Monitoraggio a lungo termine dei tassi di consumo di ossigeno in colture epiteliali pigmentate retiniche altamente differenziate e polarizzate

Riepilogo

Presentiamo un nuovo dispositivo per misurare i tassi di consumo di ossigeno (OCR) nelle colture di epiteliale pigmentato retinico (RPE). Il dispositivo è in grado di misurare l'OCR per settimane su RPE coltivate su piastre di coltura cellulare standard con terreni standard mentre le piastre si trovano in un incubatore per colture cellulari standard.

Abstract

Il metabolismo mitocondriale è fondamentale per la normale funzione dell'epitelio pigmentato retinico (RPE), un monostrato di cellule della retina importante per la sopravvivenza dei fotorecettori. La disfunzione mitocondriale RPE è un segno distintivo della degenerazione maculare legata all'età (AMD), la principale causa di cecità irreversibile nei paesi sviluppati, e della vitreoretinopatia proliferativa (PVR), una complicanza accecante dei distacchi di retina. Le condizioni degenerative dell'RPE sono state ben modellate da sistemi di coltura dell'RPE che sono altamente differenziati e polarizzati per imitare l'RPE in vivo . Tuttavia, il monitoraggio dei tassi di consumo di ossigeno (OCR), un proxy per la funzione mitocondriale, è stato difficile in tali sistemi di coltura perché le condizioni che promuovono la polarizzazione e la differenziazione ideali dell'RPE non consentono facili misurazioni OCR.

Qui, introduciamo un nuovo sistema, Resipher, per monitorare l'OCR per settimane alla volta in colture di RPE ben differenziate, mantenendo l'RPE su substrati di crescita ottimali e terreni di coltura fisiologici in un incubatore di coltura cellulare standard. Questo sistema calcola l'OCR misurando il gradiente di concentrazione di ossigeno presente nel mezzo sopra le cellule. Discutiamo i vantaggi di questo sistema rispetto ad altri metodi per rilevare l'OCR e come impostare il sistema per misurare l'OCR nelle colture di RPE. Vengono illustrati i suggerimenti e i trucchi chiave per l'utilizzo del sistema, le avvertenze sull'interpretazione dei dati e le linee guida per la risoluzione dei problemi relativi ai risultati imprevisti.

Forniamo anche un calcolatore online per estrapolare il livello di ipossia, normossia o iperossia sperimentata nelle colture di RPE in base al gradiente di ossigeno nei terreni sopra le cellule rilevate dal sistema. Infine, esaminiamo due applicazioni del sistema, misurando lo stato metabolico delle cellule RPE in un modello PVR e comprendendo come l'RPE si adatta metabolicamente all'ipossia. Prevediamo che l'uso di questo sistema su colture di RPE altamente polarizzate e differenziate migliorerà la nostra comprensione del metabolismo mitocondriale dell'RPE sia in condizioni fisiologiche che patologiche.

Introduzione

L'epitelio pigmentato retinico (RPE) è un monostrato di cellule epiteliali funzionalmente postmitotiche e altamente polarizzate che formano una barriera tra i fotorecettori sensibili alla luce nella retina e la loro circolazione sanguigna, un letto capillare chiamato coriocapillare. Come il ruolo dei neuroni che supportano la glia, l'RPE svolge una miriade di funzioni per supportare i fotorecettori, tra cui la fagocitosi dei segmenti esterni dei fotorecettori, il trasporto di nutrienti e il supporto metabolico per i fotorecettori e la secrezione di fattori di crescita essenziali, tutti fondamentali per il mantenimento della funzione visiva.

La degenerazione dell'EPR è alla base di diversi disturbi degenerativi comuni della vista. Nella degenerazione maculare legata all'età (AMD), una delle cause più comuni di perdita incurabile della vista nel mondo, l'EPR muore e i fotorecettori sovrastanti subiscono quindi una degenerazione secondaria. Nella vitreoretinopatia proliferativa (PVR), l'EPR esce invece dal suo stato postmitotico normalmente quiescente, proliferando e dedifferenziandosi in uno stato mesenchimale (una cosiddetta transizione da epitelio a mesenchima [EMT]) con alterazioni del suo metabolismo. La dedifferenziazione dell'RPE provoca una perdita del supporto dell'RPE ai fotorecettori, innescando anche uno stato più fibrotico. Ciò provoca sia la degenerazione dei fotorecettori che le cicatrici indotte da RPE, che innescano entrambe la perdita della vista ^1,2.

