АВТОРЫ
СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

Войдите в систему

Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

Мы представляем новое устройство для измерения скорости потребления кислорода (OCR) в культурах пигментного эпителия сетчатки (RPE). Устройство может измерять OCR в течение нескольких недель на RPE, выращенном на стандартных планшетах для клеточных культур со стандартной средой, пока планшеты находятся в стандартном инкубаторе для клеточных культур.

Аннотация

Метаболизм митохондрий имеет решающее значение для нормального функционирования пигментного эпителия сетчатки (РПЭ), монослоя клеток сетчатки, важного для выживания фоторецепторов. Митохондриальная дисфункция РПЭ является отличительной чертой возрастной макулярной дегенерации (ВМД), ведущей причины необратимой слепоты в развитых странах, и пролиферативной витреоретинопатии (ПВР), ослепляющего осложнения отслойки сетчатки. Дегенеративные состояния РПЭ были хорошо смоделированы культуральными системами РПЭ, которые являются высокодифференцированными и поляризованными для имитации РПЭ in vivo . Тем не менее, мониторинг скорости потребления кислорода (OCR), показателя функции митохондрий, был затруднен в таких культуральных системах, поскольку условия, способствующие идеальной поляризации и дифференцировке RPE, не позволяют легко измерить OCR.

В данной работе мы представляем новую систему Resipher для мониторинга OCR в течение нескольких недель в хорошо дифференцированных культурах RPE при одновременном поддержании RPE на оптимальных субстратах роста и физиологических питательных средах в стандартном инкубаторе для клеточных культур. Эта система рассчитывает OCR путем измерения градиента концентрации кислорода, присутствующего в средах над клетками. Мы обсудим преимущества этой системы перед другими методами обнаружения ОРС и как настроить систему измерения ОРС в культурах СНЭ. Мы рассмотрим основные советы и рекомендации по использованию системы, предостережения при интерпретации данных и рекомендации по устранению непредвиденных результатов.

Мы также предоставляем онлайн-калькулятор для экстраполяции уровня гипоксии, нормоксии или гипероксии в культурах РПЭ на основе градиента кислорода в средах над клетками, обнаруженными системой. Наконец, мы рассмотрим два применения системы: измерение метаболического состояния клеток RPE в модели PVR и понимание того, как RPE метаболически адаптируется к гипоксии. Мы ожидаем, что использование этой системы на высокополяризованных и дифференцированных культурах РПЭ улучшит наше понимание митохондриального метаболизма РПЭ как в физиологических, так и в болезненных состояниях.

Введение

Пигментный эпителий сетчатки (РПЭ) представляет собой монослой функционально постмитотических, высокополяризованных эпителиальных клеток, которые образуют барьер между светочувствительными фоторецепторами в сетчатке и их кровообращением, капиллярное ложе, называемое хориокапиллярами. Как и нейроны, поддерживающие глию, RPE выполняет множество функций для поддержки фоторецепторов, включая фагоцитоз внешних сегментов фоторецепторов, транспорт питательных веществ и метаболическую поддержку фоторецепторов, а также секрецию основных факторов роста, которые имеют решающее значение для поддержания зрительной функции.

Дегенерация РПЭ лежит в основе нескольких распространенных дегенеративных расстройств зрения. При возрастной макулярной дегенерации (ВМД), одной из наиболее распространенных причин неизлечимой потери зрения в мире, РПЭ погибает, и поэтому вышележащие фоторецепторы страдают вторичной дегенерацией. При пролиферативной витреоретинопатии (ПВР) РПЭ вместо этого выходит из своего обычно спокойного постмитотического состояния, пролиферируя и дедифференцируя в мезенхимальное состояние (так называемый эпителиально-мезенхимальный переход [ЭМП]) с изменениями в своем метаболизме. Дедифференцировка РПЭ приводит к потере поддержки РПЭ для фоторецепторов, а также вызывает более фиброзное состояние. Это приводит как к дегенерации фоторецепторов, так и к рубцеванию, вызванному РПЭ, что приводит к потере зрения 1,2.

Основная часть поддержки фоторецепторов РПЭ является метаболической, а метаболическая дисрегуляция является критическим фактором при многочисленных заболеваниях сетчатки, включая ВМД и ПВР. РПЭ служит регуляторным барьером между фоторецепторами и их источником кислорода и питательных веществ, хориокапиллярами. Таким образом, то, что РПЭ выбирает для метаболизма, в отличие от того, через что РПЭ выбирает для прохождения от хориокапилляров к фоторецепторам, в значительной степени определяет метаболизм и выживание фоторецепторов. Многочисленные исследования показали, что РПЭ в значительной степени зависит от метаболизма митохондрий для своего нормального здоровья, и что фоторецепторы в значительной степени зависят от гликолиза3. Это привело к появлению концепции комплементарных, переплетенных метаболических состояний между фоторецепторами и РПЭ. В частности, РПЭ снижает метаболизм предпочтительных метаболических субстратов фоторецепторов и вместо этого использует побочные продукты метаболизма фоторецепторов в сочетании с метаболитами, которые фоторецепторы не потребляют. При таких заболеваниях, как ПВР и ВМД, данные убедительно свидетельствуют о том, что РПЭ становится более гликолитическим и менее зависимым от митохондриального метаболизма; этот сдвиг в сторону гликолиза RPE может лишить фоторецепторы необходимых метаболитов, вызывая дегенерацию 4,5,6. Учитывая, насколько взаимозависимы метаболизм РПЭ и фоторецепторов и насколько измененный метаболизм лежит в основе заболевания сетчатки, существует большой интерес к моделированию и манипулированию метаболизмом РПЭ в терапевтических целях.

