Suivi à long terme des taux de consommation d’oxygène dans des cultures épithéliales pigmentaires rétiniennes hautement différenciées et polarisées

Résumé

Nous présentons un nouvel appareil pour mesurer les taux de consommation d’oxygène (OCR) dans les cultures d’épithélium pigmentaire rétinien (EPR). L’appareil peut mesurer l’OCR pendant des semaines sur des EPR cultivés sur des plaques de culture cellulaire standard avec des milieux standard pendant que les plaques sont dans un incubateur de culture cellulaire standard.

Résumé

Le métabolisme mitochondrial est essentiel au fonctionnement normal de l’épithélium pigmentaire rétinien (EPR), une monocouche de cellules de la rétine importante pour la survie des photorécepteurs. Le dysfonctionnement mitochondrial de l’EPR est une caractéristique de la dégénérescence maculaire liée à l’âge (DMLA), la principale cause de cécité irréversible dans les pays développés, et de la vitréorétinopathie proliférative (PVR), une complication cécitante des décollements de rétine. Les conditions dégénératives de l’EPR ont été bien modélisées par des systèmes de culture d’EPR qui sont hautement différenciés et polarisés pour imiter l’EPR in vivo . Cependant, la surveillance des taux de consommation d’oxygène (OCR), un indicateur de la fonction mitochondriale, a été difficile dans de tels systèmes de culture, car les conditions qui favorisent la polarisation et la différenciation idéales de l’EPR ne permettent pas de mesurer facilement l’OCR.

Ici, nous présentons un nouveau système, Resipher, pour surveiller l’OCR pendant des semaines à la fois dans des cultures d’EPR bien différenciées tout en maintenant l’EPR sur des substrats de croissance optimaux et des milieux de culture physiologiques dans un incubateur de culture cellulaire standard. Ce système calcule l’OCR en mesurant le gradient de concentration en oxygène présent dans les milieux au-dessus des cellules. Nous discutons des avantages de ce système par rapport aux autres méthodes de détection de l’OCR et de la manière de mettre en place le système de mesure de l’OCR dans les cultures d’EPR. Nous abordons les principaux conseils et astuces pour l’utilisation du système, la prudence dans l’interprétation des données et les instructions pour résoudre les problèmes de résultats inattendus.

Nous fournissons également un calculateur en ligne pour extrapoler le niveau d’hypoxie, de normoxie ou d’hyperoxie ressenti par les cultures d’EPR en fonction du gradient d’oxygène dans le milieu au-dessus des cellules détectées par le système. Enfin, nous passons en revue deux applications du système, en mesurant l’état métabolique des cellules EPR dans un modèle PVR et en comprenant comment l’EPR s’adapte métaboliquement à l’hypoxie. Nous prévoyons que l’utilisation de ce système sur des cultures d’EPR hautement polarisées et différenciées améliorera notre compréhension du métabolisme mitochondrial de l’EPR à la fois dans des états physiologiques et pathologiques.

Introduction

L’épithélium pigmentaire rétinien (EPR) est une monocouche de cellules épithéliales fonctionnellement postmitotiques et hautement polarisées qui forment une barrière entre les photorécepteurs sensibles à la lumière de la rétine et leur circulation sanguine, un lit capillaire appelé choriocapillaire. Comme le rôle des neurones de soutien de la glie, l’EPR remplit une myriade de fonctions pour soutenir les photorécepteurs, y compris la phagocytose des segments externes des photorécepteurs, le transport des nutriments et le soutien métabolique des photorécepteurs, et la sécrétion de facteurs de croissance essentiels, tous essentiels au maintien de la fonction visuelle.

Protocole

Pour les protocoles permettant d’établir des cultures primaires humaines ou iPSC-RPE, voir les références suivantes 15,16,17,18. L’acquisition et l’utilisation de tissus humains pour ces protocoles ont été examinées et autorisées par le Conseil d’examen institutionnel de l’Université du Michigan (HUM00105486).

1. Application générale du système à la culture de l’EPR

1. Plaque de cellules souches pluripotentes induites humaines (iPSC) dérivées de l’EPR ou cellules EPR humaines primaires dans....

Discussion

Le métabolisme mitochondrial de l’EPR joue un rôle essentiel dans la pathogenèse des maladies rétiniennes cécitantes courantes, notamment la DMLA et la PVR. La modélisation in vitro du métabolisme mitochondrial de l’EPR permet d’isoler son état métabolique de ceux des tissus environnants, tout en soumettant le tissu à différentes agressions simulant la maladie de manière contrôlée. Une telle modélisation in vitro du métabolisme mitochondrial de l’EPR a été facilitée par l’av.......

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.25% Trypsin-EDTA	Gibco	#25-200-056
3,3',5-triiodo-L-thyronine sodium salt	Sigma	T5516
32-channel Resipher lid	Lucid Scientific	NS32-101A for Falcon
Antimycin A from streptomyces sp.	Sigma	A8674-25MG	Inhibitor of Complex III of the electron transport chain
BAM15	Sigma	SML1760-5MG	Uncoupling agent to increase mitochondrial respiration
DMSO, cell culture grade	Sigma-aldrich	D4540-100ML	Vehicle for reconstituting mitochondrial drugs
Extracellular matrix coating substrates: Synthemax II-SC	Corning	#3535	Extracellular matrix for hfRPE
Extracellular matrix coating substrates: Vitronectin	Gibco	A14700	Extracellular matrix for iPSC-RPE
FCCP	Sigma	C2920-10MG	Uncoupling agent to increase mitochondrial respiration
Fetal Bovine Serum (Bio-Techne S11550H)	Bio-Techne	S11550H
Hydrocortisone-Cyclodextrin	Sigma	H0396
Hypoxia chamber	Embrient Inc.	MIC-101
N1 Media Supplement	Sigma	N6530
Non-Essential Amino Acids Solution	Gibco	11140050
O2 sensor	Sensit technology or Forensics Detectors	P100 or FD-90A-O2
Penicillin-Streptomycin	Gibco	15140-122
Recombinant human TGFβ2	Peprotech	100-35B	Transforming growth factor beta-2 to induce epithelial-mesenchymal transition
Rotenone	Sigma	R8875-1G	Inhibitor of Complex I of the electron transport chain
System-compatible plate	Corning	#353072
Taurine	Sigma	T8691
αMEM (Alpha Modification of Eagle's Media)	Corning	15-012-CV