Monitoramento de longo prazo das taxas de consumo de oxigênio em culturas epiteliais pigmentares retinianas altamente diferenciadas e polarizadas

Resumo

Apresentamos um novo dispositivo para medir as taxas de consumo de oxigênio (OCR) em culturas epiteliais pigmentares da retina (RPE). O dispositivo pode medir o OCR por semanas a fio em RPE cultivado em placas de cultura de células padrão com meio padrão, enquanto as placas estão em uma incubadora de cultura de células padrão.

Resumo

O metabolismo mitocondrial é crítico para a função normal do epitélio pigmentar da retina (EPR), uma monocamada de células na retina importante para a sobrevivência dos fotorreceptores. A disfunção mitocondrial do EPR é uma marca registrada da degeneração macular relacionada à idade (DMRI), a principal causa de cegueira irreversível no mundo desenvolvido, e da vitreorretinopatia proliferativa (RVP), uma complicação ofuscante dos descolamentos de retina. As condições degenerativas do EPR foram bem modeladas por sistemas de cultura de EPR que são altamente diferenciados e polarizados para mimetizar o EPR in vivo . No entanto, o monitoramento das taxas de consumo de oxigênio (OCR), um proxy para a função mitocondrial, tem sido difícil em tais sistemas de cultura porque as condições que promovem a polarização e diferenciação ideais do RPE não permitem medições fáceis de OCR.

Aqui, apresentamos um novo sistema, o Resipher, para monitorar o OCR por semanas a fio em culturas de EPR bem diferenciadas, mantendo o EPR em substratos de crescimento ideais e meios de cultura fisiológicos em uma incubadora de cultura de células padrão. Este sistema calcula o OCR medindo o gradiente de concentração de oxigênio presente no meio acima das células. Discutimos as vantagens deste sistema sobre outros métodos para detectar OCR e como configurar o sistema para medir OCR em culturas de EPR. Abordamos as principais dicas e truques para usar o sistema, cuidados sobre a interpretação dos dados e diretrizes para solucionar problemas de resultados inesperados.

Também fornecemos uma calculadora on-line para extrapolar o nível de hipóxia, normóxia ou hiperóxia que as culturas de EPR experimentam com base no gradiente de oxigênio no meio acima das células detectadas pelo sistema. Finalmente, revisamos duas aplicações do sistema, medindo o estado metabólico das células RPE em um modelo PVR e entendendo como o RPE se adapta metabolicamente à hipóxia. Prevemos que o uso deste sistema em culturas de EPR altamente polarizadas e diferenciadas aumentará nossa compreensão do metabolismo mitocondrial de EPR, tanto em estados fisiológicos quanto em estados de doença.

Introdução

O epitélio pigmentar da retina (EPR) é uma monocamada de células epiteliais funcionalmente pós-mitóticas e altamente polarizadas que formam uma barreira entre os fotorreceptores sensíveis à luz na retina e sua circulação sanguínea, um leito capilar denominado coriocapilar. Como o papel dos neurônios que sustentam a glia, o EPR realiza inúmeras funções para apoiar os fotorreceptores, incluindo fagocitose dos segmentos externos dos fotorreceptores, transporte de nutrientes e suporte metabólico para fotorreceptores e secreção de fatores essenciais de crescimento, todos críticos para manter a função visual.

A degeneração do EPR está subjacente a vários distúrbios degenerativos comuns da visão. Na degeneração macular relacionada à idade (DMRI), uma das causas mais comuns de perda de visão incurável no mundo, o EPR morre e, portanto, os fotorreceptores sobrejacentes sofrem uma degeneração secundária. Na vitreorretinopatia proliferativa (PVR), o EPR sai de seu estado pós-mitótico normalmente quiescente, proliferando e se desdiferenciando em um estado mesenquimal (a chamada transição epitelial para mesenquimal [EMT]) com alterações em seu metabolismo. A desdiferenciação do EPR causa uma perda de suporte do EPR para os fotorreceptores, ao mesmo tempo em que desencadeia um estado mais fibrótico. Isso resulta tanto na degeneração dos fotorreceptores quanto na cicatrização induzida pelo EPR, que desencadeiam perda de visão ^1,2.

