JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • תוצאות
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

אנו מציגים מכשיר חדשני למדידת קצבי צריכת חמצן (OCR) בתרביות אפיתל פיגמנט ברשתית (RPE). המכשיר יכול למדוד OCR במשך שבועות בכל פעם על RPE גדל על לוחות תרבית תאים סטנדרטיים עם מדיה סטנדרטית בעוד הלוחות נמצאים באינקובטור תרבית תאים סטנדרטי.

Abstract

חילוף החומרים במיטוכונדריה חיוני לתפקוד תקין של אפיתל פיגמנט הרשתית (RPE), שכבה אחידה של תאים ברשתית החשובה להישרדות קולטני אור. תפקוד לקוי של RPE במיטוכונדריה הוא סימן היכר של ניוון מקולרי תלוי גיל (AMD), הגורם המוביל לעיוורון בלתי הפיך בעולם המפותח, וזגוגית שגשוגית (PVR), סיבוך מסנוור של היפרדות רשתית. התנאים הניווניים של RPE עוצבו היטב על ידי מערכות תרבות RPE שהן מאוד מובחנות ומקוטבות כדי לחקות RPE in vivo . עם זאת, ניטור קצבי צריכת חמצן (OCR), פרוקסי לתפקוד המיטוכונדריה, היה קשה במערכות תרבית כאלה מכיוון שהתנאים המקדמים קיטוב והתמיינות RPE אידיאליים אינם מאפשרים מדידות OCR קלות.

כאן, אנו מציגים מערכת חדשנית, Resipher, לניטור OCR במשך שבועות בכל פעם בתרביות RPE ממוינות היטב תוך שמירה על RPE על מצעי גדילה אופטימליים ומדיה של תרביות פיזיולוגיות באינקובטור תרביות תאים סטנדרטי. מערכת זו מחשבת OCR על ידי מדידת שיפוע ריכוז החמצן הקיים במדיה שמעל התאים. אנו דנים ביתרונות של מערכת זו על פני שיטות אחרות לזיהוי OCR וכיצד להגדיר את המערכת למדידת OCR בתרביות RPE. אנו מכסים עצות וטריקים מרכזיים לשימוש במערכת, זהירות לגבי פירוש הנתונים והנחיות לפתרון בעיות בתוצאות בלתי צפויות.

אנו מספקים גם מחשבון מקוון לאקסטרפולציה של רמת תרביות RPE היפוקסיה, נורמוקסיה, או היפראוקסיה בהתבסס על שיפוע החמצן במדיה מעל התאים שזוהו על ידי המערכת. לבסוף, אנו סוקרים שני יישומים של המערכת, מדידת המצב המטבולי של תאי RPE במודל PVR והבנה כיצד RPE מסתגל מטבולית להיפוקסיה. אנו צופים כי השימוש במערכת זו בתרביות RPE מקוטבות ומובחנות מאוד ישפר את הבנתנו את חילוף החומרים המיטוכונדריאלי של RPE הן במצבים פיזיולוגיים והן במצבי מחלה.

Introduction

אפיתל פיגמנט הרשתית (RPE) הוא חד-שכבתי של תאי אפיתל פוסט-מיטוטיים ומקוטבים מאוד היוצרים מחסום בין קולטני אור רגישים לאור ברשתית לבין מחזור הדם שלהם, מצע נימי המכונה כוריוקפילריס. בדומה לתפקידם של נוירונים תומכי גליה, RPE מבצע מספר עצום של פונקציות לתמיכה בפוטורצפטורים, כולל פאגוציטוזה של מקטעים חיצוניים של קולטני אור, הובלת חומרי מזון ותמיכה מטבולית בפוטורצפטורים והפרשת גורמי גדילה חיוניים, כולם קריטיים לשמירה על תפקוד הראייה.

ניוון של RPE עומד בבסיס מספר הפרעות ניווניות נפוצות של ראייה. בניוון מקולרי תלוי גיל (AMD), אחד הגורמים השכיחים ביותר לאובדן ראייה חשוך מרפא בעולם, RPE מת, ולכן פוטורצפטורים מעל סובלים מניוון משני. בזגוגית שגשוגית (PVR), ה-RPE יוצא במקום זאת ממצבו הפוסט-מיטוטי השקט בדרך כלל, מתרבה ומתמיין למצב מזנכימלי (מה שנקרא מעבר אפיתל למזנכימלי [EMT]) עם שינויים בחילוף החומרים שלו. דיפרנציאציה של RPE גורמת לאובדן תמיכת RPE בפוטורצפטורים תוך הפעלת מצב פיברוטי יותר. התוצאה היא גם ניוון קולטני אור וגם צלקות המושרות על ידי RPE, שניהם גורמים לאובדן ראייה 1,2.

חלק עיקרי מהתמיכה של RPE בפוטורצפטורים הוא מטבולי, וחוסר ויסות מטבולי הוא גורם קריטי במחלות רשתית רבות, כולל AMD ו- PVR. RPE משמש כמחסום רגולטורי בין פוטורצפטורים לבין מקור החמצן והחומרים המזינים שלהם, הכוריוקפילריס. לכן, מה שה-RPE בוחר לעכל לעומת מה שה-RPE בוחר לעבור דרך הכוריוקפילריס אל הפוטורצפטורים שולט מאוד בחילוף החומרים של הפוטורצפטורים ובהישרדותם. מחקרים רבים הראו כי RPE תלוי במידה רבה בחילוף החומרים במיטוכונדריה לבריאותו הרגילה, וכי פוטורצפטורים מסתמכים במידה רבה על גליקוליזה3. זה הציג את הרעיון של מצבים מטבוליים משלימים, שזורים זה בזה בין פוטורצפטורים לבין RPE. באופן ספציפי, RPE מפחית את חילוף החומרים של מצעים מטבוליים מועדפים של קולטני אור ובמקום זאת משתמש בתוצרי הלוואי של מטבוליזם קולטני אור בשילוב עם מטבוליטים שקולטני אור אינם צורכים. במחלות כגון PVR ו- AMD, ראיות מצביעות על כך שה- RPE הופך גליקוליטי יותר ופחות תלוי בחילוף החומרים במיטוכונדריה; שינוי זה לכיוון גליקוליזה RPE עלול להרעיב פוטורצפטורים של מטבוליטים הדרושים לו, ולגרום לניוון 4,5,6. בהתחשב במידת התלות ההדדית של RPE ומטבוליזם של פוטורצפטורים וכמה חילוף חומרים משתנה עומד בבסיס מחלות רשתית, יש עניין רב במידול ומניפולציה של מטבוליזם RPE למטרות טיפוליות.

