고도로 분화된 편광 망막 색소 상피 배양에서 산소 소비율의 장기 모니터링

요약

망막 색소 상피(RPE) 배양에서 산소 소비율(OCR)을 측정하기 위한 새로운 장치를 소개합니다. 이 장치는 플레이트가 표준 세포 배양 인큐베이터에 있는 동안 표준 배지가 있는 표준 세포 배양 플레이트에서 성장한 RPE에서 한 번에 몇 주 동안 OCR을 측정할 수 있습니다.

초록

미토콘드리아 대사는 광수용체 생존에 중요한 망막 세포의 단층인 망막 색소 상피(RPE)의 정상적인 기능에 매우 중요합니다. RPE 미토콘드리아 기능 장애는 선진국에서 돌이킬 수 없는 실명의 주요 원인인 연령 관련 황반 변성(AMD)과 망막 박리의 실명 합병증인 증식성 유리체 변성증(PVR)의 특징입니다. RPE 퇴행성 질환은 in vivo RPE를 모방하기 위해 고도로 분화되고 분극화된 RPE 배양 시스템에 의해 잘 모델링되었습니다. 그러나 미토콘드리아 기능의 대리물인 산소 소비율(OCR)을 모니터링하는 것은 이상적인 RPE 분극 및 분화를 촉진하는 조건으로 인해 OCR 측정이 쉽지 않기 때문에 이러한 배양 시스템에서는 어려웠습니다.

여기에서는 표준 세포 배양 인큐베이터에서 최적의 성장 기질 및 생리학적 배양 배지에서 RPE를 유지하면서 잘 분화된 RPE 배양에서 한 번에 몇 주 동안 OCR을 모니터링하는 새로운 시스템인 Resipher를 소개합니다. 이 시스템은 세포 위의 매체에 존재하는 산소 농도 구배를 측정하여 OCR을 계산합니다. OCR을 감지하는 다른 방법에 비해 이 시스템의 장점과 RPE 문화권에서 OCR을 측정하기 위한 시스템을 설정하는 방법에 대해 설명합니다. 시스템 사용에 대한 주요 팁과 요령, 데이터 해석에 대한 주의, 예기치 않은 결과를 해결하기 위한 지침을 다룹니다.

또한 시스템에서 감지한 세포 위의 배지 내 산소 구배를 기반으로 저산소증, 정상산소증 또는 고산소증 RPE 배양 경험을 추정할 수 있는 온라인 계산기를 제공합니다. 마지막으로, PVR 모델에서 RPE 세포의 대사 상태를 측정하고 RPE가 저산소증에 대사적으로 적응하는 방법을 이해하는 시스템의 두 가지 응용 프로그램을 검토합니다. 우리는 고도로 분극화되고 분화된 RPE 배양에 이 시스템을 사용하면 생리학적 및 질병 상태 모두에서 RPE 미토콘드리아 대사에 대한 이해를 높일 수 있을 것으로 기대합니다.

서문

망막 색소 상피(RPE)는 기능적으로 분열 후 고도로 분극된 상피 세포의 단층으로, 망막의 빛에 민감한 광수용체와 혈액 순환 사이에 장벽을 형성하며, 융모혈관이라고 하는 모세혈관층입니다. 신경교세포를 지원하는 뉴런의 역할과 마찬가지로, RPE는 광수용체 외부 분절의 식세포작용, 영양소 수송 및 광수용체의 대사 지원, 필수 성장 인자의 분비 등 광수용체를 지원하기 위한 수많은 기능을 수행하며, 이 모든 기능은 시각 기능 유지에 매우 중요합니다.