A maior parte do suporte do EPR aos fotorreceptores é metabólico, e a desregulação metabólica é um fator crítico em várias doenças da retina, incluindo DMRI e PVR. O EPR serve como uma barreira regulatória entre os fotorreceptores e sua fonte de oxigênio e nutrientes, os coriocapilares. Assim, o que o EPR escolhe metabolizar versus o que o EPR escolhe passar do coriocapilar para os fotorreceptores governa fortemente o metabolismo e a sobrevivência dos fotorreceptores. Numerosos estudos mostraram que o EPR é fortemente dependente do metabolismo mitocondrial para sua saúde normal e que os fotorreceptores dependem fortemente da glicólise³. Isso introduziu o conceito de estados metabólicos complementares e entrelaçados entre os fotorreceptores e o EPR. Especificamente, o EPR reduz seu metabolismo de substratos metabólicos fotorreceptores preferidos e, em vez disso, utiliza os subprodutos do metabolismo dos fotorreceptores combinados com os metabólitos que os fotorreceptores não consomem. Em doenças como RVP e DMRI, as evidências sugerem fortemente que o EPR se torna mais glicolítico e menos dependente do metabolismo mitocondrial; essa mudança para a glicólise do EPR pode privar os fotorreceptores dos metabólitos de que necessita, desencadeando a degeneração ^4,5,6. Dado o quão interdependentes são o EPR e o metabolismo dos fotorreceptores e o quanto o metabolismo alterado está subjacente à doença da retina, há um forte interesse em modelar e manipular o metabolismo do EPR para fins terapêuticos.

Embora o estudo do metabolismo mitocondrial do EPR in vivo seja ideal, muitos aspectos do metabolismo mitocondrial do EPR só podem ser investigados na prática em um sistema de cultura in vitro. Um progresso significativo em direção a culturas de EPR de alta fidelidade foi feito nas últimas décadas, a ponto de as culturas de EPR mais cuidadosamente preparadas agora estarem sendo usadas para terapia de reposição celular em ensaios clínicos em humanos⁷. Para manter essas culturas de alta fidelidade, o RPE precisa ser cultivado em substratos específicos em meios específicos por meses antes da experimentação. Com essas condições, as culturas de EPR são diferenciadas e polarizadas ao máximo, aproximando-se do EPR in vivo. Infelizmente, não há nenhum equipamento atualmente disponível que possa medir o metabolismo mitocondrial especificamente a partir do EPR in vivo. Embora o monitoramento de oxigênio da rede capilar da retina tenha sido obtido in vivo usando oximetria de ressonância paramagnética eletrônica (EPR)⁸, isso não é possível para a análise de RPE. As diferenças entre o metabolismo do EPR in vivo e in vitro não são bem descritas, mas as culturas de EPR demonstraram ter alta atividade mitocondrial, semelhante ao EPR in vivo ^3,9, sugerindo que uma visão significativa do metabolismo mitocondrial do EPR pode ser obtida usando culturas de EPR de alta fidelidade.

Como todo metabolismo mitocondrial leva ao consumo de oxigênio, medir as taxas de consumo de oxigênio (OCR) do EPR é um proxy fiel para o metabolismo mitocondrial. Medir o OCR em culturas de EPR tem sido difícil, pois as condições que promovem a polarização e diferenciação máximas do EPR muitas vezes impedem medições precisas de OCR de longo prazo com as técnicas atualmente disponíveis, como o Seahorse Analyzer. Neste artigo de métodos, é introduzido um novo dispositivo, denominado Resipher (doravante denominado "o sistema"), que permite a medição contínua de OCR ao longo de semanas em RPE cultivado sob condições que promovem ao máximo a polarização e a diferenciação. A facilidade com que o OCR pode ser medido por este sistema em condições de cultura de EPR que promovem ao máximo a diferenciação e polarização de EPR é única entre os dispositivos de medição de OCR existentes.