בעוד שחקר מטבוליזם מיטוכונדריאלי RPE in vivo הוא אידיאלי, היבטים רבים של מטבוליזם מיטוכונדריאלי RPE יכולים להיחקר באופן מעשי רק במערכת תרבית חוץ גופית. התקדמות משמעותית לקראת תרביות RPE באיכות גבוהה נעשתה בעשורים האחרונים, עד כדי כך שתרביות RPE המטופחות ביותר משמשות כיום לטיפול בתחליפי תאים בניסויים קליניים בבני אדם7. כדי לשמור על תרבויות אמינות גבוהה כאלה, RPE צריך להיות גדל על מצעים מסוימים במדיה מסוימת במשך חודשים לפני הניסויים. בתנאים אלה, תרביות RPE מובחנות ומקוטבות באופן מקסימלי, בקירוב in vivo RPE. למרבה הצער, אין כיום ציוד זמין שיכול למדוד את חילוף החומרים במיטוכונדריה באופן ספציפי מה-RPE in vivo. בעוד ניטור חמצן של רשת נימי הרשתית הושג in vivo באמצעות תהודה פאראמגנטית אלקטרונית (EPR) oximetry8, זה לא אפשרי עבור ניתוח RPE. הבדלים בין מטבוליזם RPE in vivo ו- in vitro אינם מתוארים היטב, אך תרביות RPE הוכחו כבעלות פעילות מיטוכונדריאלית גבוהה, בדומה ל- RPE in vivo 3,9, דבר המצביע על תובנה משמעותית לגבי מטבוליזם מיטוכונדריאלי של RPE שניתן להשיג באמצעות תרביות RPE באיכות גבוהה.

מכיוון שכל חילוף החומרים במיטוכונדריה מוביל לצריכת חמצן, מדידת שיעורי צריכת חמצן RPE (OCR) היא פרוקסי נאמן למטבוליזם של המיטוכונדריה. מדידת OCR בתרביות RPE הייתה קשה, מכיוון שהתנאים המקדמים קיטוב ובידול מרביים של RPE מונעים לעתים קרובות מדידות OCR מדויקות לטווח ארוך עם טכניקות זמינות כיום, כגון מנתח סוסון ים. בנייר שיטות זה מוצג מכשיר חדשני, המכונה Resipher (להלן "המערכת"), המאפשר מדידה רציפה של OCR במשך שבועות ב-RPE הגדל בתנאים המקדמים קיטוב והתמיינות באופן מקסימלי. הקלות שבה ניתן למדוד OCR על ידי מערכת זו בתנאי תרבית RPE המקדמים באופן מרבי בידול וקיטוב RPE היא ייחודית בקרב מכשירי מדידת OCR קיימים.

מאמר זה מספק טיפים וטריקים לשימוש במערכת עם תרביות RPE, ולאחר מכן הדגמה של שני יישומים מסוימים. ראשית, RPE EMT, המחקה PVR, מופעל על ידי חשיפה לשינוי גורם גדילה-בטא (TGFβ)1,10,11,12. המערכת משמשת לניטור האופן שבו מטבוליזם RPE מתפתח במהלך תהליך EMT. שנית, התפקיד של היפוקסיה במטבוליזם RPE נחקר באמצעות מערכת זו. היפוקסיה היא תורמת חשובה לפתוגנזה של AMD, כמו choriocapillaris דליל עם גיל13,14. שילוב מערכת זו עם תאי היפוקסיה מאפשר למדל מטבוליזם מיטוכונדריאלי RPE שונה עם היפוקסיה עדינה המלווה את ההזדקנות. לבסוף, מחשבון מקוון המשתמש בנתוני Resipher מוצג כדי לאפשר לקבוע אם תרביות RPE נמצאות בתנאים היפוקסיים, נורמוקסיים או היפרוקסיים. מידע כזה הוא קריטי להסקת מסקנות כלשהן לגבי מטבוליזם RPE ממחקרי תרבית RPE במבחנה.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

לקבלת פרוטוקולים לביסוס תרבויות אנושיות ראשוניות או iPSC-RPE, ראה את ההפניות הבאות 15,16,17,18. רכישה ושימוש ברקמה אנושית עבור פרוטוקולים אלה נבדקו והותרו על ידי מועצת הביקורת המוסדית של אוניברסיטת מישיגן (HUM00105486).

