长期监测高度分化和极化视网膜色素上皮培养物中的耗氧率

摘要

我们介绍了一种用于测量视网膜色素上皮 （RPE） 培养物中耗氧率 （OCR） 的新型设备。当板位于标准细胞培养箱中时，该设备可以一次测量在标准培养基的标准细胞培养板上生长的 RPE 上数周的 OCR。

摘要

线粒体代谢对于视网膜色素上皮 （RPE） 的正常功能至关重要，RPE 是视网膜中对光感受器存活很重要的单层细胞。RPE 线粒体功能障碍是年龄相关性黄斑变性 （AMD） 的标志，AMD是发达国家不可逆性失明的主要原因，以及增生性玻璃体视网膜病变 （PVR），一种视网膜脱离的致盲并发症。RPE 退行性疾病已被 RPE 培养系统很好地建模，这些系统具有高度分化和极化以模拟 体内 RPE。然而，在此类培养系统中，监测耗氧率 （OCR）（线粒体功能的代表）一直很困难，因为促进理想 RPE 极化和分化的条件不允许轻松进行 OCR 测量。

在这里，我们介绍了一种新型系统 Resipher，该系统可在分化良好的 RPE 培养物中一次监测数周的 OCR，同时在标准细胞培养箱中将 RPE 保持在最佳生长基质和生理培养基上。该系统通过测量细胞上方培养基中存在的氧浓度梯度来计算 OCR。我们讨论了该系统相对于其他检测 OCR 方法的优势，以及如何设置用于测量 RPE 培养物中 OCR 的系统。我们介绍了使用系统的关键提示和技巧、解释数据的注意事项以及排查意外结果的指南。

我们还提供了一个在线计算器，用于根据系统检测到的细胞上方培养基中的氧梯度推断低氧、常氧或高氧 RPE 培养的水平。最后，我们回顾了该系统的两种应用，在 PVR 模型中测量 RPE 细胞的代谢状态，并了解 RPE 如何代谢适应缺氧。我们预计在高度极化和分化的 RPE 培养物上使用该系统将增强我们对生理和疾病状态下 RPE 线粒体代谢的理解。

引言

视网膜色素上皮 （RPE） 是单层功能性有丝分裂后高度极化的上皮细胞，在视网膜中的光敏感光感受器与其血液循环之间形成屏障，毛细血管床称为脉络膜毛细血管。与神经胶质细胞支持神经元的作用一样，RPE 执行多种功能来支持光感受器，包括光感受器外段的吞噬作用、营养物质的运输和光感受器的代谢支持，以及必需生长因子的分泌，所有这些都对维持视觉功能至关重要。

RPE 的退化是几种常见的退行性视力障碍的基础。年龄相关性黄斑变性 （AMD） 是世界上无法治愈的视力丧失的最常见原因之一，RPE 死亡，因此覆盖的光感受器遭受继发性变性。在增生性玻璃体视网膜病变 （PVR） 中，RPE 反而退出其正常的静止有丝分裂后状态，增殖并去分化为间充质状态（所谓的上皮到间充质转化 [EMT]），其代谢发生变化。RPE 去分化导致 RPE 对光感受器的支持丧失，同时也会触发更多的纤维化状态。这会导致光感受器变性和 RPE 诱导的瘢痕形成，这两者都会引发视力丧失 ^1,2。

RPE 对光感受器的支持主要部分是代谢，代谢失调是许多视网膜疾病的关键因素，包括 AMD 和 PVR。RPE 是光感受器与其氧气和营养来源（脉络膜毛细血管）之间的调节屏障。因此，RPE 选择代谢的物质与 RPE 选择从脉络膜毛细血管传递到光感受器的物质强烈控制着光感受器的代....