Una parte importante del supporto dell'RPE ai fotorecettori è metabolica e la disregolazione metabolica è un fattore critico in numerose malattie della retina, tra cui AMD e PVR. L'RPE funge da barriera regolatoria tra i fotorecettori e la loro fonte di ossigeno e nutrienti, la coriocapillare. Pertanto, ciò che l'RPE sceglie di metabolizzare rispetto a ciò che l'RPE sceglie di passare dalla coriocapillare ai fotorecettori governa fortemente il metabolismo e la sopravvivenza dei fotorecettori. Numerosi studi hanno dimostrato che l'EPR è fortemente dipendente dal metabolismo mitocondriale per la sua normale salute e che i fotorecettori dipendono invece fortemente dalla glicolisi³. Questo ha introdotto il concetto di stati metabolici complementari e intrecciati tra i fotorecettori e l'EPR. In particolare, l'RPE riduce il suo metabolismo dei substrati metabolici preferiti dai fotorecettori e utilizza invece i sottoprodotti del metabolismo dei fotorecettori combinati con i metaboliti che i fotorecettori non consumano. In malattie come la PVR e l'AMD, l'evidenza suggerisce fortemente che l'RPE diventa più glicolitico e meno dipendente dal metabolismo mitocondriale; questo passaggio alla glicolisi dell'RPE può affamare i fotorecettori dei metaboliti di cui ha bisogno, innescando la degenerazione ^4,5,6. Data l'interdipendenza tra l'RPE e il metabolismo dei fotorecettori e l'alterazione del metabolismo alla base della malattia retinica, c'è un forte interesse nel modellare e manipolare il metabolismo dell'RPE per scopi terapeutici.

Mentre lo studio del metabolismo mitocondriale dell'RPE in vivo è l'ideale, molti aspetti del metabolismo mitocondriale dell'RPE possono essere sondati praticamente solo in un sistema di coltura in vitro. Negli ultimi decenni sono stati compiuti progressi significativi verso colture di RPE ad alta fedeltà, al punto che le colture di RPE più accuratamente curate vengono ora utilizzate per la terapia di sostituzione cellulare negli studi clinici sull'uomo⁷. Per mantenere tali colture ad alta fedeltà, l'RPE deve essere coltivato su particolari substrati in particolari terreni per mesi prima della sperimentazione. Con queste condizioni, le colture di RPE sono massimamente differenziate e polarizzate, approssimando l'RPE in vivo. Sfortunatamente, non sono attualmente disponibili apparecchiature in grado di misurare il metabolismo mitocondriale in modo specifico dall'RPE in vivo. Mentre il monitoraggio dell'ossigeno della rete capillare retinica è stato ottenuto in vivo utilizzando l'ossimetria a risonanza paramagnetica elettronica (EPR)⁸, ciò non è possibile per l'analisi dell'RPE. Le differenze tra il metabolismo dell'RPE in vivo e in vitro non sono ben descritte, ma è stato dimostrato che le colture di RPE hanno un'elevata attività mitocondriale, simile all'RPE in vivo ^3,9, suggerendo che è possibile ottenere informazioni significative sul metabolismo mitocondriale dell'RPE utilizzando colture di RPE ad alta fedeltà.

Poiché tutto il metabolismo mitocondriale porta al consumo di ossigeno, la misurazione dei tassi di consumo di ossigeno (OCR) di RPE è un proxy fedele per il metabolismo mitocondriale. La misurazione dell'OCR nelle colture di RPE è stata difficile, poiché le condizioni che promuovono la massima polarizzazione e differenziazione dell'RPE spesso precludono misurazioni OCR accurate a lungo termine con le tecniche attualmente disponibili, come l'analizzatore di cavallucci marini. In questo articolo sui metodi, viene introdotto un nuovo dispositivo, denominato Resipher (di seguito denominato "il sistema"), che consente la misurazione continua dell'OCR per settimane in RPE cresciuti in condizioni che promuovono al massimo la polarizzazione e la differenziazione. La facilità con cui l'OCR può essere misurato da questo sistema in condizioni di coltura RPE che promuovono al massimo la differenziazione e la polarizzazione dell'RPE è unica tra i dispositivi di misurazione OCR esistenti.