Este artigo fornece dicas e truques para usar o sistema com culturas de EPR, seguido por uma demonstração de duas aplicações específicas. Primeiro, o EMT do RPE, imitando o PVR, é desencadeado pela exposição ao fator de crescimento transformador beta (TGFβ) ^{1 , 10 , 11 , 12} . O sistema é usado para monitorar como o metabolismo do EPR evolui durante o processo de EMT. Em segundo lugar, o papel da hipóxia no metabolismo do EPR é explorado usando este sistema. A hipóxia é um importante contribuinte para a patogênese da DMRI, pois a coriocapilar diminui com a idade^13,14. A combinação desse sistema com câmaras de hipóxia permite modelar o metabolismo mitocondrial alterado do EPR com a hipóxia sutil que acompanha o envelhecimento. Finalmente, uma calculadora online usando dados do Resipher é introduzida para permitir determinar se as culturas de EPR estão em condições hipóxicas, normóxicas ou hiperóxicas. Essas informações são críticas para tirar conclusões sobre o metabolismo do EPR a partir de estudos de cultura de EPR in vitro.

Protocolo

Para protocolos para estabelecer culturas primárias humanas ou iPSC-RPE, consulte as seguintes referências 15,16,17,18. A aquisição e o uso de tecido humano para esses protocolos foram revisados e permitidos pelo Conselho de Revisão Institucional da Universidade de Michigan (HUM00105486).