В то время как изучение митохондриального метаболизма РПЭ in vivo является идеальным, многие аспекты митохондриального метаболизма РПЭ могут быть практически исследованы только в системе культивирования in vitro. За последние несколько десятилетий был достигнут значительный прогресс в области высокоточных культур РПЭ, вплоть до того, что наиболее тщательно ухоженные культуры РПЭ в настоящее время используются для заместительной клеточной терапии в клинических испытаниях на людях7. Для поддержания таких высокоточных культур RPE необходимо выращивать на определенных субстратах в определенных средах в течение нескольких месяцев до экспериментов. При таких условиях культуры РПЭ максимально дифференцируются и поляризуются, аппроксимируя in vivo РПЭ. К сожалению, в настоящее время не существует оборудования, которое могло бы измерить метаболизм митохондрий конкретно из РПЭ in vivo. В то время как кислородный мониторинг капиллярной сети сетчатки был достигнут in vivo с помощью оксиметрии электронного парамагнитного резонанса (ЭПР)8, это невозможно для анализа РПЭ. Различия между метаболизмом РПЭ in vivo и in vitro не очень хорошо описаны, но было показано, что культуры РПЭ обладают высокой митохондриальной активностью, аналогичной РПЭ in vivo 3,9, что позволяет предположить, что значительное понимание митохондриального метаболизма РПЭ может быть получено с помощью высокоточных культур РПЭ.

Поскольку весь митохондриальный метаболизм приводит к потреблению кислорода, измерение скорости потребления кислорода RPE (OCR) является верным показателем митохондриального метаболизма. Измерение OCR в культурах RPE было затруднено, поскольку условия, способствующие максимальной поляризации и дифференцировке RPE, часто исключают долгосрочные точные измерения OCR с помощью доступных в настоящее время методов, таких как анализатор морских коньков. В данной работе по методам представлено новое устройство, получившее название Resipher (далее именуемое «система»), которое позволяет непрерывно измерять OCR в течение нескольких недель в RPE, выращенных в условиях, максимально способствующих поляризации и дифференцировке. Легкость, с которой OCR может быть измерена этой системой в условиях культуры RPE, которые максимально способствуют дифференциации и поляризации RPE, уникальна среди существующих устройств для измерения OCR.

В этом документе содержатся советы и рекомендации по использованию системы с культурами RPE, а также демонстрация двух конкретных приложений. Во-первых, ЭМП РПЭ, имитирующий ПВР, запускается воздействием трансформирующего фактора роста-бета (TGFβ)1,10,11,12. Система используется для мониторинга того, как развивается метаболизм РПЭ в процессе ЭМП. Во-вторых, роль гипоксии в метаболизме РПЭ исследуется с помощью этой системы. Гипоксия является важным фактором патогенеза ВМД, так как хориокапилляры истончаются с возрастом 13,14 лет. Сочетание этой системы с камерами гипоксии позволяет моделировать измененный митохондриальный метаболизм RPE с тонкой гипоксией, которая сопровождает старение. Наконец, вводится онлайн-калькулятор с использованием данных Резифера, позволяющий определить, находятся ли культуры РПЭ в гипоксических, нормоксических или гипероксических условиях. Такая информация имеет решающее значение для того, чтобы сделать какие-либо выводы о метаболизме РПЭ на основе исследований культуры РПЭ in vitro.

протокол

Протоколы для определения первичных культур человека или культуры iPSC-RPE см. в следующих ссылках 15,16,17,18. Получение и использование человеческих тканей для этих протоколов было рассмотрено и одобрено Институциональным наблюдательным советом Мичиганского университета (HUM00105486).