1. יישום כללי של המערכת לתרבות RPE

  1. תאי גזע פלוריפוטנטיים המושרים על ידי בני אדם (iPSC) נגזרים מ-RPE או תאי RPE אנושיים ראשוניים בצלחות תואמות מערכת של 96 בארות.
    1. בהנחה שכבר קיימות תרביות בוגרות הגדלות על לוחות תרביות תאים של 24 בארות, שטפו את התאים במי מלח חוצצי פוספט (PBS) פעם אחת ולאחר מכן הוסיפו 500 μL של 0.25% טריפסין-EDTA (טבלת חומרים). דוגרים 10-40 דקות באינקובטור תרבית תאים, בודקים כל 5-10 דקות עד שהתאים מעוגלים וכמעט מוכנים להתנתקות.
    2. יש להעביר בעדינות פיפטה על גבי התאים כדי לנתק אותם מפלסטיק תרבית התא, ולאחר מכן להעביר לנפח גדול פי 3 של מדיית תרבית תאים (1,500 מיקרוליטר ל-24 בארות), תוך סיבוב בצנטריפוגה במהירות של 250 × גרם למשך 5 דקות בטמפרטורת החדר.
      הערה: המתכון למדיה של תרביות תאי RPE מפורט בטבלה 1 וזמין בהפניות 9,15,16,17,18 שפורסמו בעבר.
    3. יש להשהות מחדש תאים במדיה של תרבית תאי RPE עם 15% נסיוב בקר עוברי (FBS) ולספור את התאים עם המוציטומטר.
    4. זרעו 74,000 תאים לכל באר של צלחת בת 96 בארות (בדרך כלל 225-300 × 105 תאים/ס"מ2), לאחר ציפוי במצעי ציפוי מטריצה חוץ-תאיים מיוחדים (טבלת חומרים) בהתאם להוראות היצרן.
      הערה: תאי זרעים רק על לוח תואם Resipher (טבלה של חומרים) ורק בבארות המתאימות למערך הבדיקה על מכסה החישה (עמודות 3, 4, 9 ו-10 עבור מכסה 32 ערוצים; ראה טבלת חומרים). מכסה החישה של המערכת זמין עם חיישנים של 4, 32 או 96 ערוצים (ראו מיקומי חיישנים באיור 1A-D), ומגוון של לוחות תרביות תאים סטנדרטיים תואמים.
    5. מכיוון שבארות קצה מועדות לאידוי, מה שמשפיע באופן דרמטי על זמינות החמצן, ולכן קריאות OCR, הימנעו מזריעת תאים בכל בארות הקצה (שורות A ו- H של צלחת 96 בארות). יתר על כן, הוסף 200 μL של מים סטריליים בכל אחת מהבארות הריקות של צלחת 96 בארות כדי להפחית את השפעות האידוי.
    6. שמור את הצלחת על משטח שולחן יציב במשך 10 דקות כדי לאפשר לתאים לשקוע; ואז להחזיר אותו לחממה. שנה את המדיה לאחר 24-72 שעות, והחלף במדיה סטנדרטית של תרבית RPE ב- 5% FBS. תרבות במשך 4 שבועות לפחות, החלפת מדיה 2 פעמים בשבוע.
      הערה: תאים מוכנים לניסויים כאשר הם פיגמנטים, מרוצפים וקומפקטיים מאוד (איור 1E).
  2. הגדרה ורכישה של נתונים באמצעות המערכת
    1. הניחו את מכסה החישה על צלחת מקלט ריקה בת 96 בארות ולאחר מכן הניחו אותו בחזרה באינקובטור תרביות התא. ישר והרכיב את ההתקן על מכסה החישה וחבר אותו לרכזת באמצעות כבל ה-USB המצורף. זה יוצר "כריך" של Resipher (איור 2A).
    2. עבור אל יישום אתר האינטרנט של Lucid lab (https://lab.lucidsci.com/) ולחץ על הלחצן ניסוי חדש בפינה השמאלית העליונה כדי ליצור ניסוי חדש.
    3. תן שם לכותרת הניסוי והזן הערות ניסוי רלוונטיות עבור המחקר המסוים (למשל, מספר המעבר של iPSC-RPE שבו משתמש).
    4. יצירת תנאים טובים וקבוצות טיפול. לדוגמה, אם אתם בודקים את ההשפעות של ריכוזי סרום שונים במדיה על זיהוי תווים אופטי (OCR), בחרו 'סרום' בשם הקבוצה ולאחר מכן הזינו ריכוזי סרום מדיה לשימוש, והוסיפו עוד ערכים באחוזים בסרום בלחיצה על הלחצן +. הקצו אילו בארות יקבלו אחוז מסוים בסרום ובחרו תבנית צבע עבור בארות אלה. הוסף קבוצות נוספות (לדוגמה, משתנה ניסיוני אחר לבדיקה) לפי הצורך על-ידי לחיצה על לחצן הוסף קבוצה.
    5. הגדר את הגדרת הצלחת ובחר את סגנון ההתקן והצלחת המתאימים. לחץ על לחצן הוסף צלחת ובחר התקן; בחר סוג לוחית. בחר טיפול ולחץ על הבאר המתאימה.
    6. לחץ על לחצן התחל עכשיו כדי להתחיל את הניסוי. בדוק שהמחוון באתר האינטרנט והנורית ברכזת בצבע ירוק מלא.
    7. אפשרו למערכת לפעול במשך 15-60 דקות כדי להבטיח שכל חיישן מכויל כראוי ומזהה במדויק חמצן אטמוספרי, אשר אמור להיות בריכוז של ~200 מיקרומטר באינקובטור תרבית תאים עם לחות מלאה עם 5% CO2 (איור 2Bi).
      הערה: אם אחד מהחיישנים רחוק ביותר מ-20% מהממוצע של החיישנים האחרים במערך סטנדרטי של אינקובטור לתרביות תאים, שקול לא לכלול גם את זה בניתוח נתונים, מאחר שהחיישן פגום (איור 2Bii).
