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  • Résumé
  • Résumé
  • Introduction
  • Protocole
  • Résultats
  • Discussion
  • Déclarations de divulgation
  • Remerciements
  • matériels
  • Références
  • Réimpressions et Autorisations

Résumé

Nous présentons un nouvel appareil pour mesurer les taux de consommation d’oxygène (OCR) dans les cultures d’épithélium pigmentaire rétinien (EPR). L’appareil peut mesurer l’OCR pendant des semaines sur des EPR cultivés sur des plaques de culture cellulaire standard avec des milieux standard pendant que les plaques sont dans un incubateur de culture cellulaire standard.

Résumé

Le métabolisme mitochondrial est essentiel au fonctionnement normal de l’épithélium pigmentaire rétinien (EPR), une monocouche de cellules de la rétine importante pour la survie des photorécepteurs. Le dysfonctionnement mitochondrial de l’EPR est une caractéristique de la dégénérescence maculaire liée à l’âge (DMLA), la principale cause de cécité irréversible dans les pays développés, et de la vitréorétinopathie proliférative (PVR), une complication cécitante des décollements de rétine. Les conditions dégénératives de l’EPR ont été bien modélisées par des systèmes de culture d’EPR qui sont hautement différenciés et polarisés pour imiter l’EPR in vivo . Cependant, la surveillance des taux de consommation d’oxygène (OCR), un indicateur de la fonction mitochondriale, a été difficile dans de tels systèmes de culture, car les conditions qui favorisent la polarisation et la différenciation idéales de l’EPR ne permettent pas de mesurer facilement l’OCR.

Ici, nous présentons un nouveau système, Resipher, pour surveiller l’OCR pendant des semaines à la fois dans des cultures d’EPR bien différenciées tout en maintenant l’EPR sur des substrats de croissance optimaux et des milieux de culture physiologiques dans un incubateur de culture cellulaire standard. Ce système calcule l’OCR en mesurant le gradient de concentration en oxygène présent dans les milieux au-dessus des cellules. Nous discutons des avantages de ce système par rapport aux autres méthodes de détection de l’OCR et de la manière de mettre en place le système de mesure de l’OCR dans les cultures d’EPR. Nous abordons les principaux conseils et astuces pour l’utilisation du système, la prudence dans l’interprétation des données et les instructions pour résoudre les problèmes de résultats inattendus.

Nous fournissons également un calculateur en ligne pour extrapoler le niveau d’hypoxie, de normoxie ou d’hyperoxie ressenti par les cultures d’EPR en fonction du gradient d’oxygène dans le milieu au-dessus des cellules détectées par le système. Enfin, nous passons en revue deux applications du système, en mesurant l’état métabolique des cellules EPR dans un modèle PVR et en comprenant comment l’EPR s’adapte métaboliquement à l’hypoxie. Nous prévoyons que l’utilisation de ce système sur des cultures d’EPR hautement polarisées et différenciées améliorera notre compréhension du métabolisme mitochondrial de l’EPR à la fois dans des états physiologiques et pathologiques.

Introduction

L’épithélium pigmentaire rétinien (EPR) est une monocouche de cellules épithéliales fonctionnellement postmitotiques et hautement polarisées qui forment une barrière entre les photorécepteurs sensibles à la lumière de la rétine et leur circulation sanguine, un lit capillaire appelé choriocapillaire. Comme le rôle des neurones de soutien de la glie, l’EPR remplit une myriade de fonctions pour soutenir les photorécepteurs, y compris la phagocytose des segments externes des photorécepteurs, le transport des nutriments et le soutien métabolique des photorécepteurs, et la sécrétion de facteurs de croissance essentiels, tous essentiels au maintien de la fonction visuelle.

La dégénérescence de l’EPR est à l’origine de plusieurs troubles dégénératifs courants de la vision. Dans la dégénérescence maculaire liée à l’âge (DMLA), l’une des causes les plus courantes de perte de vision incurable dans le monde, l’EPR meurt, et les photorécepteurs sus-jacents souffrent donc d’une dégénérescence secondaire. Dans la vitréorétinopathie proliférative (PVR), l’EPR sort de son état postmitotique normalement quiescent, proliférant et se dédifférenciant en un état mésenchymateux (une transition dite épithéliale à mésenchymateuse [EMT]) avec des altérations de son métabolisme. La dédifférenciation de l’EPR entraîne une perte de support de l’EPR vers les photorécepteurs tout en déclenchant un état plus fibreux. Cela entraîne à la fois une dégénérescence des photorécepteurs et des cicatrices induites par l’EPR, qui déclenchent toutes deux une perte de vision 1,2.

