Langzeitüberwachung des Sauerstoffverbrauchs in hochdifferenzierten und polarisierten retinalen Pigmentepithelkulturen

Zusammenfassung

Wir stellen ein neuartiges Gerät zur Messung des Sauerstoffverbrauchs (OCR) in retinalen Pigmentepithelkulturen (RPE) vor. Das Gerät kann die OCR wochenlang an RPE messen, das auf Standard-Zellkulturplatten mit Standardmedien gezüchtet wurde, während sich die Platten in einem Standard-Zellkulturinkubator befinden.

Zusammenfassung

Der mitochondriale Stoffwechsel ist entscheidend für die normale Funktion des retinalen Pigmentepithels (RPE), einer Monoschicht von Zellen in der Netzhaut, die für das Überleben der Photorezeptoren wichtig ist. Die mitochondriale Dysfunktion von RPE ist ein Kennzeichen der altersbedingten Makuladegeneration (AMD), der Hauptursache für irreversible Erblindung in den Industrieländern, und der proliferativen Vitreoretinopathie (PVR), einer erblindenden Komplikation von Netzhautablösungen. RPE-degenerative Erkrankungen wurden durch RPE-Kultursysteme, die hochdifferenziert und polarisiert sind, um in vivo RPE nachzuahmen, gut modelliert. Die Überwachung der Sauerstoffverbrauchsraten (OCR), eines Indikators für die mitochondriale Funktion, erwies sich in solchen Kultursystemen jedoch als schwierig, da die Bedingungen, die eine ideale RPE-Polarisation und -Differenzierung begünstigen, keine einfachen OCR-Messungen ermöglichen.

Hier stellen wir ein neuartiges System, Resipher, vor, um OCR wochenlang in gut differenzierten RPE-Kulturen zu überwachen, während das RPE auf optimalen Wachstumssubstraten und physiologischen Kulturmedien in einem Standard-Zellkultur-Inkubator gehalten wird. Dieses System berechnet die OCR, indem es den Sauerstoffkonzentrationsgradienten misst, der in den Medien über den Zellen vorhanden ist. Wir diskutieren die Vorteile dieses Systems gegenüber anderen Methoden zur Erkennung von OCR und wie man das System zur Messung von OCR in RPE-Kulturen einrichtet. Wir behandeln wichtige Tipps und Tricks für die Verwendung des Systems, Vorsicht bei der Interpretation der Daten und Richtlinien für die Fehlerbehebung bei unerwarteten Ergebnissen.

Wir bieten auch einen Online-Rechner zur Extrapolation des Hypoxie-, Normoxie- oder Hyperoxie-RPE-Niveaus an, die auf dem Sauerstoffgradienten in den Medien über den vom System erkannten Zellen basieren. Schließlich untersuchen wir zwei Anwendungen des Systems, die Messung des Stoffwechselzustands von RPE-Zellen in einem PVR-Modell und das Verständnis, wie sich das RPE metabolisch an Hypoxie anpasst. Wir gehen davon aus, dass die Verwendung dieses Systems an hochpolarisierten und differenzierten RPE-Kulturen unser Verständnis des mitochondrialen RPE-Stoffwechsels sowohl unter physiologischen als auch unter Krankheitszuständen verbessern wird.

Einleitung

Das retinale Pigmentepithel (RPE) ist eine Monoschicht aus funktionell postmitotischen, hochpolarisierten Epithelzellen, die eine Barriere zwischen lichtempfindlichen Photorezeptoren in der Netzhaut und deren Durchblutung bilden, ein Kapillarbett, das als Choriokapillaris bezeichnet wird. Wie die Rolle der Glia-unterstützenden Neuronen erfüllt das RPE unzählige Funktionen zur Unterstützung von Photorezeptoren, einschließlich der Phagozytose der äußeren Segmente der Photorezeptoren, des Transports von Nährstoffen und der metabolischen Unterstützung der Photorezeptoren sowie der Sekretion essentieller Wachstumsfaktoren, die alle für die Aufrechterhaltung der Sehfunktion....

Protokoll

Für Protokolle zur Etablierung von humanen Primär- oder iPSC-RPE-Kulturen siehe die folgenden Referenzen 15,16,17,18. Die Gewinnung und Verwendung von menschlichem Gewebe für diese Protokolle wurde vom Institutional Review Board (HUM00105486 der University of Michigan geprüft und genehmigt.

1. Allgemeine Anwendung des Systems auf die RPE-Kultur

1. Platte humane induzierte pluripotente Stammzellen (iPSC), abgeleitete RPE-Zellen oder primäre humane RPE-Zellen in systemkompatiblen 96-Well-Plat....

Diskussion

Der mitochondriale Metabolismus des RPE spielt eine entscheidende Rolle bei der Pathogenese häufiger erblindender Netzhauterkrankungen, einschließlich AMD und PVR. Die Modellierung des mitochondrialen RPE-Stoffwechsels in vitro ermöglicht es, seinen Stoffwechselzustand von dem des umgebenden Gewebes zu isolieren und das Gewebe auf kontrollierte Weise verschiedenen krankheitssimulierenden Beleidigungen auszusetzen. Eine solche in vitro-Modellierung des mitochondrialen RPE-Stoffwechsels wurde durch das.......

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.25% Trypsin-EDTA	Gibco	#25-200-056
3,3',5-triiodo-L-thyronine sodium salt	Sigma	T5516
32-channel Resipher lid	Lucid Scientific	NS32-101A for Falcon
Antimycin A from streptomyces sp.	Sigma	A8674-25MG	Inhibitor of Complex III of the electron transport chain
BAM15	Sigma	SML1760-5MG	Uncoupling agent to increase mitochondrial respiration
DMSO, cell culture grade	Sigma-aldrich	D4540-100ML	Vehicle for reconstituting mitochondrial drugs
Extracellular matrix coating substrates: Synthemax II-SC	Corning	#3535	Extracellular matrix for hfRPE
Extracellular matrix coating substrates: Vitronectin	Gibco	A14700	Extracellular matrix for iPSC-RPE
FCCP	Sigma	C2920-10MG	Uncoupling agent to increase mitochondrial respiration
Fetal Bovine Serum (Bio-Techne S11550H)	Bio-Techne	S11550H
Hydrocortisone-Cyclodextrin	Sigma	H0396
Hypoxia chamber	Embrient Inc.	MIC-101
N1 Media Supplement	Sigma	N6530
Non-Essential Amino Acids Solution	Gibco	11140050
O2 sensor	Sensit technology or Forensics Detectors	P100 or FD-90A-O2
Penicillin-Streptomycin	Gibco	15140-122
Recombinant human TGFβ2	Peprotech	100-35B	Transforming growth factor beta-2 to induce epithelial-mesenchymal transition
Rotenone	Sigma	R8875-1G	Inhibitor of Complex I of the electron transport chain
System-compatible plate	Corning	#353072
Taurine	Sigma	T8691
αMEM (Alpha Modification of Eagle's Media)	Corning	15-012-CV