Questo documento fornisce suggerimenti e trucchi per l'utilizzo del sistema con colture RPE, seguito da una dimostrazione di due applicazioni particolari. In primo luogo, l'EMT RPE, che imita la PVR, è innescata dall'esposizione al fattore di crescita trasformante-beta (TGFβ)1,10,11,12. Il sistema viene utilizzato per monitorare l'evoluzione del metabolismo dell'RPE durante il processo EMT. In secondo luogo, il ruolo dell'ipossia nel metabolismo dell'RPE viene esplorato utilizzando questo sistema. L'ipossia è un importante contributo alla patogenesi dell'AMD, poiché la coriocapillare si assottiglia con l'età di^13,14 anni. La combinazione di questo sistema con le camere di ipossia consente di modellare il metabolismo mitocondriale dell'RPE alterato con l'ipossia sottile che accompagna l'invecchiamento. Infine, viene introdotto un calcolatore online che utilizza i dati Resipher per consentire di determinare se le colture di RPE sono in condizioni ipossiche, normossiche o iperossiche. Tali informazioni sono fondamentali per trarre conclusioni sul metabolismo degli RPE da studi in vitro su colture di RPE.

Protocollo

Per i protocolli per stabilire colture primarie umane o iPSC-RPE, vedere i seguenti riferimenti 15,16,17,18. L'acquisizione e l'uso di tessuto umano per questi protocolli sono stati esaminati e autorizzati dall'Institutional Review Board (HUM00105486) dell'Università del Michigan.

