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我们介绍了一种用于测量视网膜色素上皮 (RPE) 培养物中耗氧率 (OCR) 的新型设备。当板位于标准细胞培养箱中时,该设备可以一次测量在标准培养基的标准细胞培养板上生长的 RPE 上数周的 OCR。
线粒体代谢对于视网膜色素上皮 (RPE) 的正常功能至关重要,RPE 是视网膜中对光感受器存活很重要的单层细胞。RPE 线粒体功能障碍是年龄相关性黄斑变性 (AMD) 的标志,AMD是发达国家不可逆性失明的主要原因,以及增生性玻璃体视网膜病变 (PVR),一种视网膜脱离的致盲并发症。RPE 退行性疾病已被 RPE 培养系统很好地建模,这些系统具有高度分化和极化以模拟 体内 RPE。然而,在此类培养系统中,监测耗氧率 (OCR)(线粒体功能的代表)一直很困难,因为促进理想 RPE 极化和分化的条件不允许轻松进行 OCR 测量。
在这里,我们介绍了一种新型系统 Resipher,该系统可在分化良好的 RPE 培养物中一次监测数周的 OCR,同时在标准细胞培养箱中将 RPE 保持在最佳生长基质和生理培养基上。该系统通过测量细胞上方培养基中存在的氧浓度梯度来计算 OCR。我们讨论了该系统相对于其他检测 OCR 方法的优势,以及如何设置用于测量 RPE 培养物中 OCR 的系统。我们介绍了使用系统的关键提示和技巧、解释数据的注意事项以及排查意外结果的指南。
我们还提供了一个在线计算器,用于根据系统检测到的细胞上方培养基中的氧梯度推断低氧、常氧或高氧 RPE 培养的水平。最后,我们回顾了该系统的两种应用,在 PVR 模型中测量 RPE 细胞的代谢状态,并了解 RPE 如何代谢适应缺氧。我们预计在高度极化和分化的 RPE 培养物上使用该系统将增强我们对生理和疾病状态下 RPE 线粒体代谢的理解。
视网膜色素上皮 (RPE) 是单层功能性有丝分裂后高度极化的上皮细胞,在视网膜中的光敏感光感受器与其血液循环之间形成屏障,毛细血管床称为脉络膜毛细血管。与神经胶质细胞支持神经元的作用一样,RPE 执行多种功能来支持光感受器,包括光感受器外段的吞噬作用、营养物质的运输和光感受器的代谢支持,以及必需生长因子的分泌,所有这些都对维持视觉功能至关重要。
RPE 的退化是几种常见的退行性视力障碍的基础。年龄相关性黄斑变性 (AMD) 是世界上无法治愈的视力丧失的最常见原因之一,RPE 死亡,因此覆盖的光感受器遭受继发性变性。在增生性玻璃体视网膜病变 (PVR) 中,RPE 反而退出其正常的静止有丝分裂后状态,增殖并去分化为间充质状态(所谓的上皮到间充质转化 [EMT]),其代谢发生变化。RPE 去分化导致 RPE 对光感受器的支持丧失,同时也会触发更多的纤维化状态。这会导致光感受器变性和 RPE 诱导的瘢痕形成,这两者都会引发视力丧失 1,2。
RPE 对光感受器的支持主要部分是代谢,代谢失调是许多视网膜疾病的关键因素,包括 AMD 和 PVR。RPE 是光感受器与其氧气和营养来源(脉络膜毛细血管)之间的调节屏障。因此,RPE 选择代谢的物质与 RPE 选择从脉络膜毛细血管传递到光感受器的物质强烈控制着光感受器的代谢和存活。大量研究表明,RPE 的正常健康严重依赖线粒体代谢,而光感受器则严重依赖糖酵解3。这引入了光感受器和 RPE 之间互补、交织的代谢状态的概念。具体来说,RPE 减少了其对优选光感受器代谢底物的代谢,而是利用光感受器代谢的副产物与光感受器不消耗的代谢物相结合。在 PVR 和 AMD 等疾病中,有证据表明 RPE 变得更加糖酵解,对线粒体代谢的依赖性降低;这种向 RPE 糖酵解的转变可能会使光感受器缺乏所需的代谢物,从而引发退化 4,5,6。鉴于 RPE 和光感受器代谢的相互依赖性以及视网膜疾病基础代谢的改变程度,人们对为治疗目的建模和操纵 RPE 代谢产生了浓厚的兴趣。