      הערה: אם כל החיישנים רחוקים ביותר מ-20% מהממוצע של החיישנים האחרים ומה-O2 האטמוספרי הצפוי שדווח כ-200 מיקרומטר במערך אינקובטור סטנדרטי של תרבית תאים, נעשה שימוש במכסה החישה יותר מדי פעמים; החליפו אותו במכסה חישה חדש (איור 2Biii).
      הערה: קבלת קריאות O2 באוויר לפני תחילת הניסוי משפרת באופן משמעותי את פתרון הבעיות לאחר מכן. אם באר מסוימת מופיעה כחריגה לאחר ביצוע ניסוי ולבאר זו היה חיישן שלא היה בכיול, ייתכן שהבעיה היא בחיישן, ולא בשכפול הביולוגי.
    8. הסר את ההתקן ממכסה החישה (אך אל תנתק את כבל ה-USB מההתקן). הנח את ההתקן הפוך באינקובטור כדי לאפשר למנגנון של ההתקן להתאפס. אין לעשות שימוש חוזר במכשיר עד שכל צלילי המנוע פסקו (כ-20-30 שניות).
      הערה: חשוב להשאיר את ההתקן מחובר לרכזת באמצעות כבל ה-USB בכל עת במהלך ניסוי, גם כאשר ההתקן נמצא מחוץ למכסה החישה. זה מאפשר למכשיר לנטר ולדווח באופן רציף על סביבת אינקובטור תרבית התא.
    9. הניחו את הצלחת עם מכסה החישה בחזרה במכסה התרבית של תרבית התא, יחד עם צלחת בת 96 בארות המכילה את תרביות ה-RPE. שנה את המדיה בצלחת עם תרביות RPE עם אותה מדיה ואותו נפח עבור כל הבארות כדי לקבל ערכי OCR בסיסיים עבור כל באר. הקפידו למלא את כל הבארות ללא RPE במים סטריליים כדי לסייע במניעת אידוי.
      הערה: באופן כללי, אנו ממליצים על 60-100 מיקרוליטר של מדיה בתרבית RPE לכל 96-באר, בהתבסס על נתונים המוכיחים כי נפחי מדיה נמוכים יותר מובילים לדלדול תזונתי מהיר, אך נפחי מדיה גבוהים יותר מובילים להיפוקסיה 9 בשוגג.
    10. העבירו את מכסה החישה לצלחת המכילה תרביות תאים ואת המכסה הסטנדרטי (שאינו רסיפר) על הצלחת המכילה תרביות תאים לצלחת המקלט הריקה בעלת 96 בארות כדי לשמור על סטריליות המכסה הסטנדרטי, אשר יהיה צורך בנקודות שונות במהלך הניסוי.
    11. הניחו את הצלחת עם תרביות התאים ואת מכסה החישה בחזרה באינקובטור תרביות התא. שוב, יישר והרכיב את ההתקן על מכסה החישה וחבר אותו לרכזת באמצעות כבל ה- USB המסופק (הרכבת "הכריך"). בדוק שהמחוונים בממשק האתר וב- Hub כולם ירוקים מלאים.
      הערה: נתוני ריכוז O2 יופיעו מיד, בעוד שנתוני זיהוי תווים אופטי (OCR) יופיעו רק לאחר שנאספו מספיק נתוני O2 , בערך שעה אחת.
    12. אפשר להתקן למדוד זיהוי תווים אופטי (OCR) בכל באר למשך 12-24 שעות לפחות כדי לצלם זיהוי תווים אופטי (OCR) בסיסי.
      הערה: זיהוי תווים אופטי (OCR) בסיסי ישתנה בהתאם לגורמים רבים, כולל סוג המדיה המוחלת על תאים. באיור 2C, למדיית תרבית RPE סטנדרטית עם כמויות שונות של FBS (0%, 5%, 15%) יש ערכים שונים במקצת של זיהוי תווים אופטי (OCR). יתר על כן, תרביות עם יותר FBS יכולות לשמור על פעילות מיטוכונדריאלית למשך זמן רב יותר לאחר החלת מדיה על תאים לפני טיפות OCR עקב דלדול של מטבוליטים מיטוכונדריאליים (צד ימין של העקומה).
    13. לאחר קבלת זיהוי תווים אופטי (OCR) בסיסי, חזור על שלבים 1.2.8-1.2.12, אך שנה את המדיה שעל הצלחת עם תרביות RPE לתנאי הניסוי של האדם (בדרך כלל, ± תרופה או השוואה של תנאי מדיה שונים).
      הערה: ניתן לטפל גם בשינויי מדיה שגרתיים באותו אופן. בכל פעם שאינקובטור תרביות התאים נפתח, צפו להפרעה משמעותית בקריאות OCR, מכיוון שהן תלויות בטמפרטורה, לחות, ריכוזיCO2 וגורמים אחרים שכולם משובשים באופן זמני עם פתיחת דלת האינקובטור. במהלך כל הסרה של המכשיר ממכסה החישה, אין צורך להשהות את הניסוי באופן מקוון. לאחר פתיחת דלת האינקובטור של תרבית התאים או החלפת מדיה על הצלחת הנבדקת, בדרך כלל ייקח 2-4 שעות לבסס מחדש את שיפוע החמצן ולהתחיל למדוד OCR מדויק.
    14. לאחר קבלת הנתונים, הפחת את ה- OCR הבסיסי עבור כל באר מה- OCR לאחר החלת תנאי הניסוי, כדי לקבוע את זיהוי התווים האופטי של דלתא המופעל על ידי הטיפול.