1. Aplicação geral do sistema à cultura de EPR

1. Células-tronco pluripotentes induzidas por humanos (iPSC) derivadas de RPE ou células primárias de RPE humanas em placas de 96 poços compatíveis com o sistema.
   1. Assumindo culturas maduras já existentes cultivadas em placas de cultura de células de 24 poços, lave as células com solução salina tamponada com fosfato (PBS) uma vez e, em seguida, adicione 500 μL de tripsina-EDTA a 0,25% (Tabela de Materiais). Incube por 10-40 min em uma incubadora de cultura de células, verificando a cada 5-10 min até que as células estejam arredondadas e quase prontas para se soltar.
   2. Pipete suavemente o meio sobre as células para separá-las do plástico de cultura de células, seguido de transferência para 3x o volume de meio de cultura de células (1.500 μL por 24 poços), girando em uma centrífuga a 250 × g por 5 min em temperatura ambiente.
      NOTA: A receita para meios de cultura de células RPE está detalhada na Tabela 1 e disponível nas referências publicadas anteriormente 9,15,16,17,18.
   3. Ressuspenda as células em meios de cultura de células RPE com 15% de soro fetal bovino (FBS) e conte as células com um hemocitômetro.
   4. Semear 74.000 células para cada poço de uma placa de 96 poços (geralmente 225-300 × 10⁵ células/^cm2), após o revestimento com substratos de revestimento de matriz extracelular altamente especializados (Tabela de Materiais) seguindo as instruções do fabricante.
      NOTA: Células de sementes apenas em uma placa compatível com Resipher (Tabela de Materiais) e apenas em poços correspondentes ao conjunto de sondas na tampa de detecção (colunas 3, 4, 9 e 10 para a tampa de 32 canais; consulte a Tabela de Materiais). A tampa de detecção do sistema está disponível com sensores de 4, 32 ou 96 canais (consulte a localização dos sensores na Figura 1A-D), e uma variedade de placas de cultura de células padrão são compatíveis.
   5. Como os poços de borda são propensos à evaporação, o que afeta drasticamente a disponibilidade de oxigênio e, portanto, as leituras de OCR, evite semear células em todos os poços de borda (linhas A e H de uma placa de 96 poços). Além disso, adicione 200 μL de água estéril em cada um dos poços vazios da placa de 96 poços para reduzir os efeitos da evaporação.
   6. Mantenha a placa em uma superfície de mesa estável por 10 min para permitir que as células se assentem; em seguida, devolva-o à incubadora. Troque o meio após 24-72 h, substituindo por meios de cultura RPE padrão com 5% de FBS. Cultura por pelo menos 4 semanas, trocando de mídia 2x por semana.
      NOTA: As células estão prontas para experimentação quando são pigmentadas, paralelepípedos e altamente compactas (Figura 1E).
2. Configurando e adquirindo dados com o sistema
   1. Coloque a tampa de detecção em uma placa receptora vazia de 96 poços e, em seguida, coloque-a de volta na incubadora de cultura de células. Alinhe e monte o dispositivo na tampa de detecção e conecte-o ao hub por meio do cabo USB fornecido. Isso cria um "sanduíche" de Resipher. (Figura 2A).
   2. Acesse o aplicativo do site do Lucid Lab (https://lab.lucidsci.com/) e clique no botão Novo experimento no canto superior direito para criar um novo experimento.
   3. Nomeie o título do experimento e insira quaisquer notas experimentais relevantes para o estudo específico (por exemplo, número de passagem do iPSC-RPE que está usando).
   4. Crie boas condições e grupos de tratamento. Por exemplo, se estiver testando os efeitos de diferentes concentrações séricas na mídia no OCR, selecione Soro no nome do grupo e insira as concentrações de soro da mídia a serem usadas, adicionando mais valores percentuais de soro clicando no botão + . Atribua quais poços receberão uma porcentagem de soro específica e selecione um padrão de cores para esses poços. Adicione mais grupos (por exemplo, uma variável experimental diferente para testar) conforme necessário clicando no botão adicionar grupo .
   5. Defina a configuração da placa e selecione o dispositivo e o estilo de placa correspondentes. Clique no botão adicionar placa e escolha Dispositivo; Selecione o tipo de placa. Selecione o tratamento e clique no poço correspondente.
   6. Clique no botão Iniciar agora para iniciar o experimento. Verifique se o indicador no website e o LED no Hub estão verdes sólidos.
   7. Deixe o sistema funcionar por 15 a 60 minutos para garantir que cada sensor esteja devidamente calibrado e detecte com precisão o oxigênio atmosférico, que deve estar a uma concentração de ~ 200 μM em uma incubadora de cultura de células totalmente umidificada com 5% de CO₂ (Figura 2Bi).