Une grande partie du soutien de l’EPR aux photorécepteurs est métabolique, et la dérégulation métabolique est un facteur critique dans de nombreuses maladies rétiniennes, y compris la DMLA et la PVR. L’EPR sert de barrière régulatrice entre les photorécepteurs et leur source d’oxygène et de nutriments, le choriocapillaire. Ainsi, ce que l’EPR choisit de métaboliser par rapport à ce qu’il choisit de passer du choriocapillaire aux photorécepteurs régit fortement le métabolisme et la survie des photorécepteurs. De nombreuses études ont montré que l’EPR dépend fortement du métabolisme mitochondrial pour sa santé normale, et que les photorécepteurs dépendent fortement de la glycolyse3. Cela a introduit le concept d’états métaboliques complémentaires et entrelacés entre les photorécepteurs et l’EPR. Plus précisément, l’EPR réduit son métabolisme des substrats métaboliques préférés des photorécepteurs et utilise à la place les sous-produits du métabolisme des photorécepteurs combinés aux métabolites que les photorécepteurs ne consomment pas. Dans des maladies telles que la PVR et la DMLA, les preuves suggèrent fortement que l’EPR devient plus glycolytique et moins dépendant du métabolisme mitochondrial ; ce changement vers la glycolyse de l’EPR peut priver les photorécepteurs des métabolites dont ils ont besoin, déclenchant une dégénérescence 4,5,6. Étant donné à quel point le métabolisme de l’EPR et des photorécepteurs est interdépendant et à quel point le métabolisme altéré sous-tend la maladie rétinienne, il existe un fort intérêt pour la modélisation et la manipulation du métabolisme de l’EPR à des fins thérapeutiques.

Bien que l’étude du métabolisme mitochondrial de l’EPR in vivo soit idéale, de nombreux aspects du métabolisme mitochondrial de l’EPR ne peuvent être sondés pratiquement que dans un système de culture in vitro. Des progrès significatifs ont été réalisés au cours des dernières décennies vers des cultures d’EPR haute fidélité, au point que les cultures d’EPR les plus soigneusement préparées sont maintenant utilisées pour la thérapie de remplacement cellulaire dans les essais cliniques sur l’homme7. Pour maintenir de telles cultures haute fidélité, l’EPR doit être cultivé sur des substrats particuliers dans des milieux particuliers pendant des mois avant l’expérimentation. Dans ces conditions, les cultures d’EPR sont différenciées et polarisées au maximum, ce qui se rapproche de l’EPR in vivo. Malheureusement, il n’existe actuellement aucun équipement capable de mesurer le métabolisme mitochondrial spécifiquement à partir de l’EPR in vivo. Bien que la surveillance de l’oxygène du réseau capillaire rétinien ait été réalisée in vivo à l’aide de l’oxymétrie par résonance paramagnétique électronique (EPR)8, cela n’est pas possible pour l’analyse RPE. Les différences entre le métabolisme de l’EPR in vivo et in vitro ne sont pas bien décrites, mais il a été démontré que les cultures d’EPR ont une activité mitochondriale élevée, similaire à l’EPR in vivo 3,9, ce qui suggère que des informations significatives sur le métabolisme mitochondrial de l’EPR peuvent être obtenues en utilisant des cultures EPR haute fidélité.

Comme tout métabolisme mitochondrial conduit à la consommation d’oxygène, la mesure des taux de consommation d’oxygène (OCR) de l’EPR est un indicateur fidèle du métabolisme mitochondrial. La mesure de l’OCR dans les cultures d’EPR a été difficile, car les conditions qui favorisent la polarisation et la différenciation maximales de l’EPR empêchent souvent des mesures OCR précises à long terme avec les techniques actuellement disponibles, telles que l’analyseur Seahorse. Dans cet article sur les méthodes, un nouveau dispositif, appelé Resipher (ci-après dénommé « le système »), est présenté, qui permet une mesure continue de l’OCR pendant des semaines dans des EPR cultivés dans des conditions qui favorisent au maximum la polarisation et la différenciation. La facilité avec laquelle l’OCR peut être mesurée par ce système dans des conditions de culture d’EPR qui favorisent au maximum la différenciation et la polarisation de l’EPR est unique parmi les appareils de mesure OCR existants.