RPE의 퇴행은 몇 가지 일반적인 퇴행성 시력 장애의 기초가 됩니다. 전 세계에서 불치의 시력 상실의 가장 흔한 원인 중 하나인 연령 관련 황반 변성(AMD)의 경우 RPE가 죽고 이에 따라 상부에 있는 광수용체가 2차 변성을 겪습니다. 증식성 유리체병증(PVR)에서 RPE는 일반적으로 정지된 유사분열 후 상태를 벗어나 신진대사의 변화와 함께 중간엽 상태(소위 상피에서 중간엽으로의 전환[EMT])로 증식 및 역분화됩니다. RPE 역분화는 광수용체에 대한 RPE 지지의 손실을 유발하는 동시에 더 많은 섬유화 상태를 유발합니다. 그 결과 광수용체 변성과 RPE에 의한 흉터가 발생하며, 둘 다 시력 상실을 유발합니다 ^1,2

프로토콜

인간 1차 배양 또는 iPSC-RPE 배양을 확립하기 위한 프로토콜은 다음 참조 15,16,17,18을 참조하십시오. 이러한 프로토콜에 대한 인체 조직의 획득 및 사용은 University of Michigan Institutional Review Board (HUM00105486)에 의해 검토되고 허가되었습니다.

1. RPE 문화에 대한 시스템의 일반적인 적용

1. 시스템 호환 가능한 96웰 플레이트에서 인간 유도 만능 줄기 세포(iPSC) 유래 RPE 또는 일차 인간 RPE 세포를 플레이트합니다.
   1. 24웰 세포 배양 플레이트에서 성장한 기존 성숙한 배양액을 가정하고 인산염 완충 식염수(PBS)로 세포를 한 번 세척한 다음 500μL의 0.25% 트립신-EDTA(Table of Materials)를 추가합니다. 세포 배양 인큐베이터에서 10-40분 동안 배양하고 세포가 둥글고 거의 분리될 준비가 될 때까지 5-10분마다 확인합니다.....

토론

RPE의 미토콘드리아 대사는 AMD 및 PVR을 포함한 일반적인 실명 망막 질환의 발병기전에 중요한 역할을 합니다. RPE 미토콘드리아 대사 를 체외에서 모델링하면 신진대사 상태를 주변 조직의 신진대사 상태와 분리할 수 있을 뿐만 아니라 조직을 통제된 방식으로 다양한 질병 시뮬레이션 모욕에 노출시킬 수 있습니다. 이러한 RPE 미토콘드리아 대사의 in vitro 모델링은 in vivo에서 RPE?.......

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.25% Trypsin-EDTA	Gibco	#25-200-056
3,3',5-triiodo-L-thyronine sodium salt	Sigma	T5516
32-channel Resipher lid	Lucid Scientific	NS32-101A for Falcon
Antimycin A from streptomyces sp.	Sigma	A8674-25MG	Inhibitor of Complex III of the electron transport chain
BAM15	Sigma	SML1760-5MG	Uncoupling agent to increase mitochondrial respiration
DMSO, cell culture grade	Sigma-aldrich	D4540-100ML	Vehicle for reconstituting mitochondrial drugs
Extracellular matrix coating substrates: Synthemax II-SC	Corning	#3535	Extracellular matrix for hfRPE
Extracellular matrix coating substrates: Vitronectin	Gibco	A14700	Extracellular matrix for iPSC-RPE
FCCP	Sigma	C2920-10MG	Uncoupling agent to increase mitochondrial respiration
Fetal Bovine Serum (Bio-Techne S11550H)	Bio-Techne	S11550H
Hydrocortisone-Cyclodextrin	Sigma	H0396
Hypoxia chamber	Embrient Inc.	MIC-101
N1 Media Supplement	Sigma	N6530
Non-Essential Amino Acids Solution	Gibco	11140050
O2 sensor	Sensit technology or Forensics Detectors	P100 or FD-90A-O2
Penicillin-Streptomycin	Gibco	15140-122
Recombinant human TGFβ2	Peprotech	100-35B	Transforming growth factor beta-2 to induce epithelial-mesenchymal transition
Rotenone	Sigma	R8875-1G	Inhibitor of Complex I of the electron transport chain
System-compatible plate	Corning	#353072
Taurine	Sigma	T8691
αMEM (Alpha Modification of Eagle's Media)	Corning	15-012-CV