1. Общее применение системы к культуре СИЗД

  1. Пластинчатые индуцированные плюрипотентные стволовые клетки человека (ИПСК) производные РПЭ или первичные клетки РПЭ человека в системно-совместимых 96-луночных планшетах.
    1. Предполагая, что уже существуют зрелые культуры, выращенные на 24-луночных клеточных планшетах, промойте клетки фосфатно-солевым буфером (PBS) один раз, а затем добавьте 500 мкл 0,25% трипсина-ЭДТА (Таблица материалов). Инкубируйте в течение 10-40 минут в инкубаторе для клеточных культур, проверяя каждые 5-10 минут, пока клетки не округлятся и не будут почти готовы к отделению.
    2. Осторожно нанесите пипетку на клетки, чтобы отделить их от пластика клеточной культуры, после чего переместите в 3-кратный объем среды для клеточных культур (1500 μл на 24-лунку), вращая в центрифуге при 250 × г в течение 5 минут при комнатной температуре.
      Примечание: Рецептура питательных сред для клеточных культур RPE подробно изложена в таблице 1 и доступна в ранее опубликованных ссылках 9,15,16,17,18.
    3. Ресуспендируйте клетки в питательных средах для клеточных культур RPE с 15% фетальной бычьей сывороткой (FBS) и подсчитайте клетки с помощью гемоцитометра.
    4. Затравите 74 000 клеток в каждую лунку 96-луночного планшета (обычно 225-300 × 105 клеток/см2) после покрытия высокоспециализированными субстратами из внеклеточного матрикса (Таблица материалов) в соответствии с инструкциями производителя.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Затравочные ячейки только на совместимой с Резифером пластине (Таблица материалов) и только в лунках, соответствующих матрице зондов на чувствительной крышке (столбцы 3, 4, 9 и 10 для 32-канальной крышки; см. Таблицу материалов). Чувствительная крышка системы доступна с 4-, 32- или 96-канальными датчиками (см. расположение датчиков на рисунке 1A-D), а также совместим ряд стандартных планшетов для клеточных культур.
    5. Поскольку краевые лунки подвержены испарению, что значительно влияет на доступность кислорода и, следовательно, на показания OCR, избегайте засева ячеек на всех краевых лунках (ряды A и H 96-луночной пластины). Кроме того, добавьте 200 мкл стерильной воды в каждую из пустых лунок 96-луночного планшета, чтобы уменьшить эффект испарения.
    6. Подержите тарелку на устойчивой поверхности стола в течение 10 минут, чтобы ячейки осели; Затем верните его в инкубатор. Смените среду через 24-72 ч, заменив ее на стандартные питательные среды РПЭ с 5% FBS. Культивируйте не менее 4 недель, меняя носители 2 раза в неделю.
      Примечание: Клетки готовы к экспериментам, когда они пигментированы, булыжники и очень компактны (рисунок 1E).
  2. Настройка и получение данных с помощью системы
    1. Поместите чувствительную крышку на пустую 96-луночную приемную пластину, а затем поместите ее обратно в инкубатор для клеточных культур. Выровняйте и закрепите устройство на чувствительной крышке и подключите его к концентратору с помощью прилагаемого USB-кабеля. В результате получается «бутерброд » Ресифера (Рисунок 2А).
    2. Перейдите на веб-сайт приложения Lucid lab (https://lab.lucidsci.com/) и нажмите кнопку «Новый эксперимент » в правом верхнем углу, чтобы создать новый эксперимент.
    3. Назовите название эксперимента и введите любые соответствующие экспериментальные примечания для конкретного исследования (например, номер прохода используемого iPSC-RPE).
    4. Создание скважинных условий и групп обработки. Например, при тестировании влияния различных концентраций сыворотки в среде на OCR выберите «Сыворотка » в названии группы, затем введите концентрации сыворотки среды, которые будут использоваться, добавив дополнительные значения процента сыворотки, нажав кнопку «+ ». Назначьте, в какие лунки будет поступать определенный процент сыворотки, и выберите цветовой шаблон для этих лунок. При необходимости добавьте больше групп (например, другую экспериментальную переменную для тестирования), нажав кнопку добавления группы .
    5. Определите настройку пластины и выберите соответствующее устройство и стиль пластины. Нажмите кнопку «Добавить пластину » и выберите «Устройство»; Выберите тип пластины. Выберите лечение и нажмите на соответствующую лунку.
    6. Нажмите кнопку «Начать сейчас », чтобы начать эксперимент. Убедитесь, что индикатор на сайте и светодиод на хабе горят зеленым цветом.