    15. לאחר השלמת הניסוי, יש לעקר ולעשות שימוש חוזר במכסה החישה (שניתן לעשות בו שימוש חוזר פי 3-5, אם כי הביצועים יורדים בשימוש חוזר). כדי לעקר את מכסה החישה, יש לטבול את כל המכסה באתנול 70% למשך 10 דקות במכסה מנוע של תרבית תאים, ואז להסיר מהטבילה ולנוח בצד הבדיקה של הארון כלפי מעלה (הימנעו מלגעת בקצות הבדיקה העדינים), ותנו לאתנול ומים להתאדות לחלוטין לפני שתניחו את מכסה החישה על צלחת מקלט חדשה בעלת 96 בארות.
  3. צלם תמונות שדה בהיר כדי לנרמל ערכים של זיהוי תווים אופטי (OCR) למספר התא.
    הערה: הצטברות מלנין ב-RPE מאפשרת נורמליזציה של OCR בהתבסס על ספירה פשוטה של מספרי תאים בתרביות חיות באמצעות מיקרוסקופ שדה בהיר.
    1. הסר את ההתקן והנח אותו הפוך, כמו בשלב 1.2.8. במכסה המנוע של תרבית התא, החליפו את מכסה החישה בלוח תרבית RPE במכסה סטנדרטי של 96 בארות.
    2. באמצעות מיקרוסקופ הפוך סטנדרטי, צלם תמונות שדה בהיר של כל באר.
      הערה: שמור על שטח תמונה אחת עקבית בין בארות (מיקום יחסי בבאר והגדלה אובייקטיבית).
    3. במכסה המנוע של תרבית התא, החלף את מכסה 96 הקידוחים הסטנדרטי בלוח תרבית RPE במכסה החישה והחזיר אותו לאינקובטור לניטור נוסף.
    4. ספור את מספר התא בכל באר באמצעות ImageJ או תוכנה אחרת.
    5. נרמול זיהוי תווים אופטי (OCR) למספר תאים בקבוצות הניסוי השונות. המערכת מדווחת על OCR ביחידות של fmol∙(mm2)-1∙s-1-הצריכה ליחידת חתך שטח. לכן, כדי לנרמל את זיהוי התווים האופטי (OCR) לתא, חלק את זיהוי התווים האופטי (OCR) לפי ספירת תאים למ"מ2 (במקום ספירת תאים לבאר). באופן שווה, הכפל את זיהוי התווים האופטי (OCR) המדווח על ידי המערכת בשטח החתך של הבאר (בסביבות 31 מ"מ2 עבור צלחת סטנדרטית של 96 בארות) כדי להניב OCR ביחידות של fmol∙s-1∙well-1.
  4. בקרות לקביעת פרמטרים ביואנרגטיים RPE.
    הערה: כדי להבטיח שהמערכת ותרביות RPE מגיבות למניפולציות במיטוכונדריה בדרכים צפויות, ניתן לבדוק מולקולות קטנות מסוימות מבוססות היטב כדי להתמקד בשלבים מסוימים של זרחן חמצוני מיטוכונדריאלי. בדיקות אלה מקבילות לשלבים המבוצעים במבחן מאמץ מיטוכונדריאלי באמצעות מנתח סוסון ים10 ומספקות פרופיל ביו-אנרגטי לתרביות RPE.
    1. תאי RPE בתרבית ב-65 מיקרוליטר של מדיית תרבית RPE סטנדרטית עם 5% FBS ומדידת OCR למשך 24 שעות כדי לבסס קו בסיס.
    2. שאפו מדיה בתרבית והוסיפו 65 μL של מדיה סטנדרטית לתרבית RPE עם 5% FBS ועם מצמדים מיטוכונדריאליים (3 מיקרומטר קרבוניל ציאניד-p-trifluoromethoxyphenylhydrazone [FCCP] או 500 ננומטר Bam15, טבלה של חומרים). לדגור למשך הלילה.
      הערה: מצמדים מיטוכונדריאליים אמורים להגדיל באופן משמעותי את זיהוי התווים האופטי (OCR). ודא שה-OCR המוגדל אינו נמצא ב-OCR התיאורטי המוגבל בדיפוזיה מרבית של כ-275 fmol∙(mm2)-1∙s-1 עבור 65 μL של מדיה בתנאי תרבית סטנדרטיים. זיהוי תווים אופטי (OCR) מרבי עבור אמצעי אחסון שונים של מדיה נפוצה זמין במקטע דיון.
    3. לאחר דגירה של לילה, יש לשאוף את המדיה עם מצמדים מיטוכונדריאליים ולהחליף ב-65 μL של תרבית RPE סטנדרטית עם 5% FBS. התבונן בצלחת במשך 24 שעות נוספות כדי לקבוע את ההתאוששות של RPE OCR לאחר הסרת התרופות.
    4. חשב את ההשפעות של uncouplers על OCR על-ידי הפחתת OCR שהתקבל לאחר טיפול מ-OCR שהתקבל לפני הטיפול (איור 3).
      הערה: העלייה ב-OCR עם תוספת של uncouplers מיטוכונדריאליים מסמלת את יכולת הנשימה המיטוכונדריאלית הרזרבה של תא19.
    5. כדי למדוד פרמטרים מיטוכונדריאליים אחרים שנלכדים בדרך כלל במהלך מבחן המאמץ המיטוכונדריאלי עם מנתח סוסון ים, בצעו את אותם השלבים לעיל עם התרכובות הבאות (איור 4).
      1. השתמש אוליגומיצין ב 1 מיקרומטר כדי להעריך נשימה מקושרת ATP.
      2. השתמשו באנטימיצין A ורוטנון במינון 1 מיקרומטר כדי להעריך נשימה שאינה מיטוכונדריאלית.
        הערה: FCCP, אוליגומיצין, אנטימיצין A ורוטנון עלולים להיות רעילים ל-RPE. אם הם גורמים למוות תאי משמעותי, מדידות OCR לא יהיו מדויקות. לכן, מדידות OCR צריכות להתקבל רק בנקודת זמן שבה אין מוות תאי ברור, בדרך כלל בשעות הראשונות לאחר הוספת התרופות (איור 4).