1. Applicazione generale del sistema alla coltura RPE

1. Piastra di cellule staminali pluripotenti indotte umane (iPSC) derivate da RPE o cellule RPE umane primarie in piastre a 96 pozzetti compatibili con il sistema.
   1. Supponendo colture mature già esistenti coltivate su piastre di coltura cellulare a 24 pozzetti, lavare le cellule con soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) una volta e quindi aggiungere 500 μl di tripsina-EDTA allo 0,25% (Tabella dei materiali). Incubare per 10-40 minuti in un incubatore per colture cellulari, controllando ogni 5-10 minuti fino a quando le cellule sono arrotondate e quasi pronte a staccarsi.
   2. Pipettare delicatamente i terreni sulle cellule per staccarle dalla plastica di coltura cellulare, quindi trasferirli a un volume 3x di terreno di coltura cellulare (1.500 μl per 24 pozzetti), centrifugando in una centrifuga a 250 × g per 5 minuti a temperatura ambiente.
      NOTA: La ricetta per i terreni di coltura cellulare RPE è dettagliata nella Tabella 1 e disponibile nei riferimenti precedentemente pubblicati 9,15,16,17,18.
   3. Risospendere le cellule in terreni di coltura cellulare RPE con il 15% di siero fetale bovino (FBS) e contare le cellule con un emocitometro.
   4. Seminare 74.000 cellule per ogni pozzetto di una piastra da 96 pozzetti (generalmente 225-300 × 10⁵ cellule/cm²), dopo il rivestimento con substrati di rivestimento a matrice extracellulare altamente specializzati (Tabella dei materiali) seguendo le istruzioni del produttore.
      NOTA: Conservare le celle solo su una piastra compatibile con Resipher (Tabella dei materiali) e solo nei pozzetti corrispondenti all'array di sonde sul coperchio di rilevamento (colonne 3, 4, 9 e 10 per il coperchio a 32 canali; vedere Tabella dei materiali). Il coperchio di rilevamento del sistema è disponibile con sensori a 4, 32 o 96 canali (vedere le posizioni dei sensori nella Figura 1A-D) ed è compatibile una gamma di piastre per colture cellulari standard.
   5. Poiché i pozzetti sul bordo sono soggetti a evaporazione, il che influisce notevolmente sulla disponibilità di ossigeno, e quindi sulle letture OCR, evitare di seminare le cellule su tutti i pozzetti sul bordo (file A e H di una piastra a 96 pozzetti). Inoltre, aggiungere 200 μl di acqua sterile in ciascuno dei pozzetti vuoti della piastra a 96 pozzetti per ridurre gli effetti dell'evaporazione.
   6. Tenere la piastra su una superficie stabile del tavolo per 10 minuti per consentire alle celle di stabilizzarsi; Quindi rimettilo nell'incubatrice. Sostituire il terreno dopo 24-72 ore, sostituendolo con terreno di coltura RPE standard con il 5% di FBS. Coltura per almeno 4 settimane, cambiando i media 2 volte a settimana.
      NOTA: Le cellule sono pronte per la sperimentazione quando sono pigmentate, acciottolate e altamente compatte (Figura 1E).
2. Impostazione e acquisizione dei dati con il sistema
   1. Posizionare il coperchio di rilevamento su una piastra ricevente vuota da 96 pozzetti e riposizionarla nell'incubatore per colture cellulari. Allineare e montare il dispositivo sul coperchio di rilevamento e collegarlo all'hub tramite il cavo USB in dotazione. Questo crea un "sandwich" Resipher (Figura 2A).
   2. Vai all'applicazione del sito Web del laboratorio Lucid (https://lab.lucidsci.com/) e fai clic sul pulsante Nuovo esperimento nell'angolo in alto a destra per creare un nuovo esperimento.
   3. Nomina il titolo dell'esperimento e inserisci tutte le note sperimentali rilevanti per lo studio specifico (ad esempio, il numero di passaggio dell'iPSC-RPE che stai utilizzando).
   4. Creare condizioni di bene e gruppi di trattamento. Ad esempio, se si testano gli effetti di diverse concentrazioni sieriche nel terreno con OCR, selezionare Siero nel nome del gruppo, quindi immettere le concentrazioni sieriche del terreno da utilizzare, aggiungendo altri valori percentuali di siero facendo clic sul pulsante + . Assegna quali pozzetti riceveranno una particolare percentuale di siero e seleziona un modello di colore per quei pozzetti. Aggiungi altri gruppi (ad esempio, una variabile sperimentale diversa da testare) secondo necessità facendo clic sul pulsante Aggiungi gruppo .
   5. Definire la configurazione della piastra e selezionare il dispositivo e lo stile della piastra corrispondenti. Fare clic sul pulsante Aggiungi piastra e scegliere Dispositivo; Selezionare il tipo di targa. Seleziona il trattamento e fai clic sul pozzetto corrispondente.
   6. Fai clic sul pulsante Inizia ora per avviare l'esperimento. Verificare che l'indicatore sul sito Web e il LED sull'hub siano di colore verde fisso.
   7. Lasciare in funzione il sistema per 15-60 minuti per garantire che ogni sensore sia calibrato correttamente e rilevi accuratamente l'ossigeno atmosferico, che dovrebbe essere a una concentrazione di ~200 μM in un incubatore per colture cellulari completamente umidificato con il 5% di CO₂ (Figura 2Bi).