    7. Дайте системе поработать в течение 15-60 минут, чтобы убедиться, что каждый датчик правильно откалиброван и точно обнаруживает атмосферный кислород, который должен быть в концентрации ~200 мкМ в полностью увлажненном инкубаторе для клеточных культур с 5%CO2 (Рисунок 2Bi).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Если какой-либо из датчиков отличается более чем на 20% от среднего значения других датчиков в стандартной установке инкубатора для клеточных культур, рассмотрите возможность исключения этого колодца из анализа данных, так как датчик неисправен (Рисунок 2Bii).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Если все датчики более чем на 20% отклоняются от среднего значения других датчиков и от ожидаемого атмосферногоO2 , зарегистрированного как 200 мкМ в стандартной конфигурации инкубатора для клеточных культур, то чувствительная крышка использовалась слишком много раз; замените его на новую чувствительную крышку (Рисунок 2Biii).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Получение показаний O2 в воздухе до начала эксперимента значительно улучшает поиск и устранение неисправностей впоследствии. Если после проведения эксперимента определенная скважина выглядит как выброс и в этой скважине был датчик, который не был откалиброван, проблема может быть связана с датчиком, а не с биологической репликой.
    8. Извлеките устройство из крышки датчика (но не отсоединяйте USB-кабель от устройства). Поместите устройство в инкубатор вверх дном, чтобы двигатель на устройстве мог перезагрузиться. Не используйте Устройство повторно до тех пор, пока не прекратятся все звуки двигателя (примерно 20-30 с).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Важно постоянно держать устройство подключенным к концентратору через USB-кабель во время эксперимента, даже когда устройство снято с чувствительной крышки. Это позволяет устройству осуществлять непрерывный мониторинг и составлять отчеты о среде инкубатора для клеточных культур.
    9. Поместите планшет с чувствительной крышкой обратно в колпак для клеточных культур вместе с 96-луночным планшетом, содержащим культуры RPE. Измените среду в планшете с культурами RPE с той же средой и одним и тем же объемом для всех скважин, чтобы получить исходные значения OCR для каждой скважины. Обязательно заполните все лунки без СИЗД стерильной водой, чтобы предотвратить испарение.
      ПРИМЕЧАНИЕ: В целом, мы рекомендуем 60-100 мкл питательных сред RPE на 96-лунку, основываясь на данных, демонстрирующих, что меньшие объемы среды приводят к быстрому истощению питательных веществ, а более высокие объемы среды приводят к непреднамеренной гипоксии.
    10. Перенесите чувствительную крышку на планшет, содержащий клеточные культуры, и стандартную (не резиферную) крышку на планшете, содержащем клеточные культуры, на пустую 96-луночную приемную пластину для поддержания стерильности стандартной крышки, которая потребуется в различные моменты эксперимента.
    11. Поместите планшет с клеточными культурами и чувствительную крышку обратно в инкубатор для клеточных культур. Еще раз совместите и закрепите Устройство на чувствительной крышке и подключите его к Хабу через прилагаемый USB-кабель (собрав «бутерброд»). Убедитесь, что индикаторы на интерфейсе сайта и в хабе горят зеленым цветом.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Данные о концентрацииO2 появятся сразу, в то время как данные OCR появятся только после того, как будет собрано достаточное количество данныхO2 , примерно через 1 час.
    12. Дайте устройству измерить OCR на каждой скважине в течение не менее 12-24 часов, чтобы зафиксировать исходное OCR.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Исходное OCR будет отличаться в зависимости от многих факторов, в том числе от типа среды, наносимой на клетки. На рисунке 2C стандартные питательные среды RPE с разным количеством FBS (0%, 5%, 15%) имеют несколько отличающиеся значения OCR. Кроме того, культуры с большим количеством FBS могут дольше поддерживать митохондриальную активность после нанесения среды на клетки до того, как OCR упадет из-за истощения митохондриальных метаболитов (правая сторона кривой).
    13. После того, как исходный уровень OCR получен, повторите шаги 1.2.8-1.2.12, но измените среду на планшете с культурами RPE в соответствии с вашими экспериментальными условиями (как правило, ± лекарственным препаратом или сравнением различных условий среды).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Рутинная смена носителей также может быть обработана таким же образом. В любое время, когда инкубатор для клеточных культур открывается, ожидайте значительных нарушений в показаниях OCR, поскольку они зависят от температуры, влажности, концентрацииCO2 и других факторов, которые временно нарушаются при открытии дверцы инкубатора. Во время любого снятия Прибора с чувствительной крышки нет необходимости приостанавливать эксперимент в режиме онлайн. После того, как дверца инкубатора для клеточных культур открыта или среда заменена на зондируемой пластине, обычно требуется 2-4 часа, чтобы восстановить градиент кислорода и начать измерение точного OCR.
    14. После получения данных вычтите исходный уровень OCR для каждой скважины из OCR после применения экспериментального условия, чтобы определить Delta OCR , вызванный обработкой.