      NOTA: Se algum dos sensores estiver mais de 20% fora da média dos outros sensores em uma configuração padrão de incubadora de cultura de células, considere excluir esse poço na análise de dados, pois o sensor está com defeito (Figura 2Bii).
      NOTA: Se todos os sensores estiverem mais de 20% fora da média dos outros sensores e do O₂ atmosférico esperado relatado como 200 μM em uma configuração padrão de incubadora de cultura de células, a tampa de detecção foi usada muitas vezes; substitua-o por uma nova tampa de detecção (Figura 2Biii).
      NOTA: Obter as leituras de O₂ no ar antes de iniciar um experimento melhora significativamente a solução de problemas posterior. Se um poço específico aparecer como um outlier após a realização de um experimento e esse poço tiver um sensor que estava fora de calibração, o problema pode estar no sensor, não na réplica biológica.
   8. Remova o dispositivo da tampa de detecção (mas não desconecte o cabo USB do dispositivo). Coloque o dispositivo de cabeça para baixo na incubadora para permitir que o motor do dispositivo seja reiniciado. Não reutilize o dispositivo até que todos os sons do motor tenham parado (aproximadamente 20-30 s).
      NOTA: É importante manter o dispositivo conectado ao hub por meio do cabo USB o tempo todo durante um experimento, mesmo quando o dispositivo estiver fora da tampa de detecção. Isso permite que o dispositivo monitore e relate continuamente o ambiente da incubadora de cultura de células.
   9. Coloque a placa com a tampa de detecção de volta na capa de cultura de células, junto com uma placa de 96 poços contendo as culturas de EPR. Troque o meio na placa com culturas de EPR com o mesmo meio e o mesmo volume para todos os poços para obter valores de OCR de linha de base para cada poço. Certifique-se de encher todos os poços sem EPR com água estéril para ajudar a evitar a evaporação.
      NOTA: Em geral, recomendamos 60-100 μL de meios de cultura RPE por 96 poços, com base em dados que demonstram que volumes de meio mais baixos levam à rápida depleção de nutrientes, mas volumes de meio mais altos levam à hipóxia inadvertida⁹.
   10. Transfira a tampa de detecção para a placa que contém as culturas de células e a tampa padrão (sem reserva) da placa que contém as culturas de células para a placa receptora vazia de 96 poços para manter a esterilidade da tampa padrão, que será necessária em vários pontos durante a experimentação.
   11. Coloque a placa com culturas de células e a tampa de detecção de volta na incubadora de cultura de células. Mais uma vez, alinhe e monte o dispositivo na tampa de detecção e conecte-o ao hub através do cabo USB fornecido (montando o "sanduíche"). Verifique se os indicadores na interface do site e no Hub estão todos verdes sólidos.
       NOTA: Os dados de concentração de O₂ aparecerão imediatamente, enquanto os dados de OCR só aparecerão depois que dados suficientes de O₂ forem coletados, aproximadamente 1 h.
   12. Deixe o dispositivo medir o OCR em cada poço por pelo menos 12-24 h para capturar um OCR de linha de base.
       NOTA: O OCR de linha de base será diferente dependendo de muitos fatores, incluindo o tipo de mídia que está sendo aplicada às células. Na Figura 2C, os meios de cultura RPE padrão com diferentes quantidades de FBS (0%, 5%, 15%) têm valores de OCR ligeiramente diferentes. Além disso, as culturas com mais FBS podem sustentar a atividade mitocondrial por mais tempo após a aplicação do meio às células antes que o OCR caia devido à depleção de metabólitos mitocondriais (lado direito da curva).
   13. Depois que um OCR de linha de base for obtido, repita as etapas 1.2.8 a 1.2.12, mas altere o meio na placa com culturas de EPR para as condições experimentais (normalmente, ± um medicamento ou uma comparação de diferentes condições de meio).
       NOTA: As alterações de mídia de rotina também podem ser tratadas da mesma maneira. Sempre que a incubadora de cultura de células for aberta, espere uma interrupção significativa nas leituras de OCR, pois elas dependem da temperatura, umidade, concentrações de CO₂ e outros fatores que são temporariamente interrompidos com a abertura da porta da incubadora. Durante qualquer remoção do dispositivo da tampa de detecção, não há necessidade de pausar o experimento online. Depois que a porta da incubadora de cultura de células é aberta ou o meio é trocado na placa que está sendo sondada, geralmente leva de 2 a 4 horas para restabelecer o gradiente de oxigênio e começar a medir um OCR preciso.
   14. Após a obtenção dos dados, subtraia o OCR basal para cada poço do OCR após a aplicação da condição experimental, para determinar o Delta OCR desencadeado pelo tratamento.