      NOTA: Se uno dei sensori si trova in uno dei sensori in una configurazione standard di incubatore per colture cellulari, è consigliabile escluderlo nell'analisi dei dati, poiché il sensore è difettoso (Figura 2Bii).
      NOTA: Se tutti i sensori sono sfasati di oltre il 20% rispetto alla media degli altri sensori e rispetto all'O₂ atmosferico previsto riportato come 200 μM in una configurazione standard di incubatore per colture cellulari, il coperchio di rilevamento è stato utilizzato troppe volte; sostituirlo con un nuovo coperchio di rilevamento (Figura 2Biii).
      NOTA: Ottenere le letture di O₂ nell'aria prima di iniziare un esperimento migliora significativamente la risoluzione dei problemi in seguito. Se un particolare pozzetto appare come un valore anomalo dopo che un esperimento è stato fatto e quel pozzetto aveva un sensore che non era calibrato, il problema potrebbe essere con il sensore, non con la replica biologica.
   8. Rimuovere il dispositivo dal coperchio di rilevamento (ma non staccare il cavo USB dal dispositivo). Posizionare il dispositivo capovolto nell'incubatrice per consentire il ripristino del motore del dispositivo. Non riutilizzare il dispositivo fino a quando tutti i suoni del motore non si sono fermati (circa 20-30 s).
      NOTA: È importante mantenere il dispositivo sempre collegato all'hub tramite il cavo USB durante un esperimento, anche quando il dispositivo è fuori dal coperchio di rilevamento. Ciò consente al dispositivo di monitorare e segnalare continuamente l'ambiente dell'incubatore per colture cellulari.
   9. Riposizionare la piastra con il coperchio di rilevamento nella cappa di coltura cellulare, insieme a una piastra da 96 pozzetti contenente le colture di RPE. Sostituire il terreno nella piastra con colture RPE con lo stesso terreno e lo stesso volume per tutti i pozzetti per ottenere i valori OCR di base per ciascun pozzetto. Assicurati di riempire tutti i pozzetti senza RPE con acqua sterile per prevenire l'evaporazione.
      NOTA: In generale, si raccomandano 60-100 μL di terreno di coltura RPE per 96 pozzetti, sulla base di dati che dimostrano che volumi di terreno più bassi portano a una rapida deplezione dei nutrienti, ma volumi più elevati portano a ipossia involontaria⁹.
   10. Trasferire il coperchio di rilevamento sulla piastra contenente le colture cellulari e il coperchio standard (non Resipher) sulla piastra contenente le colture cellulari sulla piastra ricevente vuota a 96 pozzetti per mantenere la sterilità del coperchio standard, che sarà necessaria in vari punti durante la sperimentazione.
   11. Riposizionare la piastra con le colture cellulari e il coperchio di rilevamento nell'incubatore per colture cellulari. Ancora una volta, allineare e montare il dispositivo sul coperchio di rilevamento e collegarlo all'Hub tramite il cavo USB in dotazione (assemblando il "sandwich"). Verificare che gli indicatori sull'interfaccia del sito Web e sull'hub siano tutti verdi fissi.
       NOTA: I dati sulla concentrazione di O₂ verranno visualizzati immediatamente, mentre i dati OCR verranno visualizzati solo dopo che sono stati raccolti dati sufficienti su O₂ , circa 1 ora.
   12. Lasciare che il dispositivo misuri l'OCR su ciascun pozzetto per almeno 12-24 ore per acquisire un OCR di base.
       NOTA: L'OCR di base differirà a seconda di molti fattori, incluso il tipo di terreno applicato alle cellule. Nella Figura 2C, i terreni di coltura RPE standard con diverse quantità di FBS (0%, 5%, 15%) hanno valori OCR leggermente diversi. Inoltre, le colture con più FBS possono sostenere l'attività mitocondriale più a lungo dopo l'applicazione del terreno alle cellule prima che l'OCR diminuisca a causa della deplezione dei metaboliti mitocondriali (lato destro della curva).
   13. Una volta ottenuto un OCR di base, ripetere i passaggi 1.2.8-1.2.12, ma cambiare il terreno sulla piastra con le colture di RPE in base alle proprie condizioni sperimentali (in genere, ± un farmaco o un confronto di diverse condizioni del terreno).
       NOTA: Anche le modifiche di routine dei supporti possono essere gestite allo stesso modo. Ogni volta che l'incubatore per colture cellulari viene aperto, aspettatevi un'interruzione significativa delle letture OCR, poiché dipendono da temperatura, umidità, concentrazioni di CO₂ e altri fattori che vengono temporaneamente interrotti con l'apertura della porta dell'incubatore. Durante la rimozione del dispositivo dal coperchio di rilevamento, non è necessario mettere in pausa l'esperimento online. Dopo l'apertura dello sportello dell'incubatore per colture cellulari o la sostituzione del terreno sulla piastra da sondare, in genere sono necessarie 2-4 ore per ristabilire il gradiente di ossigeno e iniziare a misurare un OCR accurato.
   14. Dopo aver ottenuto i dati, sottrarre l'OCR basale per ciascun pozzetto dall'OCR dopo l'applicazione della condizione sperimentale, per determinare l'OCR Delta attivato dal trattamento.