虽然在体内研究 RPE 线粒体代谢是理想的,但 RPE 线粒体代谢的许多方面只能在体外培养系统中实际探测。在过去的几十年里,高保真 RPE 培养物取得了重大进展,以至于最精心修饰的 RPE 培养物现在被用于人体临床试验中的细胞替代疗法7。为了保持这种高保真培养物,RPE 需要在实验前在特定培养基的特定底物上生长数月。在这些条件下,RPE 培养物最大程度地分化和极化,接近体内 RPE。不幸的是,目前没有可用的设备可以专门从体内 RPE 测量线粒体代谢。虽然已经使用电子顺磁共振 (EPR) 血氧饱和度8 在体内实现了视网膜毛细血管网络的氧气监测,但这无法用于 RPE 分析。体内和体外 RPE 代谢之间的差异尚未得到很好的描述,但 RPE 培养物已被证明具有高线粒体活性,类似于体内 RPE 3,9,表明使用高保真 RPE 培养物可以深入了解 RPE 线粒体代谢。
由于所有线粒体代谢都会导致耗氧量,因此测量 RPE 耗氧率 (OCR) 是线粒体代谢的忠实代表。在 RPE 培养物中测量 OCR 一直很困难,因为促进最大 RPE 极化和分化的条件通常妨碍使用当前可用的技术(如 Seahorse 分析仪)进行长期准确的 OCR 测量。在该方法论文中,介绍了一种称为 Resipher(以下简称“系统”)的新型设备,该设备允许在最大程度促进极化和分化的条件下生长的 RPE 中连续测量数周的 OCR。该系统在最大限度地促进 RPE 分化和极化的 RPE 培养条件下测量 OCR 的难易程度在现有的 OCR 测量设备中是独一无二的。
本文提供了将系统与 RPE 培养物一起使用的提示和技巧,然后演示了两种特定应用。首先,模拟 PVR 的 RPE EMT 是由暴露于转化生长因子-β (TGFβ) 触发的1,10,11,12。该系统用于监测 RPE 代谢在 EMT 过程中的演变情况。其次,使用该系统探索缺氧在 RPE 代谢中的作用。缺氧是 AMD 发病机制的重要因素,因为脉络膜毛细血管会随着13,14 岁的年龄而变薄。将该系统与缺氧室相结合,可以模拟改变的 RPE 线粒体代谢与伴随衰老的微妙缺氧。最后,引入了一个使用 Resipher 数据的在线计算器,以允许人们确定 RPE 培养物是否处于低氧、常氧或高氧条件下。这些信息对于从体外 RPE 培养研究中得出有关 RPE 代谢的任何结论至关重要。
有关建立人原代或 iPSC-RPE 培养物的方案,请参阅以下参考文献15、16、17、18。密歇根大学机构审查委员会 (HUM00105486) 审查并允许为这些方案采集和使用人体组织。
1. 系统在 RPE 培养中的一般应用
2. 测量接受 EMT 的 RPE 中线粒体代谢的变化
3. 测量缺氧 RPE 中线粒体代谢的变化
注:该系统在低氧、常氧或高氧条件下的应用与第 1.2 节相同,只是将“三明治”保存在放置在标准细胞培养箱中的缺氧室(材料表)中。
4. 计算 RPE 单层的 O2 浓度,以确定细胞是否处于低氧、常氧或高氧状态
注:默认情况下,系统在孔底上方约 1 至 1.5 mm 之间测量 O2 浓度,假设使用标准板和相应的推荐传感盖进行单层培养(参见 https://lucidsci.com/docs/LucidScientific_Sensing_Lid_Selection_Guide.pdf)。虽然细胞单层的 O2 浓度不能直接测量,但来自系统的数据可用于估计 RPE 水平的 O2 浓度。具体来说,知道在培养基柱顶部(O2 可用)和培养基柱底部(O2 被消耗)之间存在氧梯度,菲克扩散定律可以与测得的 OCR 速率相结合,以推断细胞单层的 O2 水平。此估计的计算器在线提供:https://lucidsci.com/notes?entry=oxygen_diffusion(https://observablehq.com/@lucid/oxygen-diffusion-and-flux-in-cell-culture 以开源交互式笔记本的形式提供,此计算器的源代码可在 https://github.com/lucidsci/oxygen-diffusion-calculator 中找到)。
Resipher 实验的“夹心”设置如图 2A 所示。带有 32 个探针的传感盖对应于 96 孔板上的第 3、4、9 和 10 列,位于细胞板和设备之间。连接到集线器后,该设备激活电机上下移动感应盖,在细胞单层上方的一系列高度(通常为 1-1.5 mm)测量培养基柱中的 O2 浓度。因此,通过记录单层上方这些不同高度的 O2 浓度来连续测量 O2 梯度。通过梯度测量和应用 Fic...