    15. После завершения эксперимента простерилизуйте и повторно используйте чувствительную крышку (которую можно использовать повторно 3-5 раз, хотя производительность ухудшается при повторном использовании). Чтобы простерилизовать чувствительную крышку, погрузите всю крышку в 70% этанол на 10 минут в колпак для клеточных культур, затем снимите с погружения и положите на зонд шкафа стороной вверх (не касайтесь тонких наконечников зонда) и дайте этанолу и воде полностью испариться, прежде чем надевать чувствительную крышку на новую 96-луночную приемную пластину.
  3. Делайте снимки светлого поля для нормализации значений OCR по номеру ячейки.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Накопление меланина в РПЭ способствует нормализации OCR на основе простого подсчета количества клеток в живых культурах с помощью светлопольного микроскопа.
    1. Снимите устройство и положите его вверх дном, как в пункте 1.2.8. В колпаке для клеточных культур замените чувствительную крышку на планшете для культивирования RPE на стандартную 96-луночную крышку.
    2. С помощью стандартного инвертированного микроскопа сделайте светлопольные снимки каждой лунки.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Следите за тем, чтобы изображения области один были одинаковыми между лунками (относительное расположение в лунке и увеличение объектива).
    3. В колпаке для клеточных культур замените стандартную 96-луночную крышку на планшете для культивирования РПЭ на чувствительную крышку и поместите его обратно в инкубатор для дальнейшего мониторинга.
    4. Подсчитайте номер ячейки в каждой лунке с помощью ImageJ или другого программного обеспечения.
    5. Нормализуйте OCR по номеру клеток в различных экспериментальных группах. Система сообщает OCR в единицах фмоль∙(мм2)-1∙с-1-расход на единицу площади поперечного сечения. Следовательно, чтобы нормализовать OCR для каждой клетки, разделите OCR на количество клеток на мм2 (а не на количество клеток на лунку). Аналогично, умножьте OCR, сообщаемые системой, на площадь поперечного сечения скважины (около 31мм2 для стандартной 96-луночной пластины), чтобы получить OCR в единицах fmol∙s-1∙well-1.
  4. Средства управления для определения биоэнергетических параметров РПЭ.
    Примечание: Чтобы убедиться, что система и культуры RPE реагируют на митохондриальные манипуляции предсказуемым образом, можно протестировать определенные малые молекулы, хорошо зарекомендовавшие себя для нацеливания на определенные этапы митохондриального окислительного фосфорилирования. Эти тесты аналогичны этапам, выполняемым в митохондриальном стресс-тесте с использованием анализатора морских коньков10 , и обеспечивают биоэнергетический профиль для культур РПЭ.
    1. Культивируйте клетки RPE в 65 мкл стандартной питательной среды RPE с 5% FBS и измеряйте OCR в течение 24 ч для установления исходного уровня.
    2. Аспиратируйте культивируемые среды и добавьте 65 мкл стандартных питательных сред RPE с 5% FBS и с митохондриальными разъединителями (3 мкМ карбонильцианид--трифторметоксифенилгидразон [FCCP] или 500 нМ Bam15, таблица материалов). Высиживайте в течение ночи.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Митохондриальные разъединители должны значительно увеличивать OCR. Убедитесь, что повышенное OCR не находится на уровне или близко к теоретическому максимальному OCR-ограничению диффузии, составляющему приблизительно 275 фоль∙(мм2)-1∙с-1 для 65 μл среды в стандартных условиях культивирования. Максимальное OCR для различных часто используемых объемов носителей доступно в разделе Обсуждение.
    3. После ночной инкубации аспирируйте среду с помощью митохондриальных развязывателей и замените 65 мкл стандартной питательной среды RPE с 5% FBS. Наблюдайте за планшетом в течение еще 24 ч, чтобы определить восстановление РПЭ OCR после удаления лекарственных препаратов.
    4. Рассчитайте влияние разъединителей на OCR путем вычитания OCR, полученного после лечения, из OCR, полученного до обработки (рис. 3).
      Примечание: Увеличение OCR с добавлением митохондриальных разъединителей означает резервную митохондриальную дыхательную способность клетки19.
    5. Чтобы измерить другие митохондриальные параметры, обычно регистрируемые во время митохондриального стресс-теста с помощью анализатора морских коньков, выполните те же шаги, что и выше, со следующими соединениями (рис. 4).
      1. Используйте олигомицин в концентрации 1 мкМ для оценки АТФ-сцепленного дыхания.
      2. Используйте антимицин А и ротенон в концентрации 1 мкМ для оценки любого немитохондриального дыхания.
        ПРИМЕЧАНИЕ: ФКХП, олигомицин, антимицин А и ротенон могут быть токсичными для СИЗД. Если они вызывают значительную гибель клеток, то измерения OCR не будут точными. Таким образом, измерения OCR должны быть получены только в тот момент времени, когда нет очевидной гибели клеток, как правило, в течение первых нескольких часов после добавления лекарств (рис. 4).