   15. Al termine dell'esperimento, sterilizzare e riutilizzare il coperchio di rilevamento (che può essere riutilizzato 3-5 volte, anche se le prestazioni diminuiscono con l'uso ripetuto). Per sterilizzare il coperchio di rilevamento, immergere l'intero coperchio in etanolo al 70% per 10 minuti in una cappa di coltura cellulare, quindi rimuoverlo dall'immersione e farlo riposare nella sonda dell'armadio con il lato rivolto verso l'alto (evitare di toccare le delicate punte della sonda) e lasciare evaporare completamente l'etanolo e l'acqua prima di mettere il coperchio di rilevamento su una nuova piastra ricevente a 96 pozzetti.
3. Scatta immagini in campo chiaro per normalizzare i valori OCR al numero di cella.
   NOTA: L'accumulo di melanina nell'RPE facilita la normalizzazione dell'OCR basata su un semplice conteggio del numero di cellule in colture viventi utilizzando un microscopio a campo chiaro.
   1. Rimuovere il dispositivo e posizionarlo capovolto, come al punto 1.2.8. Nella cappa per colture cellulari, sostituire il coperchio di rilevamento sulla piastra di coltura RPE con un coperchio standard a 96 pozzetti.
   2. Utilizzando un microscopio invertito standard, scattare immagini in campo chiaro di ciascun pozzetto.
      NOTA: Mantenere le immagini dell'area uno coerenti tra i pozzetti (posizione relativa nel pozzetto e ingrandimento dell'obiettivo).
   3. Nella cappa per colture cellulari, sostituire il coperchio standard a 96 pozzetti della piastra di coltura RPE con il coperchio di rilevamento e riporlo nell'incubatore per un ulteriore monitoraggio.
   4. Conta il numero di celle in ogni pozzetto con ImageJ o un altro software.
   5. Normalizzare l'OCR al numero di cellule nei diversi gruppi sperimentali. Il sistema riporta l'OCR in unità di fmol∙(mm²)^-1∙^s-1-il consumo per area dell'unità trasversale. Pertanto, per normalizzare l'OCR per cella, dividere l'OCR per il numero di cellule per mm² (anziché per il numero di cellule per pozzetto). Equivalentemente, moltiplicare l'OCR riportato dal sistema per l'area della sezione trasversale del pozzetto (circa 31 mm² per una piastra standard a 96 pozzetti) per ottenere l'OCR in unità di fmol∙^s-1∙^well-1.
4. Controlli per la determinazione dei parametri bioenergetici dell'RPE.
   NOTA: Per garantire che il sistema e le colture di RPE rispondano alle manipolazioni mitocondriali in modi prevedibili, è possibile testare alcune piccole molecole ben consolidate per mirare a particolari passaggi della fosforilazione ossidativa mitocondriale. Questi test sono analoghi alle fasi eseguite in un test da sforzo mitocondriale utilizzando il Seahorse Analyzer¹⁰ e forniscono un profilo bioenergetico per le colture di RPE.
   1. Coltivare le cellule RPE in 65 μL di terreno di coltura RPE standard con il 5% di FBS e misurare l'OCR per 24 ore per stabilire un valore di riferimento.
   2. Aspirare i terreni di coltura e aggiungere 65 μL di terreno di coltura RPE standard con FBS al 5% e con disaccoppiatori mitocondriali (3 μM di cianuro di carbonile-p-trifluorometossifenilidrazone [FCCP] o 500 nM Bam15, Tabella dei materiali). Incubare per una notte.
      NOTA: I disaccoppiatori mitocondriali dovrebbero aumentare significativamente l'OCR. Assicurarsi che l'aumento dell'OCR non sia pari o vicino all'OCR teorico massimo limitato alla diffusione di circa 275 fmol∙(mm²)^-1∙^s-1 per 65 μL di terreno in condizioni di coltura standard. L'OCR massimo per i diversi volumi multimediali di uso comune è disponibile nella sezione Discussione.
   3. Dopo l'incubazione notturna, aspirare il terreno con disaccoppiatori mitocondriali e sostituirlo con 65 μL di terreno di coltura RPE standard con FBS al 5%. Osservare la piastra per altre 24 ore per determinare il recupero dell'OCR dell'RPE dopo la rimozione dei farmaci.
   4. Calcolare gli effetti dei disaccoppiatori sull'OCR sottraendo l'OCR ottenuto dopo il trattamento dall'OCR ottenuto prima del trattamento (Figura 3).
      NOTA: L'aumento dell'OCR con l'aggiunta di disaccoppiatori mitocondriali indica la capacità respiratoria mitocondriale di riserva della cellula¹⁹.
   5. Per misurare altri parametri mitocondriali tipicamente acquisiti durante il test da sforzo mitocondriale con un analizzatore di cavallucci marini, eseguire gli stessi passaggi precedenti con i seguenti composti (Figura 4).
      1. Utilizzare l'oligomicina a 1 μM per valutare la respirazione legata all'ATP.
      2. Utilizzare l'antimicina A e il rotenone a 1 μM per valutare la presenza di qualsiasi respirazione non mitocondriale.
         NOTA: FCCP, oligomicina, antimicina A e rotenone possono essere tossici per l'RPE. Se inducono una morte cellulare significativa, le misurazioni OCR non saranno accurate. Pertanto, le misurazioni OCR dovrebbero essere ottenute solo in un momento in cui non vi è una morte cellulare evidente, generalmente entro le prime ore dopo l'aggiunta dei farmaci (Figura 4).