2. מדידת שינויים בחילוף החומרים במיטוכונדריה ב-RPE העובר EMT

  1. פעל לפי אותו פרוטוקול כמתואר בסעיף 1.2.
  2. כדי לגרום ל-EMT לאחר קבלת מדידות OCR בסיסיות, הוסף TGF-β2 (10 ננוגרם/מ"ל) לתרביות RPE ונטר OCR במשך 3 שבועות. רענן מדיה עם TGFβ2 טרי כל 2-3 ימים (איור 5).
  3. לפחות פעמיים בשבוע, קבל תמונות brightfield כמו בסעיף 1.3 כדי להבטיח שספירת התאים אינה משתנה. אם הספירה משתנה, נרמל את ערכי זיהוי התווים האופטי (OCR) למספר התא בכל באר.
    הערה: אותו פרוטוקול יכול לשמש עבור משרים אחרים של EMT כדי לפקח על שינויים ארוכי טווח OCR לאורך תקופת התרבית בזמן שהתאים נמצאים באינקובטור.

3. מדידת שינויים בחילוף החומרים במיטוכונדריה ב-RPE היפוקסי

הערה: היישום של המערכת בתנאים היפוקסיים, נורמוקסיים, או היפראוקסיים זהה לסעיף 1.2, למעט שמירת "הכריך" בתא היפוקסיה (טבלה של חומרים) הממוקם באינקובטור תרבית תאים סטנדרטי.

  1. קדח חור במכסה של תא ההיפוקסיה כדי להרכיב את כבל USB Type-C דרכו ואטם אותו עם סיליקון או מרק (איור 6A).
  2. להרכיב את מכסה החישה עם צלחת תרבית התא במכסה המנוע ולהעביר אותם לתוך תא היפוקסיה.
  3. הגדר את "כריך" (צלחת, מכסה חישה, מכשיר) בתא היפוקסיה. כמו כן מניחים בתא היפוקסיה צלחת פטרי עם מים סטריליים כדי לסייע בשמירה על לחות. לבסוף, מקם חיישן O2 נייד בתא ההיפוקסיה (טבלת חומרים). ההגדרה מוצגת באיור 6A.
  4. אטמו את התא וחברו אותו לבלון גז עם ריכוז היפוקסי של O2 וריכוז תרבית תאים סטנדרטי של CO2 (למשל, 1% O2 ו-5% CO2).
  5. החליפו לאט את האוויר בתא ההיפוקסיה עם האוויר 1% O2/5% CO2 בצילינדר עד שחיישן החמצן מראה את ריכוז O2 הרצוי, בדרך כלל איפשהו בין 1% ל -10%.
    הערה: חיישן O2 הנייד דורש זמן כדי להתאזן, ולכן יש להוסיף גז מהגליל לתא ההיפוקסיה באיטיות.
  6. סגור את שסתומי הכניסה והיציאה של תא ההיפוקסיה והעבר את החדר כולו לאינקובטור.
  7. הגדר והתחל את הניסוי כמו בסעיף 1.2.
    הערה: שיווי משקל מראש של המדיה בתא ההיפוקסיה לפני הוספה לתאים יכול להפחית את הזמן שלוקח לחד-שכבה התאית לחוות היפוקסיה אמיתית (איור 6B).

4. חישוב ריכוז O2 בשכבה החד-שכבתית RPE כדי לקבוע אם התאים נמצאים בתנאים היפוקסיים, נורמוקסיים או היפראוקסיים

הערה: המערכת מודדת את ריכוז O2 בין כ-1 ל-1.5 מ"מ מעל תחתית הבאר כברירת מחדל בהנחה שנעשה שימוש בלוח סטנדרטי עם מכסה החישה המומלץ המתאים לתרבית חד-שכבתית (ראה https://lucidsci.com/docs/LucidScientific_Sensing_Lid_Selection_Guide.pdf). בעוד ריכוז O2 בחד-שכבה התאית אינו נמדד ישירות, ניתן להשתמש בנתונים מהמערכת כדי להעריך את ריכוז O2 ברמת RPE. באופן ספציפי, בידיעה שקיים שיפוע חמצן בין החלק העליון של עמודת המדיה, שבו O2 זמין, לבין החלק התחתון של עמודת המדיה, שבו O2 נצרך, ניתן לשלב את חוקי הדיפוזיה של פיק עם קצב OCR הנמדד כדי להסיק רמות O2 במונושכבה של התא. מחשבון להערכה זו מסופק באינטרנט: https://lucidsci.com/notes?entry=oxygen_diffusion (ובצורה של מחברת אינטראקטיבית בקוד פתוח ב- https://observablehq.com/@lucid/oxygen-diffusion-and-flux-in-cell-culture, ניתן למצוא את קוד המקור של מחשבון זה בכתובת https://github.com/lucidsci/oxygen-diffusion-calculator).