2. Измерение изменений в митохондриальном метаболизме в РПЭ при проведении ЭМП

  1. Следуйте тому же протоколу, который описан в разделе 1.2.
  2. Чтобы индуцировать ЭМП после получения исходных измерений OCR, добавьте TGF-β2 (10 нг/мл) в культуры RPE и контролируйте OCR в течение 3 недель. Обновляйте носитель свежим TGFβ2 каждые 2-3 дня (Рисунок 5).
  3. Не реже 2 раз в неделю получайте светлопольные изображения, как описано в разделе 1.3, чтобы убедиться, что количество клеток не меняется. Если количество меняется, нормализуйте значения OCR в соответствии с номером ячейки в каждой лунке.
    Примечание: Тот же протокол может быть использован для других индукторов ЭМП для мониторинга долгосрочных изменений OCR в течение периода культивирования, пока клетки находятся в инкубаторе.

3. Измерение изменений в митохондриальном метаболизме при гипоксическом РПЭ

Применение системы в условиях гипоксии, нормоксии или гипероксии аналогично применению в разделе 1.2, за исключением хранения «бутерброда» в камере для гипоксии (Таблица материалов), помещенной в стандартный инкубатор для клеточных культур.

  1. Просверлите отверстие на крышке камеры гипоксии для крепления кабеля USB type-c и заклейте его силиконом или шпаклевкой (рисунок 6А).
  2. Соберите чувствительную крышку с планшетом для культивирования клеток в колпаке и перенесите их в камеру гипоксии.
  3. Установите «бутерброд» (пластину, чувствительную крышку, прибор) в камеру гипоксии. Также поместите в камеру гипоксии чашку Петри со стерильной водой, чтобы помочь поддерживать влажность. Наконец, поместите портативный датчик О2 в камеру гипоксии (Таблица материалов). Настройка показана на рисунке 6A.
  4. Загерметизируйте камеру и подключите ее к газовому баллону с гипоксической концентрациейО2 и стандартной концентрацией клеточной культурыСО2 (например, 1%О2 и 5%СО2).
  5. Медленно обменивайте воздух в камере гипоксии с воздухом 1% O2/5% CO2 в баллоне до тех пор, пока датчик кислорода не покажет желаемую концентрацию O2 , обычно где-то между 1% и 10 %.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Портативный датчик O2 требует времени для балансировки, поэтому газ из баллона следует добавлять в камеру гипоксии медленно.
  6. Закройте входной и выходной клапаны камеры гипоксии и перенесите всю камеру в инкубатор.
  7. Настройте и запустите эксперимент, как описано в разделе 1.2.
    Примечание: Предварительное уравновешивание среды в камере гипоксии перед добавлением в клетки может уменьшить время, необходимое для того, чтобы монослой клетки испытал истинную гипоксию (Рисунок 6B).

4. Расчет концентрацииО2 в монослое РПЭ для определения того, находятся ли клетки в гипоксических, нормоксических или гипероксических условиях

ПРИМЕЧАНИЕ: Система измеряет концентрациюO2 в диапазоне примерно от 1 до 1,5 мм над дном лунки по умолчанию при условии, что для монослойного посева используется стандартная пластина с соответствующей рекомендуемой чувствительной крышкой (см. https://lucidsci.com/docs/LucidScientific_Sensing_Lid_Selection_Guide.pdf). Хотя концентрацияО2 в монослое клетки напрямую не измеряется, данные системы могут быть использованы для оценки концентрацииО2 на уровне РПЭ. В частности, зная, что градиент кислорода существует между верхней частью столбца среды, гдеимеется О2 , и нижней частью столбца среды, где потребляетсяО2 , законы диффузии Фика могут быть объединены с измеренной скоростью ОРС для экстраполяции уровнейО2 в монослое клетки. Калькулятор для этой оценки предоставлен в Интернете: https://lucidsci.com/notes?entry=oxygen_diffusion (а в виде интерактивного блокнота с открытым исходным кодом по адресу https://observablehq.com/@lucid/oxygen-diffusion-and-flux-in-cell-culture, исходный код этого калькулятора можно найти по адресу https://github.com/lucidsci/oxygen-diffusion-calculator).

  1. После того, как вы получите доступ к калькулятору, введите объем носителя в микролитрах (например, 100 μл).
  2. Введите концентрацию насыщенного кислорода на границе раздела воздух-жидкость (в верхней части столбца среды над ячейками). Это значение составляет ~185 мкМ при стандартном атмосферном давлении с 5%O2 и влажностью 95%.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Это также можно определить по измерениямO2 с помощью системных зондов в лунках, работающих только с фильтрующим средой (без ячеек на дне скважины).
  3. В поле Flux введите Flux/OCR, сообщаемый системой.
  4. На основе этих значений рассчитывается установившаяся концентрация кислорода на каждой высоте в столбце среды и отображается на графике (рис. 7). Ось x графика — это высота в мм над дном скважины. Ось y — это расчетная концентрация О2 на этой высоте (в мкМ).
  5. КонцентрацияO2 на дне скважины (где находятся ячейки) отображается на линии под графиком.
    ПРИМЕЧАНИЕ: В целом, предполагается,что концентрация О2 в РПЭ in vivo составляет 4-9%. Каждые 10 мкМО2 при стандартных атмосферных условиях соответствуют примерно 1%О2. Таким образом, нормоксия на уровне клеток составляет примерно 40-90 мкМО2. Чем выше колонна среды, темниже будет О2 на уровне монослоя РПЭ9. Таким образом, если клетки находятся в условиях гипоксии, объем среды может быть уменьшен. Если клетки находятся в гипероксических условиях, объем среды может быть увеличен.

Результаты

Установка «сэндвича» для эксперимента с Ресифером показана на рисунке 2A. Чувствительные крышки с 32 зондами, соответствующими столбцам 3, 4, 9 и 10 на 96-луночном планшете, расположены между пластиной ячейки и устройством. После подключения к концентратору устройство активи...