   15. Após a conclusão do experimento, esterilize e reutilize a tampa de detecção (que pode ser reutilizada de 3 a 5 vezes, embora o desempenho diminua com o uso repetido). Para esterilizar a tampa de detecção, mergulhe toda a tampa em etanol a 70% por 10 min em uma coifa de cultura de células, depois remova da imersão e descanse no gabinete com o lado da sonda para cima (evite tocar nas delicadas pontas da sonda) e deixe o etanol e a água evaporarem totalmente antes de colocar a tampa de detecção em uma nova placa receptora de 96 poços.
3. Tire imagens de campo claro para normalizar os valores de OCR para o número da célula.
   NOTA: O acúmulo de melanina no EPR facilita a normalização do OCR com base em uma simples contagem do número de células em culturas vivas usando um microscópio de campo claro.
   1. Remova o dispositivo e coloque-o de cabeça para baixo, como na etapa 1.2.8. Na coifa de cultura de células, troque a tampa de detecção na placa de cultura RPE por uma tampa padrão de 96 poços.
   2. Usando um microscópio invertido padrão, tire imagens de campo claro de cada poço.
      NOTA: Mantenha as imagens da área um consistentes entre os poços (localização relativa no poço e ampliação da objetiva).
   3. Na capela de cultura de células, substitua a tampa padrão de 96 poços na placa de cultura de EPR pela tampa de detecção e coloque-a de volta na incubadora para monitoramento adicional.
   4. Conte o número de células em cada poço com o ImageJ ou outro software.
   5. Normalize o OCR para o número de células nos diferentes grupos experimentais. O sistema relata o OCR em unidades de fmol∙(mm²)^-1∙^s-1-o consumo por área unitária da seção transversal. Portanto, para normalizar o OCR por célula, divida o OCR pela contagem de células por mm² (em vez da contagem de células por poço). Equivalentemente, multiplique o OCR relatado pelo sistema pela área da seção transversal do poço (cerca de 31 mm² para uma placa padrão de 96 poços) para produzir OCR em unidades de fmol∙^s-1∙^well-1.
4. Controles para determinação dos parâmetros bioenergéticos do EPR.
   NOTA: Para garantir que o sistema e as culturas de EPR estejam respondendo às manipulações mitocondriais de maneiras previsíveis, pode-se testar certas pequenas moléculas bem estabelecidas para atingir etapas específicas da fosforilação oxidativa mitocondrial. Esses testes são análogos às etapas realizadas em um Teste de Estresse Mitocondrial usando o Seahorse Analyzer¹⁰ e fornecem um perfil bioenergético para culturas de EPR.
   1. Cultive células RPE em 65 μL de meios de cultura RPE padrão com 5% de FBS e meça o OCR por 24 h para estabelecer uma linha de base.
   2. Aspire meios de cultura e adicione 65 μL de meios de cultura RPE padrão com 5% de FBS e com desacopladores mitocondriais (3 μM de cianeto de carbonila-p-trifluorometoxifenilhidrazona [FCCP] ou 500 nM Bam15, Tabela de Materiais). Incubar durante a noite.
      NOTA: Os desacopladores mitocondriais devem aumentar significativamente o OCR. Certifique-se de que o OCR aumentado não seja igual ou próximo ao OCR máximo teórico limitado à difusão de aproximadamente 275 fmol∙(mm²)^-1∙^s-1 para 65 μL de meio em condições de cultura padrão. O OCR máximo para diferentes volumes de mídia comumente usados está disponível na seção Discussão.
   3. Após a incubação durante a noite, aspire o meio com desacopladores mitocondriais e substitua por 65 μL de meio de cultura RPE padrão com 5% de FBS. Observe a placa por mais 24 h para determinar a recuperação do RPE OCR após a remoção dos medicamentos.
   4. Calcule os efeitos dos desacopladores no OCR subtraindo o OCR obtido após o tratamento do OCR obtido antes do tratamento (Figura 3).
      NOTA: O aumento do OCR com a adição de desacopladores mitocondriais significa a capacidade respiratória mitocondrial de reserva da célula¹⁹.
   5. Para medir outros parâmetros mitocondriais normalmente capturados durante o Teste de Estresse Mitocondrial com um Analisador de Cavalos-Marinhos, execute as mesmas etapas acima com os seguintes compostos (Figura 4).
      1. Use oligomicina a 1 μM para avaliar a respiração ligada ao ATP.
      2. Use antimicina A e rotenona a 1 μM para avaliar qualquer respiração não mitocondrial.
         NOTA: FCCP, oligomicina, antimicina A e rotenona podem ser tóxicos para o EPR. Se induzirem morte celular significativa, as medições de OCR não serão precisas. Assim, as medições de OCR devem ser obtidas apenas em um momento em que não haja morte celular óbvia, geralmente nas primeiras horas após a adição dos medicamentos (Figura 4).