  1. לאחר הגישה למחשבון, הזן את נפח המדיה במיקרוליטרים (לדוגמה, 100 μL).
  2. הזן את ריכוז החמצן הרווי בממשק אוויר-נוזל (החלק העליון של עמודת המדיה מעל התאים). ערך זה הוא ~ 185 מיקרומטר בלחץ אטמוספרי סטנדרטי עם 5% O2 ו 95% לחות.
    הערה: ניתן לקבוע זאת גם ממדידות O2 על ידי בדיקות מערכת בבארות מדיה בלבד (ללא תאים בתחתית הבאר).
  3. בקלט Flux, הזן את Flux/OCR המדווח על-ידי המערכת.
  4. בהתבסס על ערכים אלה, ריכוז החמצן במצב יציב בכל גובה בעמודת המדיה מחושב ומוצג בתרשים (איור 7). ציר ה-x של העלילה הוא הגובה במ"מ מעל תחתית הבאר. ציר y הוא ריכוז O2 המחושב בגובה זה (במיקרומטר).
  5. ריכוז O2 בתחתית הבאר (היכן שהתאים נמצאים) מדווח בקו שמתחת לחלקה.
    הערה: באופן כללי, ההערכה היא כי RPE in vivo רואה ריכוז O2 של 4-9%. כל 10 מיקרומטר של O2 בתנאים אטמוספריים סטנדרטיים מתאים לכ-1% O2. לכן, normoxia ברמה של תאים הוא כ 40-90 מיקרומטר של O2. ככל שעמודת המדיה גבוהה יותר, כך O2 יהיה נמוך יותר ברמה של RPE monolayer9. לכן, אם תאים נראים בתנאים היפוקסיים, נפח המדיה יכול להיות מופחת. אם נראה שהתאים נמצאים בתנאים היפרוקסיים, ניתן להגדיל את נפח המדיה.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

תוצאות

מערך ה"סנדוויץ'" של ניסוי Resipher מודגם באיור 2A. מכסי חישה עם 32 גשושיות המתאימות לעמודות 3, 4, 9 ו-10 על לוח 96 הקידוחים יושבים בין לוחית התא לבין המכשיר. לאחר החיבור לרכזת, ההתקן מפעיל מנועים כדי להזיז את מכסה החישה למעלה ולמטה, ומודד ריכוז O2 בעמודת המדיה בטווח גבהים מעל חד-שכב?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

חילוף החומרים המיטוכונדריאלי של RPE ממלא תפקיד קריטי בפתוגנזה של מחלות רשתית מסנוורות נפוצות, כולל AMD ו- PVR. מידול חילוף החומרים המיטוכונדריאלי RPE במבחנה מאפשר לבודד את המצב המטבולי שלו מאלה של הרקמות הסובבות, יחד עם חשיפת הרקמה לעלבונות שונים המדמים מחלה באופן מבוקר. מודלים חוץ גופיי...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

ריצ'רד א. בריאן וקין לו הם עובדים של Lucid Scientific, המייצרת את מערכת Resifer.

Acknowledgements

אנו מודים לד"ר דניאל הס וד"ר ג'ים הארלי על הרעיון לבחון את מסיסות O2 במדיה חדשה לעומת מותנית כבקרה. אנו מודים לד"ר מגאלי סן-גניז על תרומת העריכה לכתב היד. אנו מודים לסקוט סאלאי (Scott Szalay) מ-Instrument and Electronic Services Core, Kellogg Eye Center, על התאמת תא ההיפוקסיה באמצעות כבל ה-USB Resifer. לא נעשה שימוש בכספים פדרליים למחקר HFT. ליבת השירותים האלקטרוניים נתמכת על ידי EY007003 P30 מהמכון הלאומי לעיניים. עבודה זו נתמכת על ידי מענק מחלקתי בלתי מוגבל ממחקר למניעת עיוורון (RPB). J.M.L.M. נתמכת על ידי יוזמת ג'יימס גרוספלד לניוון מקולרי הקשור לגיל יבש, קרן E. Matilda Ziegler לעיוורים, מענק בנק עיניים Eversight, מענק K08EY033420 מהמכון הלאומי לעיניים, ותמיכה של די ודיקסון בראון, כמו גם קרן דיוויד וליסה דרווס לגילוי תקווה. D.Y.S. נתמך על ידי תוכנית המדע של UNSW. ל.א.ק. נתמכת על ידי פרס איראטי, מונטה ג'יי וואלאס, מישל פלנטבין, מענק R01EY027739 מהמכון הלאומי לעיניים, ופעילות רכש המחקר הרפואי של צבא ההגנה VR220059.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
0.25% Trypsin-EDTAGibco#25-200-056
3,3',5-triiodo-L-thyronine sodium saltSigmaT5516
32-channel Resipher lidLucid ScientificNS32-101A for Falcon
Antimycin A from streptomyces sp.SigmaA8674-25MGInhibitor of Complex III of the electron transport chain
BAM15SigmaSML1760-5MGUncoupling agent to increase mitochondrial respiration
DMSO, cell culture gradeSigma-aldrichD4540-100MLVehicle for reconstituting mitochondrial drugs
Extracellular matrix coating substrates:
Synthemax II-SC		Corning#3535Extracellular matrix for hfRPE
Extracellular matrix coating substrates: VitronectinGibcoA14700Extracellular matrix for iPSC-RPE
FCCPSigmaC2920-10MGUncoupling agent to increase mitochondrial respiration
Fetal Bovine Serum (Bio-Techne S11550H)Bio-TechneS11550H
Hydrocortisone-CyclodextrinSigmaH0396
Hypoxia chamberEmbrient Inc.MIC-101
N1 Media SupplementSigmaN6530
Non-Essential Amino Acids SolutionGibco11140050
O2 sensorSensit technology or Forensics DetectorsP100 or FD-90A-O2
Penicillin-StreptomycinGibco15140-122
Recombinant human TGFβ2Peprotech100-35BTransforming growth factor beta-2 to induce epithelial-mesenchymal transition
RotenoneSigmaR8875-1GInhibitor of Complex I of the electron transport chain
System-compatible plateCorning#353072
TaurineSigmaT8691
αMEM (Alpha Modification of Eagle's Media)Corning15-012-CV