研究方案

有关建立人原代或 iPSC-RPE 培养物的方案，请参阅以下参考文献^{15、16、17、18}。密歇根大学机构审查委员会 （HUM00105486） 审查并允许为这些方案采集和使用人体组织。

1. 系统在 RPE 培养中的一般应用

1. 将人诱导多能干细胞 （iPSC） 衍生的 RPE 或原代人 RPE 细胞接种在系统兼容的 96 孔板中。
   1. 假设已经存在的成熟培养物在 24 孔细胞培养板上生长，用磷酸盐缓冲盐水 （PBS） 洗涤细胞一次，然后加入 500 μL 的 0.25% 胰蛋白酶-EDTA（材料表）。在细胞培养箱中孵育 10-40 分钟，每 5-10 分钟检查一次，直到细胞变圆并几乎可以分离。
   2. 轻轻吸取培养基到细胞上，使其从细胞培养塑料上分离，然后转移至 3 倍体积的细胞培养基（每 24 孔 1,500 μL），在离心机中以 250 × g 的速度在室温下旋转 5 分钟。
      注： RPE 细胞培养基的配方详见表 1，可在之前发布的参考文献

结果

Resipher 实验的“夹心”设置如图 2A 所示。带有 32 个探针的传感盖对应于 96 孔板上的第 3、4、9 和 10 列，位于细胞板和设备之间。连接到集线器后，该设备激活电机上下移动感应盖，在细胞单层上方的一系列高度（通常为 1-1.5 mm）测量培养基柱中的 O₂ 浓度。因此，通过记录单层上方这些不同高度的 O₂ 浓度来连续测量 O₂ 梯度。通过梯度测量和应用 Fic.......

讨论

RPE 的线粒体代谢在常见致盲性视网膜疾病（包括 AMD 和 PVR）的发病机制中起关键作用。 在体外 模拟 RPE 线粒体代谢可以使其代谢状态与周围组织的代谢状态隔离开来，同时以受控方式使组织受到不同的疾病模拟损伤。高保真人原代和 iPSC-RPE 培养物的出现促进了 RPE 线粒体代谢的这种 体外 建模，这些培养物获得了在 体内紧密接近 RPE 所需的适当分化状态和极性。虽然监测此类.......

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.25% Trypsin-EDTA	Gibco	#25-200-056
3,3',5-triiodo-L-thyronine sodium salt	Sigma	T5516
32-channel Resipher lid	Lucid Scientific	NS32-101A for Falcon
Antimycin A from streptomyces sp.	Sigma	A8674-25MG	Inhibitor of Complex III of the electron transport chain
BAM15	Sigma	SML1760-5MG	Uncoupling agent to increase mitochondrial respiration
DMSO, cell culture grade	Sigma-aldrich	D4540-100ML	Vehicle for reconstituting mitochondrial drugs
Extracellular matrix coating substrates: Synthemax II-SC	Corning	#3535	Extracellular matrix for hfRPE
Extracellular matrix coating substrates: Vitronectin	Gibco	A14700	Extracellular matrix for iPSC-RPE
FCCP	Sigma	C2920-10MG	Uncoupling agent to increase mitochondrial respiration
Fetal Bovine Serum (Bio-Techne S11550H)	Bio-Techne	S11550H
Hydrocortisone-Cyclodextrin	Sigma	H0396
Hypoxia chamber	Embrient Inc.	MIC-101
N1 Media Supplement	Sigma	N6530
Non-Essential Amino Acids Solution	Gibco	11140050
O2 sensor	Sensit technology or Forensics Detectors	P100 or FD-90A-O2
Penicillin-Streptomycin	Gibco	15140-122
Recombinant human TGFβ2	Peprotech	100-35B	Transforming growth factor beta-2 to induce epithelial-mesenchymal transition
Rotenone	Sigma	R8875-1G	Inhibitor of Complex I of the electron transport chain
System-compatible plate	Corning	#353072
Taurine	Sigma	T8691
αMEM (Alpha Modification of Eagle's Media)	Corning	15-012-CV