2. Medição de alterações no metabolismo mitocondrial em EPR submetidos a EMT

1. Siga o mesmo protocolo descrito na seção 1.2.
2. Para induzir a EMT após obter as medições de OCR basais, adicione TGF-β2 (10 ng/mL) às culturas de EPR e monitore o OCR por 3 semanas. Atualize a mídia com TGFβ2 novo a cada 2-3 dias (Figura 5).
3. Pelo menos 2x por semana, obtenha imagens de campo claro como na seção 1.3 para garantir que a contagem de células não esteja mudando. Se a contagem mudar, normalize os valores de OCR para o número de células em cada poço.
   NOTA: O mesmo protocolo pode ser usado para outros indutores de EMT para monitorar alterações de OCR de longo prazo durante todo o período de cultura enquanto as células estão na incubadora.

3. Medição de alterações no metabolismo mitocondrial em EPR hipóxico

NOTA: A aplicação do sistema em condições hipóxicas, normóxicas ou hiperóxicas é a mesma da seção 1.2, exceto para manter o "sanduíche" em uma câmara de hipóxia (Tabela de Materiais) colocada em uma incubadora de cultura de células padrão.

1. Faça um furo na tampa da câmara de hipóxia para montar o cabo USB tipo c e selá-lo com silicone ou massa (Figura 6A).
2. Monte a tampa de detecção com a placa de cultura de células no exaustor e transfira-as para a câmara de hipóxia.
3. Configure o "sanduíche" (placa, tampa de detecção, dispositivo) na câmara de hipóxia. Coloque também na câmara de hipóxia uma placa de Petri com água estéril para ajudar a manter a umidade. Por fim, coloque um sensor portátil de O₂ na câmara de hipóxia (Tabela de Materiais). A configuração é exibida na Figura 6A.
4. Sele a câmara e conecte-a a um cilindro de gás com concentração hipóxica de O₂ e concentração padrão de cultura de células de CO₂ (por exemplo, 1% de O₂ e 5% de CO₂).
5. Troque lentamente o ar na câmara de hipóxia pelo ar de 1% O₂/5% CO₂ no cilindro até que o sensor de oxigênio mostre a concentração de O₂ desejada, geralmente entre 1% e 10%.
   NOTA: O sensor portátil de O₂ requer tempo para se equilibrar, portanto, o gás do cilindro deve ser adicionado à câmara de hipóxia lentamente.
6. Feche as válvulas de entrada e saída da câmara de hipóxia e transfira toda a câmara para a incubadora.
7. Configure e inicie o experimento como na seção 1.2.
   NOTA: O meio de pré-equilíbrio na câmara de hipóxia antes de adicionar às células pode diminuir o tempo que leva para a monocamada celular experimentar hipóxia verdadeira (Figura 6B).

4. Calcular a concentração de O₂ na monocamada de EPR para determinar se as células estão em condições hipóxicas, normóxicas ou hiperóxicas

NOTA: O sistema mede a concentração de O₂ entre aproximadamente 1 a 1,5 mm acima do fundo do poço por padrão, assumindo que uma placa padrão é usada com a tampa de detecção recomendada correspondente para cultura de monocamada (consulte https://lucidsci.com/docs/LucidScientific_Sensing_Lid_Selection_Guide.pdf). Embora a concentração de O₂ na monocamada da célula não seja medida diretamente, os dados do sistema podem ser usados para estimar a concentração de O₂ no nível do RPE. Especificamente, sabendo que existe um gradiente de oxigênio entre a parte superior da coluna de mídia, onde O₂ está disponível, e a parte inferior da coluna de mídia, onde O₂ está sendo consumido, as Leis de Difusão de Fick podem ser combinadas com a taxa de OCR medida para extrapolar os níveis de O₂ na monocamada da célula. Uma calculadora para essa estimativa é fornecida online: https://lucidsci.com/notes?entry=oxygen_diffusion (e na forma de um caderno interativo de código aberto em https://observablehq.com/@lucid/oxygen-diffusion-and-flux-in-cell-culture, o código-fonte desta calculadora pode ser encontrado em https://github.com/lucidsci/oxygen-diffusion-calculator).