2. Misurazione delle variazioni del metabolismo mitocondriale nell'RPE sottoposta a EMT

1. Seguire lo stesso protocollo descritto nella sezione 1.2.
2. Per indurre l'EMT dopo aver ottenuto le misurazioni OCR al basale, aggiungere TGF-β2 (10 ng/mL) alle colture di RPE e monitorare l'OCR per 3 settimane. Aggiornare i terreni con TGFβ2 fresco ogni 2-3 giorni (Figura 5).
3. Almeno 2 volte alla settimana, ottenere immagini in campo chiaro come nella sezione 1.3 per assicurarsi che la conta delle cellule non cambi. Se il conteggio cambia, normalizzare i valori OCR in base al numero di cella in ciascun pozzetto.
   NOTA: Lo stesso protocollo può essere utilizzato per altri induttori di EMT per monitorare i cambiamenti dell'OCR a lungo termine durante il periodo di coltura mentre le cellule sono nell'incubatore.

3. Misurazione delle variazioni del metabolismo mitocondriale nell'RPE ipossica

NOTA: L'applicazione del sistema in condizioni di ipossia, normossia o iperossia è la stessa della sezione 1.2, ad eccezione del mantenimento del "sandwich" in una camera di ipossia (Tabella dei materiali) collocata in un incubatore per colture cellulari standard.

1. Praticare un foro sul coperchio della camera di ipossia per montare il cavo USB di tipo c e sigillarlo con silicone o stucco (Figura 6A).
2. Montare il coperchio di rilevamento con la piastra di coltura cellulare nella cappa e trasferirli nella camera di ipossia.
3. Installare il "sandwich" (piastra, coperchio di rilevamento, dispositivo) nella camera di ipossia. Metti anche nella camera dell'ipossia una capsula di Petri con acqua sterile per aiutare a mantenere l'umidità. Infine, posizionare un sensore portatile di O₂ nella camera di ipossia (Tabella dei materiali). L'impostazione è visualizzata nella Figura 6A.
4. Sigillare la camera e collegarla a una bombola di gas con una concentrazione ipossica di O₂ e una concentrazione standard di CO₂ in coltura cellulare (ad esempio, 1% O₂ e 5% CO₂).
5. Scambiare lentamente l'aria nella camera di ipossia con l'aria all'1% di O₂/5% di CO₂ nel cilindro fino a quando il sensore di ossigeno mostra la concentrazione di O₂ desiderata, di solito tra l'1% e il 10%.
   NOTA: Il sensore portatile di O₂ richiede tempo per equilibrarsi, quindi il gas dalla bombola deve essere aggiunto lentamente nella camera di ipossia.
6. Chiudere le valvole di ingresso e uscita della camera di ipossia e trasferire l'intera camera nell'incubatrice.
7. Impostare e avviare l'esperimento come nella sezione 1.2.
   NOTA: Il pre-equilibramento dei terreni nella camera di ipossia prima dell'aggiunta alle cellule può ridurre il tempo necessario al monostrato cellulare per sperimentare l'ipossia vera (Figura 6B).

4. Calcolo della concentrazione di O₂ nel monostrato di RPE per determinare se le cellule sono in condizioni ipossiche, normossiche o iperossiche

NOTA: Per impostazione predefinita, il sistema misura la concentrazione di O₂ tra circa 1 e 1,5 mm sopra il fondo del pozzetto, supponendo che venga utilizzata una piastra standard con il corrispondente coperchio di rilevamento consigliato per la coltura monostrato (fare riferimento a https://lucidsci.com/docs/LucidScientific_Sensing_Lid_Selection_Guide.pdf). Sebbene la concentrazione di O₂ nel monostrato cellulare non sia misurata direttamente, i dati del sistema possono essere utilizzati per stimare la concentrazione di O₂ a livello dell'RPE. In particolare, sapendo che esiste un gradiente di ossigeno tra la parte superiore della colonna del terreno, dove è disponibile l'O₂ , e la parte inferiore della colonna del terreno, dove l'O₂ viene consumato, le leggi di diffusione di Fick possono essere combinate con il tasso di OCR misurato per estrapolare i livelli di O₂ nel monostrato cellulare. Un calcolatore per questa stima è fornito online: https://lucidsci.com/notes?entry=oxygen_diffusion (e sotto forma di un taccuino interattivo open source su https://observablehq.com/@lucid/oxygen-diffusion-and-flux-in-cell-culture, il codice sorgente di questo calcolatore potrebbe essere trovato su https://github.com/lucidsci/oxygen-diffusion-calculator).