RPE 的线粒体代谢在常见致盲性视网膜疾病(包括 AMD 和 PVR)的发病机制中起关键作用。 在体外 模拟 RPE 线粒体代谢可以使其代谢状态与周围组织的代谢状态隔离开来,同时以受控方式使组织受到不同的疾病模拟损伤。高保真人原代和 iPSC-RPE 培养物的出现促进了 RPE 线粒体代谢的这种 体外 建模,这些培养物获得了在 体内紧密接近 RPE 所需的适当分化状态和极性。虽然监测此类...
Richard A. Bryan 和 Kin Lo 是 Lucid Scientific 的员工,该公司生产 Resipher 系统。
我们感谢 Daniel Hass 博士和 Jim Hurley 博士提出在新培养基与条件培养基中测试 O2 溶解度作为对照的想法。我们感谢 Magali Saint-Geniez 博士对手稿的编辑意见。我们感谢 Kellogg Eye Center 仪器和电子服务核心的 Scott Szalay 使用 Resipher USB 电缆改造了缺氧室。没有联邦资金用于 HFT 研究。电子服务核心由美国国家眼科研究所的 P30 EY007003提供支持。这项工作得到了预防失明研究 (RPB) 的无限制部门资助的支持。J.M.L.M. 得到了 James Grosfeld 干龄相关性黄斑变性倡议、E. Matilda Ziegler 盲人基金会、Eversight 眼库赠款、国家眼科研究所的 K08EY033420 赠款以及 Dee 和 Dickson Brown 以及 David 和 Lisa Drews 发现希望基金会的支持。DY 得到了新南威尔士大学科学计划的支持。L.A.K. 得到了 Iraty 奖、Monte J. Wallace、Michel Plantevin、美国国家眼科研究所的 R01EY027739 资助以及国防部陆军医学研究采购活动 VR220059 的支持。
Name | Company | Catalog Number | Comments |
0.25% Trypsin-EDTA | Gibco | #25-200-056 | |
3,3',5-triiodo-L-thyronine sodium salt | Sigma | T5516 | |
32-channel Resipher lid | Lucid Scientific | NS32-101A for Falcon | |
Antimycin A from streptomyces sp. | Sigma | A8674-25MG | Inhibitor of Complex III of the electron transport chain |
BAM15 | Sigma | SML1760-5MG | Uncoupling agent to increase mitochondrial respiration |
DMSO, cell culture grade | Sigma-aldrich | D4540-100ML | Vehicle for reconstituting mitochondrial drugs |
Extracellular matrix coating substrates: Synthemax II-SC | Corning | #3535 | Extracellular matrix for hfRPE |
Extracellular matrix coating substrates: Vitronectin | Gibco | A14700 | Extracellular matrix for iPSC-RPE |
FCCP | Sigma | C2920-10MG | Uncoupling agent to increase mitochondrial respiration |
Fetal Bovine Serum (Bio-Techne S11550H) | Bio-Techne | S11550H | |
Hydrocortisone-Cyclodextrin | Sigma | H0396 | |
Hypoxia chamber | Embrient Inc. | MIC-101 | |
N1 Media Supplement | Sigma | N6530 | |
Non-Essential Amino Acids Solution | Gibco | 11140050 | |
O2 sensor | Sensit technology or Forensics Detectors | P100 or FD-90A-O2 | |
Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140-122 | |
Recombinant human TGFβ2 | Peprotech | 100-35B | Transforming growth factor beta-2 to induce epithelial-mesenchymal transition |
Rotenone | Sigma | R8875-1G | Inhibitor of Complex I of the electron transport chain |
System-compatible plate | Corning | #353072 | |
Taurine | Sigma | T8691 | |
αMEM (Alpha Modification of Eagle's Media) | Corning | 15-012-CV |
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