1. Assim que a calculadora for acessada, insira o volume do meio em microlitros (por exemplo, 100 μL).
2. Insira a concentração de oxigênio saturado na interface ar-líquido (a parte superior da coluna de mídia acima das células). Este valor é ~185 μM à pressão atmosférica padrão com 5% de O₂ e 95% de umidade.
   NOTA: Isso também pode ser determinado a partir de medições de O₂ por sondas do sistema em poços somente de mídia (sem células no fundo do poço).
3. Na entrada Flux, insira o Flux/OCR relatado pelo sistema.
4. Com base nesses valores, a concentração de oxigênio no estado estacionário em cada altura na coluna de mídia é calculada e mostrada no gráfico (Figura 7). O eixo x da parcela é a altura em mm acima do fundo do poço. O eixo y é a concentração calculada de O₂ a essa altura (em μM).
5. A concentração de O₂ no fundo do poço (onde estão as células) é indicada na linha abaixo do gráfico.
   NOTA: Em geral, estima-se que o EPR in vivo tenha uma concentração de O₂ de 4-9%. Cada 10 μM de O₂ em condições atmosféricas padrão corresponde a aproximadamente 1% de O₂. Assim, a normóxia ao nível das células é de aproximadamente 40-90 μM de O₂. Quanto mais alta a coluna de mídia, menor será o O₂ no nível da monocamada^{RPE 9}. Assim, se as células parecerem estar em condições hipóxicas, o volume do meio pode ser reduzido. Se as células parecerem estar em condições hiperóxicas, o volume do meio pode ser aumentado.

Resultados

A configuração "sanduíche" para o experimento Resipher é demonstrada na Figura 2A. Tampas de detecção com 32 sondas correspondentes às colunas 3, 4, 9 e 10 na placa de 96 poços ficam entre a placa da célula e o dispositivo. Depois de conectar ao Hub, o dispositivo ativa os motores para mover a tampa de detecção para cima e para baixo, medindo a concentração de O₂ na coluna de mídia em uma faixa de alturas acima da monocamada da célula (normalmente 1-1.5 mm). O gradi...

Discussão

O metabolismo mitocondrial do EPR desempenha um papel crítico na patogênese de doenças retinianas comuns que causam cegueira, incluindo DMRI e RVP. A modelagem do metabolismo mitocondrial do EPR in vitro permite isolar seu estado metabólico daqueles dos tecidos circundantes, além de submeter o tecido a diferentes insultos simuladores de doenças de maneira controlada. Essa modelagem in vitro do metabolismo mitocondrial do EPR foi facilitada pelo advento de culturas primárias humanas e iPSC-RPE de ...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.25% Trypsin-EDTA	Gibco	#25-200-056
3,3',5-triiodo-L-thyronine sodium salt	Sigma	T5516
32-channel Resipher lid	Lucid Scientific	NS32-101A for Falcon
Antimycin A from streptomyces sp.	Sigma	A8674-25MG	Inhibitor of Complex III of the electron transport chain
BAM15	Sigma	SML1760-5MG	Uncoupling agent to increase mitochondrial respiration
DMSO, cell culture grade	Sigma-aldrich	D4540-100ML	Vehicle for reconstituting mitochondrial drugs
Extracellular matrix coating substrates: Synthemax II-SC	Corning	#3535	Extracellular matrix for hfRPE
Extracellular matrix coating substrates: Vitronectin	Gibco	A14700	Extracellular matrix for iPSC-RPE
FCCP	Sigma	C2920-10MG	Uncoupling agent to increase mitochondrial respiration
Fetal Bovine Serum (Bio-Techne S11550H)	Bio-Techne	S11550H
Hydrocortisone-Cyclodextrin	Sigma	H0396
Hypoxia chamber	Embrient Inc.	MIC-101
N1 Media Supplement	Sigma	N6530
Non-Essential Amino Acids Solution	Gibco	11140050
O2 sensor	Sensit technology or Forensics Detectors	P100 or FD-90A-O2
Penicillin-Streptomycin	Gibco	15140-122
Recombinant human TGFβ2	Peprotech	100-35B	Transforming growth factor beta-2 to induce epithelial-mesenchymal transition
Rotenone	Sigma	R8875-1G	Inhibitor of Complex I of the electron transport chain
System-compatible plate	Corning	#353072
Taurine	Sigma	T8691
αMEM (Alpha Modification of Eagle's Media)	Corning	15-012-CV