1. Una volta effettuato l'accesso alla calcolatrice, inserire il volume del terreno in microlitri (ad esempio, 100 μL).
2. Inserire la concentrazione di ossigeno saturo all'interfaccia aria-liquido (la parte superiore della colonna del fluido sopra le celle). Questo valore è ~185 μM a pressione atmosferica standard con 5% O₂ e 95% di umidità.
   NOTA: Questo può essere determinato anche dalle misurazioni di O₂ mediante sonde di sistema in pozzetti di solo terreno (senza celle sul fondo del pozzetto).
3. Nell'input Flusso, immettere il flusso/OCR riportato dal sistema.
4. Sulla base di questi valori, la concentrazione di ossigeno allo stato stazionario a ciascuna altezza nella colonna del terreno viene calcolata e mostrata nel grafico (Figura 7). L'asse x del grafico è l'altezza in mm sopra il fondo del pozzo. L'asse y è la concentrazione di O₂ calcolata a quell'altezza (in μM).
5. La concentrazione di O₂ sul fondo del pozzetto (dove si trovano le cellule) è riportata nella riga sotto il grafico.
   NOTA: In generale, si stima che l'RPE in vivo veda una concentrazione di O₂ del 4-9%. Ogni 10 μM di O₂ in condizioni atmosferiche standard corrisponde a circa l'1% di O₂. Pertanto, la normossia a livello delle cellule è di circa 40-90 μM di O₂. Più alta è la colonna del supporto, più basso sarà l'O₂ a livello del monostrato RPE⁹. Pertanto, se le cellule sembrano essere in condizioni di ipossia, il volume del terreno può essere ridotto. Se le cellule sembrano essere in condizioni iperossiche, il volume del terreno può essere aumentato.

Risultati

La configurazione "a sandwich" per l'esperimento Resipher è dimostrata nella Figura 2A. I coperchi di rilevamento con 32 sonde corrispondenti alle colonne 3, 4, 9 e 10 sulla piastra a 96 pozzetti si trovano tra la piastra della cella e il dispositivo. Dopo il collegamento all'hub, il dispositivo attiva i motori per spostare il coperchio di rilevamento su e giù, misurando la concentrazione di O₂ nella colonna del fluido a un intervallo di altezze sopra il monostrato della cella (...

Discussione

Il metabolismo mitocondriale dell'RPE svolge un ruolo critico nella patogenesi delle comuni malattie retiniche cieche, tra cui AMD e PVR. La modellazione del metabolismo mitocondriale dell'RPE in vitro consente di isolare il suo stato metabolico da quelli dei tessuti circostanti, oltre a sottoporre il tessuto a diversi insulti che simulano la malattia in modo controllato. Tale modellazione in vitro del metabolismo mitocondriale dell'RPE è stata facilitata dall'avvento di colture primarie umane ad alta ...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.25% Trypsin-EDTA	Gibco	#25-200-056
3,3',5-triiodo-L-thyronine sodium salt	Sigma	T5516
32-channel Resipher lid	Lucid Scientific	NS32-101A for Falcon
Antimycin A from streptomyces sp.	Sigma	A8674-25MG	Inhibitor of Complex III of the electron transport chain
BAM15	Sigma	SML1760-5MG	Uncoupling agent to increase mitochondrial respiration
DMSO, cell culture grade	Sigma-aldrich	D4540-100ML	Vehicle for reconstituting mitochondrial drugs
Extracellular matrix coating substrates: Synthemax II-SC	Corning	#3535	Extracellular matrix for hfRPE
Extracellular matrix coating substrates: Vitronectin	Gibco	A14700	Extracellular matrix for iPSC-RPE
FCCP	Sigma	C2920-10MG	Uncoupling agent to increase mitochondrial respiration
Fetal Bovine Serum (Bio-Techne S11550H)	Bio-Techne	S11550H
Hydrocortisone-Cyclodextrin	Sigma	H0396
Hypoxia chamber	Embrient Inc.	MIC-101
N1 Media Supplement	Sigma	N6530
Non-Essential Amino Acids Solution	Gibco	11140050
O2 sensor	Sensit technology or Forensics Detectors	P100 or FD-90A-O2
Penicillin-Streptomycin	Gibco	15140-122
Recombinant human TGFβ2	Peprotech	100-35B	Transforming growth factor beta-2 to induce epithelial-mesenchymal transition
Rotenone	Sigma	R8875-1G	Inhibitor of Complex I of the electron transport chain
System-compatible plate	Corning	#353072
Taurine	Sigma	T8691
αMEM (Alpha Modification of Eagle's Media)	Corning	15-012-CV