o sistema para medir OCR em culturas de EPR. Abordamos as principais dicas e truques para usar o sistema, cuidados sobre a interpretação dos dados e diretrizes para solucionar problemas de resultados inesperados.

Também fornecemos uma calculadora on-line para extrapolar o nível de hipóxia, normóxia ou hiperóxia que as culturas de EPR experimentam com base no gradiente de oxigênio no meio acima das células detectadas pelo sistema. Finalmente, revisamos duas aplicações do sistema, medindo o estado metabólico das células RPE em um modelo PVR e entendendo como o RPE se adapta metabolicamente à hipóxia. Prevemos que o uso deste sistema em culturas de EPR altamente polarizadas e diferenciadas aumentará nossa compreensão do metabolismo mitocondrial de EPR, tanto em estados fisiológicos quanto em estados de doença.

Introdução

O epitélio pigmentar da retina (EPR) é uma monocamada de células epiteliais funcionalmente pós-mitóticas e altamente polarizadas que formam uma barreira entre os fotorreceptores sensíveis à luz na retina e sua circulação sanguínea, um leito capilar denominado coriocapilar. Como o papel dos neurônios que sustentam a glia, o EPR realiza inúmeras funções para apoiar os fotorreceptores, incluindo fagocitose dos segmentos externos dos fotorreceptores, transporte de nutrientes e suporte metabólico para fotorreceptores e secreção de fatores essenciais de crescimento, todos críticos para manter a função visual.

A degeneração do EPR está subjacente ....

Protocolo

Para protocolos para estabelecer culturas primárias humanas ou iPSC-RPE, consulte as seguintes referências 15,16,17,18. A aquisição e o uso de tecido humano para esses protocolos foram revisados e permitidos pelo Conselho de Revisão Institucional da Universidade de Michigan (HUM00105486).

1. Aplicação geral do sistema à cultura de EPR

1. Células-tronco pluripotentes induzidas por humanos (iPSC) derivadas de RPE ou células primárias de RPE humanas em placas de 96 poços compatíveis com o sist....

Discussão

O metabolismo mitocondrial do EPR desempenha um papel crítico na patogênese de doenças retinianas comuns que causam cegueira, incluindo DMRI e RVP. A modelagem do metabolismo mitocondrial do EPR in vitro permite isolar seu estado metabólico daqueles dos tecidos circundantes, além de submeter o tecido a diferentes insultos simuladores de doenças de maneira controlada. Essa modelagem in vitro do metabolismo mitocondrial do EPR foi facilitada pelo advento de culturas primárias humanas e iPSC-RPE de .......

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.25% Trypsin-EDTA	Gibco	#25-200-056
3,3',5-triiodo-L-thyronine sodium salt	Sigma	T5516
32-channel Resipher lid	Lucid Scientific	NS32-101A for Falcon
Antimycin A from streptomyces sp.	Sigma	A8674-25MG	Inhibitor of Complex III of the electron transport chain
BAM15	Sigma	SML1760-5MG	Uncoupling agent to increase mitochondrial respiration
DMSO, cell culture grade	Sigma-aldrich	D4540-100ML	Vehicle for reconstituting mitochondrial drugs
Extracellular matrix coating substrates: Synthemax II-SC	Corning	#3535	Extracellular matrix for hfRPE
Extracellular matrix coating substrates: Vitronectin	Gibco	A14700	Extracellular matrix for iPSC-RPE
FCCP	Sigma	C2920-10MG	Uncoupling agent to increase mitochondrial respiration
Fetal Bovine Serum (Bio-Techne S11550H)	Bio-Techne	S11550H
Hydrocortisone-Cyclodextrin	Sigma	H0396
Hypoxia chamber	Embrient Inc.	MIC-101
N1 Media Supplement	Sigma	N6530
Non-Essential Amino Acids Solution	Gibco	11140050
O2 sensor	Sensit technology or Forensics Detectors	P100 or FD-90A-O2
Penicillin-Streptomycin	Gibco	15140-122
Recombinant human TGFβ2	Peprotech	100-35B	Transforming growth factor beta-2 to induce epithelial-mesenchymal transition
Rotenone	Sigma	R8875-1G	Inhibitor of Complex I of the electron transport chain
System-compatible plate	Corning	#353072
Taurine	Sigma	T8691
αMEM (Alpha Modification of Eagle's Media)	Corning	15-012-CV