Обсуждение

Митохондриальный метаболизм РПЭ играет решающую роль в патогенезе распространенных слепотных заболеваний сетчатки, включая ВМД и ПВР. Моделирование митохондриального метаболизма RPE in vitro позволяет изолировать его метаболическое состояние от метаболизма окружающих тканей, а так...

Раскрытие информации

Ричард А. Брайан и Кин Ло являются сотрудниками компании Lucid Scientific, которая производит систему Resifher.

Благодарности

Мы благодарим докторов Дэниела Хасса и Джима Херли за идеютестирования растворимости О2 в новых и кондиционированных средах в качестве контроля. Мы благодарим доктора Магали Сен-Женье за редакторский вклад в рукопись. Мы благодарим Скотта Салая (Scott Szalay) из Instrument and Electronic Services Core, Kellogg Eye Center, за дооснащение камеры гипоксии с помощью USB-кабеля Resifer. Никакие федеральные средства не использовались для исследований HFT. Ядро электронных услуг поддерживается EY007003 P30 от Национального института глаза. Эта работа поддерживается неограниченным ведомственным грантом от Исследовательской организации по предотвращению слепоты (RPB). J.M.L.M. поддерживается Инициативой Джеймса Гросфельда по сухой возрастной макулярной дегенерации, Фондом Э. Матильды Зиглер для слепых, грантом глазного банка Eversight, грантом K08EY033420 от Национального института глаза, а также поддержкой Ди и Диксона Браунов, а также Фонда Дэвида и Лизы Дрюс «Открывая надежду». D.Y.S. поддерживается программой UNSW Scientia. L.A.K. поддерживается премией Iraty Award, Monte J. Wallace, Michel Plantevin, грантом R01EY027739 от Национального института глаза и Министерством обороны США по приобретению медицинских исследований VR220059.

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
0.25% Trypsin-EDTAGibco#25-200-056
3,3',5-triiodo-L-thyronine sodium saltSigmaT5516
32-channel Resipher lidLucid ScientificNS32-101A for Falcon
Antimycin A from streptomyces sp.SigmaA8674-25MGInhibitor of Complex III of the electron transport chain
BAM15SigmaSML1760-5MGUncoupling agent to increase mitochondrial respiration
DMSO, cell culture gradeSigma-aldrichD4540-100MLVehicle for reconstituting mitochondrial drugs
Extracellular matrix coating substrates:
Synthemax II-SC		Corning#3535Extracellular matrix for hfRPE
Extracellular matrix coating substrates: VitronectinGibcoA14700Extracellular matrix for iPSC-RPE
FCCPSigmaC2920-10MGUncoupling agent to increase mitochondrial respiration
Fetal Bovine Serum (Bio-Techne S11550H)Bio-TechneS11550H
Hydrocortisone-CyclodextrinSigmaH0396
Hypoxia chamberEmbrient Inc.MIC-101
N1 Media SupplementSigmaN6530
Non-Essential Amino Acids SolutionGibco11140050
O2 sensorSensit technology or Forensics DetectorsP100 or FD-90A-O2
Penicillin-StreptomycinGibco15140-122
Recombinant human TGFβ2Peprotech100-35BTransforming growth factor beta-2 to induce epithelial-mesenchymal transition
RotenoneSigmaR8875-1GInhibitor of Complex I of the electron transport chain
System-compatible plateCorning#353072
TaurineSigmaT8691
αMEM (Alpha Modification of Eagle's Media)Corning15-012-CV