References

  1. Shu, D. Y., Butcher, E., Saint-Geniez, M. EMT and EndMT: emerging roles in age-related macular degeneration. Int J Mol Sci. 21 (12), 4271(2020).
  2. Shu, D. Y., Lovicu, F. J. Myofibroblast transdifferentiation: the dark force in ocular wound healing and fibrosis. Prog Retin Eye Res. 60, 44-65 (2017).
  3. Hurley, J. B. Retina metabolism and metabolism in the pigmented epithelium: a busy intersection. Annu Rev Vis Sci. 7, 665-692 (2021).
  4. Wu, W., et al. Deficient RPE mitochondria energetics leads to subretinal fibrosis in age-related macular degeneration. Invest Ophthalmol Vis Sci. 64 (8), 2420(2023).
  5. Hansman, D. S., et al. Metabolic reprogramming of the retinal pigment epithelium by cytokines associated with age-related macular degeneration. Biosci Rep. 44 (4), BSR20231904BSR20231904(2024).
  6. Li, K. X., et al. Modulation of pyruvate kinase M2 activity as a therapy in a primary RPE cell culture model of proliferative vitreoretinopathy. Invest Ophthalmol Vis Sci. 62 (8), 2213(2021).
  7. Gupta, S., et al. Progress in stem cells-based replacement therapy for retinal pigment epithelium: in vitro differentiation to in vivo delivery. Stem Cells Transl Med. 12 (8), 536-552 (2023).
  8. Wilson, D. F., et al. Oxygen distribution and vascular injury in the mouse eye measured by phosphorescence-lifetime imaging. Appl Opt. 44 (25), 5239-5248 (2005).
  9. Hass, D. T., et al. Medium depth influences O2 availability and metabolism in human RPE cultures. Invest Ophthalmol Vis Sci. 64 (14), 4(2023).
  10. Shu, D. Y., Butcher, E. R., Saint-Geniez, M. Suppression of PGC-1α drives metabolic dysfunction in TGFβ2-Induced EMT of retinal pigment epithelial cells. Int J Mol Sci. 22 (9), 4701(2021).
  11. Shu, D. Y., et al. Dimethyl fumarate blocks tumor necrosis factor-alpha-driven inflammation and metabolic rewiring in the retinal pigment epithelium. Front Mol Neurosci. 15, 896786(2022).
  12. Ng, P. Q., Saint-Geniez, M., Kim, L. A., Shu, D. Y. Divergent metabolomic signatures of TGFβ2 and TNFα in the induction of retinal epithelial-mesenchymal transition. Metabolites. 13 (2), 213(2023).
  13. Kar, D., et al. Choriocapillaris impairment is associated with delayed rod-mediated dark adaptation in age-related macular degeneration. Invest Ophthalmol Vis Sci. 64 (12), 41(2023).
  14. Curcio, C. A., Kar, D., Owsley, C., Sloan, K. R., Ach, T. Age-related macular degeneration, a mathematically tractable disease. Invest Ophthalmol Vis Sci. 65 (3), 4(2024).
  15. Maminishkis, A., et al. Confluent monolayers of cultured human fetal retinal pigment epithelium exhibit morphology and physiology of native tissue. Invest Ophthalmol Vis Sci. 47 (8), 3612-3624 (2006).
  16. Maminishkis, A., Miller, S. S. Experimental models for study of retinal pigment epithelial physiology and pathophysiology. J Vis Exp: JoVE. (45), e2032(2010).
  17. Zhang, Q., et al. A platform for assessing outer segment fate in primary human fetal RPE cultures. Exp Eye Res. 178, 212-222 (2019).
  18. Sharma, R., Bose, D., Montford, J., Ortolan, D., Bharti, K. Triphasic developmentally guided protocol to generate retinal pigment epithelium from induced pluripotent stem cells. STAR Protoc. 3 (3), 101582(2022).
  19. Marchetti, P., Fovez, Q., Germain, N., Khamari, R., Kluza, J. Mitochondrial spare respiratory capacity: Mechanisms, regulation, and significance in non-transformed and cancer cells. FASEB J. 34 (10), 13106-13124 (2020).
  20. Rosenfeld, P. J., Trivizki, O., Gregori, G., Wang, R. K. An update on the hemodynamic model of age-related macular degeneration. Am J Ophthalmol. 235, 291-299 (2022).
  21. Fitch, T. C., et al. Real-time analysis of bioenergetics in primary human retinal pigment epithelial cells using high-resolution respirometry. J Vis Exp: JoVE. (192), (2023).
  22. Calton, M. A., Beaulieu, M. O., Benchorin, G., Vollrath, D. Method for measuring extracellular flux from intact polarized epithelial monolayers. Mol Vis. 24, 425-433 (2018).
  23. Grumbine, M. K., et al. Maintaining and assessing various tissue and cell types of the eye using a novel pumpless fluidics system. J Vis Exp: JoVE. (197), (2023).
  24. Mu, C., Shearer, J. Protocol for measuring respiratory function of mitochondria in frozen colon tissue from rats. STAR Protoc. 4 (4), 102560(2023).
  25. Rocha, D. S., Manucci, A. C., Bruni-Cardoso, A., Kowaltowski, A. J., Vilas-Boas, E. A. A practical and robust method to evaluate metabolic fluxes in primary pancreatic islets. Mol Metab. 83, 101922(2024).
  26. Kanaan, M. N., et al. Cystine/glutamate antiporter xCT controls skeletal muscle glutathione redox, bioenergetics and differentiation. Redox Biol. 73, 103213(2024).
  27. da Veiga Moreira, J., et al. Methylene blue metabolic therapy restrains in vivo ovarian tumor growth. Cancers. 16 (2), 355(2024).
  28. McNally, L. A., Altamimi, T. R., Fulghum, K., Hill, B. G. Considerations for using isolated cell systems to understand cardiac metabolism and biology. J Mol Cell Cardiol. 153, 26-41 (2021).
  29. Misare, K. R., et al. The consequences of tetraploidy on Caenorhabditis elegans physiology and sensitivity to chemotherapeutics. Sci Rep. 13 (1), 18125(2023).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

210RPEOCRAMD

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved