Monitorización a largo plazo de las tasas de consumo de oxígeno en cultivos epiteliales de pigmento retiniano altamente diferenciados y polarizados

Resumen

Presentamos un novedoso dispositivo para medir las tasas de consumo de oxígeno (OCR) en cultivos epiteliales de pigmento de retina (EPR). El dispositivo puede medir el OCR durante semanas seguidas en RPE cultivado en placas de cultivo celular estándar con medios estándar mientras las placas están en una incubadora de cultivo celular estándar.

Resumen

El metabolismo mitocondrial es fundamental para el funcionamiento normal del epitelio pigmentario de la retina (EPR), una monocapa de células de la retina importante para la supervivencia de los fotorreceptores. La disfunción mitocondrial del EPR es una característica distintiva de la degeneración macular asociada a la edad (DMAE), la principal causa de ceguera irreversible en el mundo desarrollado, y de la vitreorretinopatía proliferativa (RVP), una complicación cegadora de los desprendimientos de retina. Las condiciones degenerativas del EPR han sido bien modeladas por sistemas de cultivo de EPR que están altamente diferenciados y polarizados para imitar el EPR in vivo . Sin embargo, el monitoreo de las tasas de consumo de oxígeno (OCR), un indicador de la función mitocondrial, ha sido difícil en dichos sistemas de cultivo porque las condiciones que promueven la polarización y diferenciación ideal del RPE no permiten mediciones fáciles de OCR.

Aquí, presentamos un sistema novedoso, Resipher, para monitorear OCR durante semanas a la vez en cultivos de EPR bien diferenciados mientras se mantiene el EPR en sustratos de crecimiento óptimos y medios de cultivo fisiológicos en una incubadora de cultivo celular estándar. Este sistema calcula el OCR midiendo el gradiente de concentración de oxígeno presente en los medios por encima de las células. Discutimos las ventajas de este sistema sobre otros métodos para detectar OCR y cómo configurar el sistema para medir OCR en cultivos de RPE. Cubrimos consejos y trucos clave para usar el sistema, precaución sobre la interpretación de los datos y pautas para solucionar problemas de resultados inesperados.

También proporcionamos una calculadora en línea para extrapolar el nivel de hipoxia, normoxia o hiperoxia que experimentan los cultivos de RPE en función del gradiente de oxígeno en los medios por encima de las células detectadas por el sistema. Finalmente, revisamos dos aplicaciones del sistema, midiendo el estado metabólico de las células EPR en un modelo de PVR y entendiendo cómo el EPR se adapta metabólicamente a la hipoxia. Anticipamos que el uso de este sistema en cultivos de EPR altamente polarizados y diferenciados mejorará nuestra comprensión del metabolismo mitocondrial del EPR, tanto en estados fisiológicos como de enfermedad.

Introducción

El epitelio pigmentario de la retina (EPR) es una monocapa de células epiteliales funcionalmente postmitóticas altamente polarizadas que forman una barrera entre los fotorreceptores sensibles a la luz en la retina y su circulación sanguínea, un lecho capilar denominado coriocapilar. Al igual que el papel de las neuronas de soporte de la glía, el EPR lleva a cabo innumerables funciones para apoyar a los fotorreceptores, incluida la fagocitosis de los segmentos externos de los fotorreceptores, el transporte de nutrientes y el apoyo metabólico de los fotorreceptores, y la secreción de factores de crecimiento esenciales, todos críticos para mantener la función visual.

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Protocolo

Para conocer los protocolos para establecer cultivos primarios humanos o iPSC-RPE, consulte las siguientes referencias 15,16,17,18. La adquisición y el uso de tejido humano para estos protocolos fueron revisados y autorizados por la Junta de Revisión Institucional (HUM00105486) de la Universidad de Michigan.

1. Aplicación general del sistema a la cultura RPE

1. Placa de células madre pluripotentes inducidas humanas (iPSC) derivadas de RPE o células RPE humanas primarias en placas de 96 poci....

Discusión

El metabolismo mitocondrial del EPR desempeña un papel fundamental en la patogénesis de las enfermedades comunes de la retina que causan ceguera, como la DMAE y la RVP. El modelado del metabolismo mitocondrial del EPR in vitro permite aislar su estado metabólico del de los tejidos circundantes, además de someter al tejido a diferentes agresiones que simulan la enfermedad de forma controlada. Este modelado in vitro del metabolismo mitocondrial del EPR se ha visto facilitado por el advenimiento de cul.......

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.25% Trypsin-EDTA	Gibco	#25-200-056
3,3',5-triiodo-L-thyronine sodium salt	Sigma	T5516
32-channel Resipher lid	Lucid Scientific	NS32-101A for Falcon
Antimycin A from streptomyces sp.	Sigma	A8674-25MG	Inhibitor of Complex III of the electron transport chain
BAM15	Sigma	SML1760-5MG	Uncoupling agent to increase mitochondrial respiration
DMSO, cell culture grade	Sigma-aldrich	D4540-100ML	Vehicle for reconstituting mitochondrial drugs
Extracellular matrix coating substrates: Synthemax II-SC	Corning	#3535	Extracellular matrix for hfRPE
Extracellular matrix coating substrates: Vitronectin	Gibco	A14700	Extracellular matrix for iPSC-RPE
FCCP	Sigma	C2920-10MG	Uncoupling agent to increase mitochondrial respiration
Fetal Bovine Serum (Bio-Techne S11550H)	Bio-Techne	S11550H
Hydrocortisone-Cyclodextrin	Sigma	H0396
Hypoxia chamber	Embrient Inc.	MIC-101
N1 Media Supplement	Sigma	N6530
Non-Essential Amino Acids Solution	Gibco	11140050
O2 sensor	Sensit technology or Forensics Detectors	P100 or FD-90A-O2
Penicillin-Streptomycin	Gibco	15140-122
Recombinant human TGFβ2	Peprotech	100-35B	Transforming growth factor beta-2 to induce epithelial-mesenchymal transition
Rotenone	Sigma	R8875-1G	Inhibitor of Complex I of the electron transport chain
System-compatible plate	Corning	#353072
Taurine	Sigma	T8691
αMEM (Alpha Modification of Eagle's Media)	Corning	15-012-CV