Cet article fournit des conseils et des astuces pour l’utilisation du système avec des cultures RPE, suivis d’une démonstration de deux applications particulières. Tout d’abord, l’EPR EMT, imitant la PVR, est déclenchée par l’exposition au facteur de croissance transformant-bêta (TGFβ)1,10,11,12. Le système est utilisé pour surveiller l’évolution du métabolisme de l’EPR au cours du processus EMT. Deuxièmement, le rôle de l’hypoxie dans le métabolisme de l’EPR est exploré à l’aide de ce système. L’hypoxie est un contributeur important à la pathogenèse de la DMLA, car le choriocapillaire s’amincit avec l’âge de13 ou 14 ans. La combinaison de ce système avec des chambres d’hypoxie permet de modéliser le métabolisme mitochondrial de l’EPR altéré avec l’hypoxie subtile qui accompagne le vieillissement. Enfin, un calculateur en ligne utilisant les données Resipher est introduit pour permettre de déterminer si les cultures d’EPR sont dans des conditions hypoxiques, normoxiques ou hyperoxiques. Ces informations sont essentielles pour tirer des conclusions sur le métabolisme de l’EPR à partir d’études de culture in vitro sur l’EPR.

Protocole

Pour les protocoles permettant d’établir des cultures primaires humaines ou iPSC-RPE, voir les références suivantes 15,16,17,18. L’acquisition et l’utilisation de tissus humains pour ces protocoles ont été examinées et autorisées par le Conseil d’examen institutionnel de l’Université du Michigan (HUM00105486).

1. Application générale du système à la culture de l’EPR

  1. Plaque de cellules souches pluripotentes induites humaines (iPSC) dérivées de l’EPR ou cellules EPR humaines primaires dans des plaques à 96 puits compatibles avec le système.
    1. En supposant que des cultures matures déjà existantes soient cultivées sur des plaques de culture cellulaire à 24 puits, lavez les cellules avec une solution saline tamponnée au phosphate (PBS) une fois, puis ajoutez 500 μL de trypsine-EDTA à 0,25 % (Table des matériaux). Incuber pendant 10 à 40 minutes dans un incubateur de culture cellulaire, en vérifiant toutes les 5 à 10 minutes jusqu’à ce que les cellules soient arrondies et presque prêtes à se détacher.
    2. Pipeter doucement le milieu sur les cellules pour les détacher du plastique de culture cellulaire, puis transférer dans 3 fois le volume du milieu de culture cellulaire (1 500 μL par 24 puits), puis faire tourner dans une centrifugeuse à 250 × g pendant 5 min à température ambiante.
      REMARQUE : La recette des milieux de culture cellulaire EPR est détaillée dans le tableau 1 et disponible dans les références9, 15, 16, 17 et 18 publiées précédemment.
    3. Réintroduisez des cellules dans des milieux de culture cellulaire EPR avec 15 % de sérum de veau fœtal (FBS) et comptez les cellules à l’aide d’un hémocytomètre.
    4. Amorcez 74 000 cellules pour chaque puits d’une plaque de 96 puits (généralement 225-300 × 105 cellules/cm2), après revêtement avec des substrats de revêtement de matrice extracellulaire hautement spécialisés (tableau des matériaux) en suivant les instructions du fabricant.
      REMARQUE : Les cellules d’amorçage se trouvent uniquement sur une plaque compatible avec Resipher (tableau des matériaux) et uniquement dans des puits correspondant au réseau de sondes sur le couvercle de détection (colonnes 3, 4, 9 et 10 pour le couvercle à 32 canaux ; voir tableau des matériaux). Le couvercle de détection du système est disponible avec des capteurs à 4, 32 ou 96 canaux (voir l’emplacement des capteurs dans la Figure 1A-D), et une gamme de plaques de culture cellulaire standard est compatible.
    5. Étant donné que les puits de bordure sont sujets à l’évaporation, ce qui affecte considérablement la disponibilité de l’oxygène, et par conséquent, les lectures OCR, évitez d’ensemencer des cellules sur tous les puits de bordure (rangées A et H d’une plaque de 96 puits). De plus, ajoutez 200 μL d’eau stérile dans chacun des puits vides de la plaque à 96 puits pour réduire les effets d’évaporation.
    6. Gardez la plaque sur une surface de table stable pendant 10 minutes pour permettre aux cellules de se déposer ; puis retournez-le dans l’incubateur. Changer le milieu après 24 à 72 h, en le remplaçant par un milieu de culture EPR standard avec 5 % de FBS. Culture pendant au moins 4 semaines, en changeant de support 2 fois par semaine.
      REMARQUE : Les cellules sont prêtes pour l’expérimentation lorsqu’elles sont pigmentées, pavées et très compactes (Figure 1E).
  2. Configuration et acquisition de données avec le système
    1. Placez le couvercle de détection sur une plaque réceptrice vide de 96 puits, puis remettez-la dans l’incubateur de culture cellulaire. Alignez et montez l’appareil sur le couvercle de détection et connectez-le au Hub via le câble USB fourni. Cela crée un « sandwich » Resipher (Figure 2A).
    2. Accédez à l’application du site Web Lucid lab (https://lab.lucidsci.com/) et cliquez sur le bouton Nouvelle expérience dans le coin supérieur droit pour créer une nouvelle expérience.
    3. Nommez le titre de l’expérience et entrez toutes les notes expérimentales pertinentes pour l’étude particulière (par exemple, le numéro de passage de l’iPSC-RPE que l’on utilise).
    4. Créez des conditions de santé et des groupes de traitement. Par exemple, si vous testez les effets de différentes concentrations sériques dans le milieu sur l’OCR, sélectionnez Sérum dans le nom du groupe, puis entrez les concentrations sériques du milieu à utiliser, en ajoutant d’autres valeurs de pourcentage sérique en cliquant sur le bouton + . Attribuez les puits qui recevront un pourcentage sérique particulier et sélectionnez un motif de couleur pour ces puits. Ajoutez d’autres groupes (par exemple, une variable expérimentale différente à tester) si nécessaire en cliquant sur le bouton Ajouter un groupe .
    5. Définissez la configuration de la plaque et sélectionnez le périphérique et le style de plaque correspondants. Cliquez sur le bouton Ajouter une plaque et choisissez Appareil ; Sélectionnez le type de plaque. Sélectionnez le traitement et cliquez sur le puits correspondant.
    6. Cliquez sur le bouton Démarrer maintenant pour démarrer l’expérience. Vérifiez que le voyant sur le site Web et la LED sur le Hub sont verts fixes.
    7. Laissez le système fonctionner pendant 15 à 60 minutes pour vous assurer que chaque capteur est correctement calibré et détecte avec précision l’oxygène atmosphérique, qui doit être à une concentration de ~200 μM dans un incubateur de culture cellulaire entièrement humidifié avec 5 % de CO2 (Figure 2Bi).
      REMARQUE : Si l’un des capteurs présente une réduction de plus de 20 % par rapport à la moyenne des autres capteurs d’une configuration d’incubateur de culture cellulaire standard, envisagez d’exclure ce puits de l’analyse des données, car le capteur est défectueux (Figure 2Bii).
      REMARQUE : Si tous les capteurs sont à plus de 20 % de la moyenne des autres capteurs et de l’O2 atmosphérique attendu signalé comme étant de 200 μM dans une configuration d’incubateur de culture cellulaire standard, le couvercle de détection a été utilisé trop de fois ; le remplacer par un nouveau couvercle de détection (Figure 2Biii).
      REMARQUE : L’obtention des lectures d’O2 dans l’air avant de commencer une expérience améliore considérablement le dépannage par la suite. Si un puits particulier apparaît comme une valeur aberrante après qu’une expérience a été réalisée et que ce puits avait un capteur qui n’était pas étalonné, le problème peut provenir du capteur, et non de la réplique biologique.
    8. Retirez l’appareil du couvercle de détection (mais ne débranchez pas le câble USB de l’appareil). Placez l’appareil à l’envers dans l’incubateur pour permettre au moteur de l’appareil de se réinitialiser. Ne réutilisez pas l’appareil tant que tous les sons du moteur n’ont pas cessé (environ 20-30 s).
      REMARQUE : Il est important de garder l’appareil connecté au Hub via le câble USB à tout moment pendant une expérience, même lorsque l’appareil n’est pas sur le couvercle de détection. Cela permet à l’appareil de surveiller et de générer des rapports en permanence sur l’environnement de l’incubateur de culture cellulaire.
    9. Replacez la plaque avec le couvercle de détection dans le capot de culture cellulaire, avec une plaque à 96 puits contenant les cultures RPE. Modifiez le milieu de la plaque avec des cultures EPR avec le même milieu et le même volume pour tous les puits afin d’obtenir des valeurs OCR de référence pour chaque puits. Assurez-vous de remplir tous les puits sans EPR avec de l’eau stérile pour aider à prévenir l’évaporation.
      REMARQUE : En général, nous recommandons 60 à 100 μL de milieux de culture EPR par 96 puits, d’après les données démontrant que des volumes de milieux plus faibles entraînent un épuisement rapide des nutriments, mais que des volumes de milieux plus élevés entraînent une hypoxie involontaire9.
    10. Transférez le couvercle de détection sur la plaque contenant les cultures cellulaires et le couvercle standard (non Resipher) sur la plaque contenant les cultures cellulaires sur la plaque réceptrice vide à 96 puits pour maintenir la stérilité du couvercle standard, ce qui sera nécessaire à divers moments de l’expérience.
    11. Remettez la plaque contenant les cultures cellulaires et le couvercle de détection dans l’incubateur de culture cellulaire. Une fois de plus, alignez et montez l’appareil sur le couvercle de détection et connectez-le au Hub via le câble USB fourni (en assemblant le « sandwich »). Vérifiez que les indicateurs de l’interface du site Web et du Hub sont tous verts fixes.
      REMARQUE : Les données de concentration d’O2 s’afficheront immédiatement, tandis que les données OCR n’apparaîtront qu’après la collecte de suffisamment de données d’O2 , soit environ 1 h.
    12. Laissez l’appareil mesurer l’OCR sur chaque puits pendant au moins 12 à 24 h pour capturer un OCR de base.
      REMARQUE : L’OCR de base diffère en fonction de nombreux facteurs, notamment du type de support appliqué aux cellules. Dans la figure 2C, les milieux de culture RPE standard avec différentes quantités de FBS (0 %, 5 %, 15 %) ont des valeurs OCR légèrement différentes. De plus, les cultures avec plus de FBS peuvent maintenir l’activité mitochondriale plus longtemps après l’application du milieu sur les cellules avant que l’OCR ne chute en raison de l’épuisement des métabolites mitochondriaux (côté droit de la courbe).
    13. Une fois qu’une OCR de base est obtenue, répétez les étapes 1.2.8 à 1.2.12, mais changez le milieu sur la plaque avec des cultures EPR dans les conditions expérimentales (généralement, ± un médicament ou une comparaison de différentes conditions de milieu).
      REMARQUE : Les modifications de support de routine peuvent également être gérées de la même manière. À chaque fois que l’incubateur de culture cellulaire est ouvert, attendez-vous à une perturbation importante des lectures OCR, car elles dépendent de la température, de l’humidité, des concentrations de CO2 et d’autres facteurs qui sont tous temporairement perturbés par l’ouverture de la porte de l’incubateur. Lors du retrait de l’appareil du couvercle de détection, il n’est pas nécessaire de mettre l’expérience en pause en ligne. Une fois que la porte de l’incubateur de culture cellulaire est ouverte ou que le milieu a été changé sur la plaque sondée, il faut généralement 2 à 4 heures pour rétablir le gradient d’oxygène et commencer à mesurer un OCR précis.
    14. Une fois les données obtenues, soustrayez l’OCR de base pour chaque puits de l’OCR après l’application de la condition expérimentale, afin de déterminer l’OCR Delta déclenché par le traitement.
    15. Une fois l’expérience terminée, stérilisez et réutilisez le couvercle de détection (qui peut être réutilisé 3 à 5 fois, bien que les performances se dégradent avec une utilisation répétée). Pour stériliser le couvercle de détection, plongez l’ensemble du couvercle dans de l’éthanol à 70 % pendant 10 minutes dans une hotte de culture cellulaire, puis retirez-le de l’immersion et laissez-le reposer dans l’armoire, côté sonde vers le haut (évitez de toucher les pointes délicates de la sonde), et laissez l’éthanol et l’eau s’évaporer totalement avant de placer le couvercle de détection sur une nouvelle plaque réceptrice à 96 puits.
  3. Prenez des images en fond clair pour normaliser les valeurs OCR en fonction du numéro de cellule.
    REMARQUE : L’accumulation de mélanine dans l’EPR facilite la normalisation de l’OCR sur la base d’un simple comptage du nombre de cellules dans des cultures vivantes à l’aide d’un microscope à fond clair.
    1. Retirez l’appareil et placez-le à l’envers, comme à l’étape 1.2.8. Dans le capot de culture cellulaire, remplacez le couvercle de détection sur la plaque de culture RPE par un couvercle standard à 96 puits.
    2. À l’aide d’un microscope inversé standard, prenez des images en fond clair de chaque puits.
      REMARQUE : Gardez la zone d’une image cohérente entre les puits (emplacement relatif dans le puits et grossissement objectif).
    3. Dans la hotte de culture cellulaire, remplacez le couvercle standard à 96 puits de la plaque de culture EPR par le couvercle de détection et remettez-le dans l’incubateur pour une surveillance plus approfondie.
    4. Comptez le numéro de cellule dans chaque puits à l’aide d’ImageJ ou d’un autre logiciel.
    5. Normalisez l’OCR en fonction du nombre de cellules dans les différents groupes expérimentaux. Le système signale l’OCR en unités de fmol∙(mm2)-1∙s-1-la consommation par unité de section transversale. Par conséquent, pour normaliser l’OCR par cellule, divisez l’OCR par le nombre de cellules par mm2 (plutôt que par le nombre de cellules par puits). De manière équivalente, multipliez l’OCR rapporté par le système par la section transversale du puits (environ 31 mm2 pour une plaque standard de 96 puits) pour obtenir l’OCR en unités de fmol∙s-1∙well-1.
  4. Contrôles pour la détermination des paramètres bioénergétiques de l’EPR.
    REMARQUE : Pour s’assurer que le système et les cultures d’EPR réagissent aux manipulations mitochondriales de manière prévisible, on peut tester certaines petites molécules bien établies pour cibler des étapes particulières de la phosphorylation oxydative mitochondriale. Ces tests sont analogues aux étapes effectuées dans un test de stress mitochondrial à l’aide de l’analyseur Seahorse10 et fournissent un profil bioénergétique pour les cultures d’EPR.
    1. Cultivez des cellules EPR dans 65 μL de milieux de culture EPR standard avec 5 % de FBS et mesurez l’OCR pendant 24 h pour établir une base de référence.
    2. Aspirer le milieu de culture et ajouter 65 μL de milieu de culture EPR standard avec 5 % de FBS et avec des découpleurs mitochondriaux (3 μM de cyanure de carbonyle-p-trifluorométhoxyphénylhydrazone [FCCP] ou 500 nM de Bam15, tableau des matériaux). Incuber toute la nuit.
      REMARQUE : Les découpleurs mitochondriaux devraient augmenter considérablement l’OCR. S’assurer que l’OCR augmenté n’est pas égal ou proche de l’OCR maximal théorique limité à la diffusion d’environ 275 fmol∙(mm2)-1∙s-1 pour 65 μL de milieu dans des conditions de culture standard. L’OCR maximal pour les différents volumes de médias couramment utilisés est disponible dans la section Discussion.
    3. Après une nuit d’incubation, aspirer le milieu à l’aide de découpleurs mitochondriaux et le remplacer par 65 μL de milieu de culture EPR standard à 5 % de FBS. Observez la plaque pendant encore 24 heures pour déterminer la récupération de l’OCR de l’EPR après l’élimination des médicaments.
    4. Calculez les effets des découpleurs sur l’OCR en soustrayant l’OCR obtenu après traitement de l’OCR obtenu avant traitement (Figure 3).
      REMARQUE : L’augmentation de l’OCR avec l’ajout de découpleurs mitochondriaux signifie la capacité respiratoire mitochondriale de réserve de la cellule19.
    5. Pour mesurer d’autres paramètres mitochondriaux généralement capturés lors du test de stress mitochondrial avec un analyseur Seahorse, effectuez les mêmes étapes ci-dessus avec les composés suivants (Figure 4).
      1. Utilisez l’oligomycine à 1 μM pour évaluer la respiration liée à l’ATP.
      2. Utilisez de l’antimycine A et de la roténone à 1 μM pour évaluer toute respiration non mitochondriale.
        REMARQUE : Le FCCP, l’oligomycine, l’antimycine A et la roténone peuvent être toxiques pour l’EPR. S’ils induisent une mort cellulaire importante, les mesures OCR ne seront pas précises. Ainsi, les mesures OCR ne doivent être obtenues qu’à un moment où il n’y a pas de mort cellulaire évidente, généralement dans les premières heures suivant l’ajout des médicaments (Figure 4).

2. Mesurer les changements dans le métabolisme mitochondrial dans l’EPR subissant une EMT

  1. Suivez le même protocole que celui décrit à la section 1.2.
  2. Pour induire l’EMT après l’obtention des mesures OCR de base, ajoutez du TGF-β2 (10 ng/mL) aux cultures d’EPR et surveillez l’OCR pendant 3 semaines. Rafraîchissez le support avec du TGFβ2 frais tous les 2 à 3 jours (Figure 5).
  3. Au moins 2 fois par semaine, obtenez des images en fond clair comme indiqué à la section 1.3 pour vous assurer que le nombre de cellules ne change pas. Si le nombre change, normalisez les valeurs OCR en fonction du numéro de cellule dans chaque puits.
    REMARQUE : Le même protocole peut être utilisé pour d’autres inducteurs de l’EMT afin de surveiller les changements à long terme de l’OCR tout au long de la période de culture pendant que les cellules sont dans l’incubateur.

3. Mesurer les changements dans le métabolisme mitochondrial dans l’EPR hypoxique

REMARQUE : L’application du système dans des conditions hypoxiques, normoxiques ou hyperoxiques est la même que celle de la section 1.2, à l’exception du maintien du « sandwich » dans une chambre d’hypoxie (table des matériaux) placée dans un incubateur de culture cellulaire standard.

  1. Percez un trou sur le couvercle de la chambre d’hypoxie pour y monter le câble USB de type c et scellez-le avec du silicone ou du mastic (Figure 6A).
  2. Assemblez le couvercle de détection avec la plaque de culture cellulaire dans le capot et transférez-les dans la chambre d’hypoxie.
  3. Installez le « sandwich » (assiette, couvercle de détection, appareil) dans la chambre d’hypoxie. Placez également dans la chambre d’hypoxie une boîte de Pétri avec de l’eau stérile pour aider à maintenir l’humidité. Enfin, placez un capteur portable O2 dans la chambre d’hypoxie (Table des matériaux). La configuration est illustrée à la Figure 6A.
  4. Scellez la chambre et connectez-la à une bouteille de gaz avec une concentration hypoxique de O2 et une concentration standard de culture cellulaire de CO2 (par exemple, 1 % d’O2 et 5 % de CO2).
  5. Échangez lentement l’air dans la chambre d’hypoxie avec l’air 1 % O2/5 % CO2 dans la bouteille jusqu’à ce que le capteur d’oxygène indique la concentration d’O2 souhaitée, généralement entre 1 % et 10 %.
    REMARQUE : Le capteur portable O2 nécessite du temps pour s’équilibrer, donc le gaz de la bouteille doit être ajouté lentement dans la chambre d’hypoxie.
  6. Fermez les vannes d’entrée et de sortie de la chambre d’hypoxie et transférez toute la chambre dans l’incubateur.
  7. Configurez et démarrez l’expérience comme indiqué à la section 1.2.
    REMARQUE : Le prééquilibrage du milieu dans la chambre d’hypoxie avant l’ajout aux cellules peut réduire le temps nécessaire à la monocouche cellulaire pour subir une véritable hypoxie (Figure 6B).

4. Calcul de la concentration d’O2 au niveau de la monocouche d’EPR pour déterminer si les cellules sont dans des conditions hypoxiques, normoxiques ou hyperoxiques

REMARQUE : Par défaut, le système mesure la concentration d’O2 entre environ 1 et 1,5 mm au-dessus du fond du puits, en supposant qu’une plaque standard est utilisée avec le couvercle de détection recommandé pour la culture monocouche (voir https://lucidsci.com/docs/LucidScientific_Sensing_Lid_Selection_Guide.pdf). Bien que la concentration d’O2 au niveau de la monocouche cellulaire ne soit pas mesurée directement, les données du système peuvent être utilisées pour estimer la concentration d’O2 au niveau de l’EPR. Plus précisément, sachant qu’il existe un gradient d’oxygène entre le haut de la colonne de support, où l’O2 est disponible, et le bas de la colonne du milieu, où l’O2 est consommé, les lois de la diffusion de Fick peuvent être combinées avec le taux d’OCR mesuré pour extrapoler les niveaux d’O2 au niveau de la monocouche cellulaire. Un calculateur pour cette estimation est fourni en ligne : https://lucidsci.com/notes?entry=oxygen_diffusion (et sous la forme d’un cahier interactif open-source à l’https://observablehq.com/@lucid/oxygen-diffusion-and-flux-in-cell-culture, le code source de ce calculateur peut être trouvé à https://github.com/lucidsci/oxygen-diffusion-calculator).

  1. Une fois que vous avez accédé à la calculatrice, entrez le volume de support en microlitres (par exemple, 100 μL).
  2. Entrez la concentration d’oxygène saturé à l’interface air-liquide (le haut de la colonne de média au-dessus des cellules). Cette valeur est de ~185 μM à pression atmosphérique standard avec 5% O2 et 95% d’humidité.
    REMARQUE : Cela peut également être déterminé à partir de mesures O2 par des sondes système dans des puits de fluide uniquement (sans cellules au fond du puits).
  3. Dans l’entrée Flux, entrez le Flux/OCR signalé par le système.
  4. Sur la base de ces valeurs, la concentration d’oxygène à l’état d’équilibre à chaque hauteur de la colonne de milieu est calculée et indiquée dans le graphique (figure 7). L’axe des x de la parcelle est la hauteur en mm au-dessus du fond du puits. L’axe des y est la concentration calculée en O2 à cette hauteur (en μM).
  5. La concentration en O2 au fond du puits (où se trouvent les cellules) est indiquée sur la ligne située sous le graphique.
    REMARQUE : En général, on estime que l’EPR in vivo présente une concentration d’O2 de 4 à 9 %. Chaque 10 μM d’O2 dans des conditions atmosphériques normales correspond à environ 1 % d’O2. Ainsi, la normoxie au niveau des cellules est d’environ 40-90 μM de O2. Plus la colonne de support est élevée, plus le O2 sera bas au niveau de la monocouche RPE9. Ainsi, si les cellules semblent être dans des conditions hypoxiques, le volume du milieu peut être réduit. Si les cellules semblent être dans des conditions hyperoxiques, le volume du milieu peut être augmenté.

Résultats

La configuration « sandwich » de l’expérience Resipher est illustrée à la figure 2A. Les couvercles de détection avec 32 sondes correspondant aux colonnes 3, 4, 9 et 10 sur la plaque à 96 puits se trouvent entre la plaque de la cellule et le dispositif. Après s’être connecté au Hub, l’appareil active des moteurs pour déplacer le couvercle de détection vers le haut et vers le bas, en mesurant la concentration de O2 dans la colonne de support à une plage de hauteu...

Discussion

Le métabolisme mitochondrial de l’EPR joue un rôle essentiel dans la pathogenèse des maladies rétiniennes cécitantes courantes, notamment la DMLA et la PVR. La modélisation in vitro du métabolisme mitochondrial de l’EPR permet d’isoler son état métabolique de ceux des tissus environnants, tout en soumettant le tissu à différentes agressions simulant la maladie de manière contrôlée. Une telle modélisation in vitro du métabolisme mitochondrial de l’EPR a été facilitée par l’av...

Déclarations de divulgation

Richard A. Bryan et Kin Lo sont des employés de Lucid Scientific, qui fabrique le système Resiper.

Remerciements

Nous remercions les Drs Daniel Hass et Jim Hurley d’avoir eu l’idée de tester la solubilité de l’O2 dans des milieux nouveaux par rapport à des milieux conditionnés à titre de contrôle. Nous remercions la Dre Magali Saint-Geniez pour sa contribution rédactionnelle au manuscrit. Nous remercions Scott Szalay de l’Instrument and Electronic Services Core, Kellogg Eye Center, pour avoir équipé la chambre d’hypoxie du câble USB Resiopher. Aucun financement fédéral n’a été utilisé pour la recherche sur le HFT. Le noyau de services électroniques est soutenu par le P30 EY007003 du National Eye Institute. Ce travail est soutenu par une subvention départementale sans restriction de la Recherche pour prévenir la cécité (RPB). J.M.L.M. est soutenu par l’Initiative James Grosfeld pour la dégénérescence maculaire liée à l’âge sec, la Fondation E. Matilda Ziegler pour les aveugles, une subvention de la banque d’yeux Eversight, une subvention K08EY033420 du National Eye Institute et le soutien de Dee et Dickson Brown ainsi que de la Fondation David et Lisa Drews Discovering Hope. D.Y.S. est soutenu par le programme Scientia de l’UNSW. L.A.K. est soutenu par le prix Iraty, Monte J. Wallace, Michel Plantevin, une subvention R01EY027739 du National Eye Institute et l’activité d’acquisition de la recherche médicale de l’armée du ministère de la Défense VR220059.

matériels

NameCompanyCatalog NumberComments
0.25% Trypsin-EDTAGibco#25-200-056
3,3',5-triiodo-L-thyronine sodium saltSigmaT5516
32-channel Resipher lidLucid ScientificNS32-101A for Falcon
Antimycin A from streptomyces sp.SigmaA8674-25MGInhibitor of Complex III of the electron transport chain
BAM15SigmaSML1760-5MGUncoupling agent to increase mitochondrial respiration
DMSO, cell culture gradeSigma-aldrichD4540-100MLVehicle for reconstituting mitochondrial drugs
Extracellular matrix coating substrates:
Synthemax II-SC		Corning#3535Extracellular matrix for hfRPE
Extracellular matrix coating substrates: VitronectinGibcoA14700Extracellular matrix for iPSC-RPE
FCCPSigmaC2920-10MGUncoupling agent to increase mitochondrial respiration
Fetal Bovine Serum (Bio-Techne S11550H)Bio-TechneS11550H
Hydrocortisone-CyclodextrinSigmaH0396
Hypoxia chamberEmbrient Inc.MIC-101
N1 Media SupplementSigmaN6530
Non-Essential Amino Acids SolutionGibco11140050
O2 sensorSensit technology or Forensics DetectorsP100 or FD-90A-O2
Penicillin-StreptomycinGibco15140-122
Recombinant human TGFβ2Peprotech100-35BTransforming growth factor beta-2 to induce epithelial-mesenchymal transition
RotenoneSigmaR8875-1GInhibitor of Complex I of the electron transport chain
System-compatible plateCorning#353072
TaurineSigmaT8691
αMEM (Alpha Modification of Eagle's Media)Corning15-012-CV

Références

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