Ссылки

  1. Shu, D. Y., Butcher, E., Saint-Geniez, M. EMT and EndMT: emerging roles in age-related macular degeneration. Int J Mol Sci. 21 (12), 4271 (2020).
  2. Shu, D. Y., Lovicu, F. J. Myofibroblast transdifferentiation: the dark force in ocular wound healing and fibrosis. Prog Retin Eye Res. 60, 44-65 (2017).
  3. Hurley, J. B. Retina metabolism and metabolism in the pigmented epithelium: a busy intersection. Annu Rev Vis Sci. 7, 665-692 (2021).
  4. Wu, W., et al. Deficient RPE mitochondria energetics leads to subretinal fibrosis in age-related macular degeneration. Invest Ophthalmol Vis Sci. 64 (8), 2420 (2023).
  5. Hansman, D. S., et al. Metabolic reprogramming of the retinal pigment epithelium by cytokines associated with age-related macular degeneration. Biosci Rep. 44 (4), BSR20231904BSR20231904 (2024).
  6. Li, K. X., et al. Modulation of pyruvate kinase M2 activity as a therapy in a primary RPE cell culture model of proliferative vitreoretinopathy. Invest Ophthalmol Vis Sci. 62 (8), 2213 (2021).
  7. Gupta, S., et al. Progress in stem cells-based replacement therapy for retinal pigment epithelium: in vitro differentiation to in vivo delivery. Stem Cells Transl Med. 12 (8), 536-552 (2023).
  8. Wilson, D. F., et al. Oxygen distribution and vascular injury in the mouse eye measured by phosphorescence-lifetime imaging. Appl Opt. 44 (25), 5239-5248 (2005).
  9. Hass, D. T., et al. Medium depth influences O2 availability and metabolism in human RPE cultures. Invest Ophthalmol Vis Sci. 64 (14), 4 (2023).
  10. Shu, D. Y., Butcher, E. R., Saint-Geniez, M. Suppression of PGC-1α drives metabolic dysfunction in TGFβ2-Induced EMT of retinal pigment epithelial cells. Int J Mol Sci. 22 (9), 4701 (2021).
  11. Shu, D. Y., et al. Dimethyl fumarate blocks tumor necrosis factor-alpha-driven inflammation and metabolic rewiring in the retinal pigment epithelium. Front Mol Neurosci. 15, 896786 (2022).
  12. Ng, P. Q., Saint-Geniez, M., Kim, L. A., Shu, D. Y. Divergent metabolomic signatures of TGFβ2 and TNFα in the induction of retinal epithelial-mesenchymal transition. Metabolites. 13 (2), 213 (2023).
  13. Kar, D., et al. Choriocapillaris impairment is associated with delayed rod-mediated dark adaptation in age-related macular degeneration. Invest Ophthalmol Vis Sci. 64 (12), 41 (2023).
  14. Curcio, C. A., Kar, D., Owsley, C., Sloan, K. R., Ach, T. Age-related macular degeneration, a mathematically tractable disease. Invest Ophthalmol Vis Sci. 65 (3), 4 (2024).
  15. Maminishkis, A., et al. Confluent monolayers of cultured human fetal retinal pigment epithelium exhibit morphology and physiology of native tissue. Invest Ophthalmol Vis Sci. 47 (8), 3612-3624 (2006).
  16. Maminishkis, A., Miller, S. S. Experimental models for study of retinal pigment epithelial physiology and pathophysiology. J Vis Exp: JoVE. (45), e2032 (2010).
  17. Zhang, Q., et al. A platform for assessing outer segment fate in primary human fetal RPE cultures. Exp Eye Res. 178, 212-222 (2019).
  18. Sharma, R., Bose, D., Montford, J., Ortolan, D., Bharti, K. Triphasic developmentally guided protocol to generate retinal pigment epithelium from induced pluripotent stem cells. STAR Protoc. 3 (3), 101582 (2022).
  19. Marchetti, P., Fovez, Q., Germain, N., Khamari, R., Kluza, J. Mitochondrial spare respiratory capacity: Mechanisms, regulation, and significance in non-transformed and cancer cells. FASEB J. 34 (10), 13106-13124 (2020).
  20. Rosenfeld, P. J., Trivizki, O., Gregori, G., Wang, R. K. An update on the hemodynamic model of age-related macular degeneration. Am J Ophthalmol. 235, 291-299 (2022).
  21. Fitch, T. C., et al. Real-time analysis of bioenergetics in primary human retinal pigment epithelial cells using high-resolution respirometry. J Vis Exp: JoVE. (192), (2023).
  22. Calton, M. A., Beaulieu, M. O., Benchorin, G., Vollrath, D. Method for measuring extracellular flux from intact polarized epithelial monolayers. Mol Vis. 24, 425-433 (2018).
  23. Grumbine, M. K., et al. Maintaining and assessing various tissue and cell types of the eye using a novel pumpless fluidics system. J Vis Exp: JoVE. (197), (2023).
  24. Mu, C., Shearer, J. Protocol for measuring respiratory function of mitochondria in frozen colon tissue from rats. STAR Protoc. 4 (4), 102560 (2023).
  25. Rocha, D. S., Manucci, A. C., Bruni-Cardoso, A., Kowaltowski, A. J., Vilas-Boas, E. A. A practical and robust method to evaluate metabolic fluxes in primary pancreatic islets. Mol Metab. 83, 101922 (2024).
  26. Kanaan, M. N., et al. Cystine/glutamate antiporter xCT controls skeletal muscle glutathione redox, bioenergetics and differentiation. Redox Biol. 73, 103213 (2024).
  27. da Veiga Moreira, J., et al. Methylene blue metabolic therapy restrains in vivo ovarian tumor growth. Cancers. 16 (2), 355 (2024).
  28. McNally, L. A., Altamimi, T. R., Fulghum, K., Hill, B. G. Considerations for using isolated cell systems to understand cardiac metabolism and biology. J Mol Cell Cardiol. 153, 26-41 (2021).
  29. Misare, K. R., et al. The consequences of tetraploidy on Caenorhabditis elegans physiology and sensitivity to chemotherapeutics. Sci Rep. 13 (1), 18125 (2023).

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

210OCR

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

РЕКОМЕНДОВАТЬ БИБЛИОТЕКЕ

НОВОСТИ JoVE

Исследования

Образование

АВТОРЫ

Библиотекарь

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены