Langzeitüberwachung des Sauerstoffverbrauchs in hochdifferenzierten und polarisierten retinalen Pigmentepithelkulturen

Zusammenfassung

Wir stellen ein neuartiges Gerät zur Messung des Sauerstoffverbrauchs (OCR) in retinalen Pigmentepithelkulturen (RPE) vor. Das Gerät kann die OCR wochenlang an RPE messen, das auf Standard-Zellkulturplatten mit Standardmedien gezüchtet wurde, während sich die Platten in einem Standard-Zellkulturinkubator befinden.

Zusammenfassung

Der mitochondriale Stoffwechsel ist entscheidend für die normale Funktion des retinalen Pigmentepithels (RPE), einer Monoschicht von Zellen in der Netzhaut, die für das Überleben der Photorezeptoren wichtig ist. Die mitochondriale Dysfunktion von RPE ist ein Kennzeichen der altersbedingten Makuladegeneration (AMD), der Hauptursache für irreversible Erblindung in den Industrieländern, und der proliferativen Vitreoretinopathie (PVR), einer erblindenden Komplikation von Netzhautablösungen. RPE-degenerative Erkrankungen wurden durch RPE-Kultursysteme, die hochdifferenziert und polarisiert sind, um in vivo RPE nachzuahmen, gut modelliert. Die Überwachung der Sauerstoffverbrauchsraten (OCR), eines Indikators für die mitochondriale Funktion, erwies sich in solchen Kultursystemen jedoch als schwierig, da die Bedingungen, die eine ideale RPE-Polarisation und -Differenzierung begünstigen, keine einfachen OCR-Messungen ermöglichen.

Hier stellen wir ein neuartiges System, Resipher, vor, um OCR wochenlang in gut differenzierten RPE-Kulturen zu überwachen, während das RPE auf optimalen Wachstumssubstraten und physiologischen Kulturmedien in einem Standard-Zellkultur-Inkubator gehalten wird. Dieses System berechnet die OCR, indem es den Sauerstoffkonzentrationsgradienten misst, der in den Medien über den Zellen vorhanden ist. Wir diskutieren die Vorteile dieses Systems gegenüber anderen Methoden zur Erkennung von OCR und wie man das System zur Messung von OCR in RPE-Kulturen einrichtet. Wir behandeln wichtige Tipps und Tricks für die Verwendung des Systems, Vorsicht bei der Interpretation der Daten und Richtlinien für die Fehlerbehebung bei unerwarteten Ergebnissen.

Wir bieten auch einen Online-Rechner zur Extrapolation des Hypoxie-, Normoxie- oder Hyperoxie-RPE-Niveaus an, die auf dem Sauerstoffgradienten in den Medien über den vom System erkannten Zellen basieren. Schließlich untersuchen wir zwei Anwendungen des Systems, die Messung des Stoffwechselzustands von RPE-Zellen in einem PVR-Modell und das Verständnis, wie sich das RPE metabolisch an Hypoxie anpasst. Wir gehen davon aus, dass die Verwendung dieses Systems an hochpolarisierten und differenzierten RPE-Kulturen unser Verständnis des mitochondrialen RPE-Stoffwechsels sowohl unter physiologischen als auch unter Krankheitszuständen verbessern wird.

Einleitung

Das retinale Pigmentepithel (RPE) ist eine Monoschicht aus funktionell postmitotischen, hochpolarisierten Epithelzellen, die eine Barriere zwischen lichtempfindlichen Photorezeptoren in der Netzhaut und deren Durchblutung bilden, ein Kapillarbett, das als Choriokapillaris bezeichnet wird. Wie die Rolle der Glia-unterstützenden Neuronen erfüllt das RPE unzählige Funktionen zur Unterstützung von Photorezeptoren, einschließlich der Phagozytose der äußeren Segmente der Photorezeptoren, des Transports von Nährstoffen und der metabolischen Unterstützung der Photorezeptoren sowie der Sekretion essentieller Wachstumsfaktoren, die alle für die Aufrechterhaltung der Sehfunktion entscheidend sind.

Die Degeneration des RPE liegt mehreren häufigen degenerativen Erkrankungen des Sehvermögens zugrunde. Bei der altersbedingten Makuladegeneration (AMD), einer der häufigsten Ursachen für unheilbaren Sehverlust weltweit, stirbt das RPE ab, und die darüber liegenden Photorezeptoren erleiden daher eine sekundäre Degeneration. Bei der proliferativen Vitreoretinopathie (PVR) verlässt das RPE stattdessen seinen normalerweise ruhenden postmitotischen Zustand, proliferiert sich und dedifferenziert sich in einen mesenchymalen Zustand (einen sogenannten epithelial-mesenchymalen Übergang [EMT]) mit Veränderungen in seinem Stoffwechsel. Die RPE-Dedifferenzierung führt zu einem Verlust der RPE-Unterstützung für Photorezeptoren und löst gleichzeitig einen fibrotischeren Zustand aus. Dies führt sowohl zu einer Degeneration der Photorezeptoren als auch zu einer RPE-induzierten Narbenbildung, die beide einen Sehverlust auslösen ^1,2.

Ein großer Teil der Unterstützung der Photorezeptoren durch RPE ist metabolisch, und metabolische Dysregulation ist ein kritischer Faktor bei zahlreichen Netzhauterkrankungen, einschließlich AMD und PVR. Das RPE dient als regulatorische Barriere zwischen den Photorezeptoren und ihrer Sauerstoff- und Nährstoffquelle, der Choriokapillaris. Daher bestimmt das, was das RPE metabolisiert, im Vergleich zu dem, was das RPE von der Choriokapillaris zu den Photorezeptoren durchdringt, stark den Photorezeptorstoffwechsel und das Überleben. Zahlreiche Studien haben gezeigt, dass das RPE für seine normale Gesundheit stark vom mitochondrialen Stoffwechsel abhängig ist und dass die Photorezeptoren stattdessen stark auf die Glykolyse angewiesen^{sind 3}. Dadurch wurde das Konzept komplementärer, miteinander verflochtener Stoffwechselzustände zwischen Photorezeptoren und dem RPE eingeführt. Insbesondere reduziert das RPE seinen Metabolismus von bevorzugten Photorezeptor-Stoffwechselsubstraten und nutzt stattdessen die Nebenprodukte des Photorezeptorstoffwechsels in Kombination mit den Metaboliten, die Photorezeptoren nicht verbrauchen. Bei Krankheiten wie PVR und AMD deuten Hinweise stark darauf hin, dass das RPE glykolytischer und weniger abhängig vom mitochondrialen Stoffwechsel wird; Diese Verschiebung hin zur RPE-Glykolyse kann dazu führen, dass die Photorezeptoren die benötigten Metaboliten verlieren, was zu einer Degeneration führt ^4,5,6. Angesichts der gegenseitigen Abhängigkeit von RPE und Photorezeptorstoffwechsel und der Tatsache, wie stark ein veränderter Stoffwechsel der Netzhauterkrankung zugrunde liegt, besteht ein starkes Interesse an der Modellierung und Manipulation des RPE-Stoffwechsels für therapeutische Zwecke.

Während die Untersuchung des mitochondrialen RPE-Stoffwechsels in vivo ideal ist, können viele Aspekte des mitochondrialen RPE-Stoffwechsels nur in einem in vitro-Kultursystem praktisch untersucht werden. In den letzten Jahrzehnten wurden erhebliche Fortschritte auf dem Weg zu High-Fidelity-RPE-Kulturen erzielt, so dass die am sorgfältigsten gepflegten RPE-Kulturen heute in klinischen Studien am Menschen für die Zellersatztherapie verwendet werden⁷. Um solche High-Fidelity-Kulturen zu erhalten, muss das RPE vor dem Experimentieren monatelang auf bestimmten Substraten in bestimmten Medien gezüchtet werden. Unter diesen Bedingungen sind RPE-Kulturen maximal differenziert und polarisiert, was sich dem in vivo RPE annähert. Leider gibt es derzeit keine Geräte, die den mitochondrialen Stoffwechsel spezifisch aus dem RPE in vivo messen können. Während die Sauerstoffüberwachung des retinalen Kapillarnetzwerks in vivo mit Hilfe der Elektronen-Paramagnetischen Resonanz (EPR)-Oximetrie⁸ durchgeführt wurde, ist dies bei der RPE-Analyse nicht möglich. Unterschiede zwischen dem RPE-Metabolismus in vivo und in vitro sind nicht gut beschrieben, aber es wurde gezeigt, dass RPE-Kulturen eine hohe mitochondriale Aktivität aufweisen, ähnlich wie RPE in vivo ^3,9, was darauf hindeutet, dass mit Hilfe von High-Fidelity-RPE-Kulturen signifikante Einblicke in den mitochondrialen RPE-Stoffwechsel gewonnen werden können.

Da jeder mitochondriale Stoffwechsel zu einem Sauerstoffverbrauch führt, ist die Messung der RPE-Sauerstoffverbrauchsraten (OCR) ein zuverlässiger Indikator für den mitochondrialen Stoffwechsel. Die Messung von OCR in RPE-Kulturen erwies sich als schwierig, da die Bedingungen, die eine maximale RPE-Polarisation und -Differenzierung begünstigen, mit derzeit verfügbaren Techniken wie dem Seahorse Analyzer oft langfristige genaue OCR-Messungen ausschließen. In diesem Methodenpapier wird ein neuartiges Gerät, der Resipher (im Folgenden als "das System" bezeichnet), vorgestellt, das eine kontinuierliche Messung der OCR über Wochen in RPE ermöglicht, die unter Bedingungen angebaut werden, die die Polarisation und Differenzierung maximal fördern. Die Leichtigkeit, mit der OCR von diesem System unter RPE-Kulturbedingungen gemessen werden kann, die die RPE-Differenzierung und Polarisation maximal fördern, ist einzigartig unter den bestehenden OCR-Messgeräten.

Dieses Dokument enthält Tipps und Tricks für die Verwendung des Systems mit RPE-Kulturen, gefolgt von einer Demonstration von zwei speziellen Anwendungen. Erstens wird die RPE-EMT, die den PVR nachahmt, durch das Engagement gegenüber dem transformierenden Wachstumsfaktor-beta (TGFβ)1,10,11,12 ausgelöst. Das System wird verwendet, um zu überwachen, wie sich der RPE-Stoffwechsel während des EMT-Prozesses entwickelt. Zweitens wird die Rolle von Hypoxie im RPE-Stoffwechsel anhand dieses Systems untersucht. Hypoxie ist ein wichtiger Faktor für die Pathogenese der AMD, da die Choriokapillaris mit dem Alter^{von 13,14} Jahren dünner wird. Die Kombination dieses Systems mit Hypoxiekammern ermöglicht es, den veränderten mitochondrialen RPE-Stoffwechsel mit der subtilen Hypoxie, die mit dem Altern einhergeht, zu modellieren. Schließlich wird ein Online-Rechner mit Resipher-Daten eingeführt, mit dem man bestimmen kann, ob sich RPE-Kulturen in hypoxischen, normoxischen oder hyperoxischen Bedingungen befinden. Solche Informationen sind entscheidend, um Rückschlüsse auf den RPE-Metabolismus aus In-vitro-RPE-Kulturstudien zu ziehen.

Protokoll

Für Protokolle zur Etablierung von humanen Primär- oder iPSC-RPE-Kulturen siehe die folgenden Referenzen 15,16,17,18. Die Gewinnung und Verwendung von menschlichem Gewebe für diese Protokolle wurde vom Institutional Review Board (HUM00105486 der University of Michigan geprüft und genehmigt.

1. Allgemeine Anwendung des Systems auf die RPE-Kultur

1. Platte humane induzierte pluripotente Stammzellen (iPSC), abgeleitete RPE-Zellen oder primäre humane RPE-Zellen in systemkompatiblen 96-Well-Platten.
   1. Unter der Annahme bereits vorhandener reifer Kulturen, die auf 24-Well-Zellkulturplatten gezüchtet wurden, waschen Sie die Zellen einmal mit phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) und fügen Sie dann 500 μl 0,25 % Trypsin-EDTA hinzu (Table of Materials). Inkubieren Sie 10-40 Minuten in einem Zellkultur-Inkubator und kontrollieren Sie alle 5-10 Minuten, bis die Zellen rund und fast bereit zum Ablösen sind.
   2. Pipettieren Sie das Medium vorsichtig über die Zellen, um sie vom Zellkulturkunststoff zu lösen, und übertragen Sie es anschließend auf das 3-fache Volumen des Zellkulturmediums (1.500 μl pro 24-Well) und schleudern Sie es in einer Zentrifuge bei 250 × g für 5 Minuten bei Raumtemperatur.
      HINWEIS: Das Rezept für RPE-Zellkulturmedien ist in Tabelle 1 aufgeführt und in den zuvor veröffentlichten Referenzen 9,15,16,17,18 verfügbar.
   3. Resuspendieren Sie die Zellen in RPE-Zellkulturmedien mit 15 % fötalem Rinderserum (FBS) und zählen Sie die Zellen mit einem Hämozytometer.
   4. 74.000 Zellen für jede Vertiefung einer 96-Well-Platte (in der Regel 225-300 × 10⁵ Zellen/cm²) aussäen, nachdem sie gemäß den Anweisungen des Herstellers mit hochspezialisierten extrazellulären Matrix-Beschichtungssubstraten (Materialtabelle) beschichtet wurden.
      HINWEIS: Keimzellen nur auf einer Resipher-kompatiblen Platte (Materialtabelle) und nur in Vertiefungen, die dem Sondenarray auf dem Messdeckel entsprechen (Spalten 3, 4, 9 und 10 für den 32-Kanal-Deckel; siehe Materialtabelle). Der Sensordeckel des Systems ist mit 4-, 32- oder 96-Kanal-Sensoren erhältlich (siehe Sensorpositionen in Abbildung 1A-D), und eine Reihe von Standard-Zellkulturplatten sind kompatibel.
   5. Da Randvertiefungen anfällig für Verdunstung sind, was sich dramatisch auf die Sauerstoffverfügbarkeit und damit auf die OCR-Messwerte auswirkt, ist das Aussäen von Zellen in allen Randvertiefungen (Reihen A und H einer 96-Well-Platte) zu vermeiden. Geben Sie außerdem 200 μl steriles Wasser in jede der leeren Vertiefungen der 96-Well-Platte, um Verdunstungseffekte zu reduzieren.
   6. Halten Sie die Platte 10 Minuten lang auf einer stabilen Tischfläche, damit sich die Zellen absetzen können. Bringen Sie es dann wieder in den Inkubator zurück. Wechseln Sie das Medium nach 24-72 h und ersetzen Sie es durch Standard-RPE-Nährmedien mit 5 % FBS. Kultur für mindestens 4 Wochen, 2x pro Woche Medienwechsel.
      HINWEIS: Zellen sind bereit für Experimente, wenn sie pigmentiert, kopfsteingepflastert und sehr kompakt sind (Abbildung 1E).
2. Einrichten und Erfassen von Daten mit dem System
   1. Setzen Sie den Sensordeckel auf eine leere 96-Well-Empfängerplatte und setzen Sie diese dann wieder in den Zellkultur-Inkubator ein. Richten Sie das Gerät aus, montieren Sie es auf dem Sensordeckel und verbinden Sie es über das mitgelieferte USB-Kabel mit dem Hub. Dadurch entsteht ein Resipher-"Sandwich" (Abbildung 2A).
   2. Gehen Sie zur Lucid-Lab-Website-Anwendung (https://lab.lucidsci.com/) und klicken Sie auf die Schaltfläche Neues Experiment in der rechten oberen Ecke, um ein neues Experiment zu erstellen.
   3. Nennen Sie den Titel des Experiments und geben Sie alle relevanten experimentellen Notizen für die jeweilige Studie ein (z. B. die Durchgangsnummer des iPSC-RPE, das verwendet wird).
   4. Erstellen Sie Brunnenbedingungen und Behandlungsgruppen. Wenn Sie beispielsweise die Auswirkungen verschiedener Serumkonzentrationen in den Medien mit OCR testen, wählen Sie Serum im Gruppennamen aus, geben Sie dann die zu verwendenden Serumkonzentrationen des Mediums ein und fügen Sie weitere Serumprozentwerte hinzu, indem Sie auf die Schaltfläche + klicken. Weisen Sie zu, welche Vertiefungen einen bestimmten Serumprozentsatz erhalten, und wählen Sie ein Farbmuster für diese Vertiefungen aus. Fügen Sie bei Bedarf weitere Gruppen hinzu (z. B. eine andere experimentelle Variable zum Testen), indem Sie auf die Schaltfläche Gruppe hinzufügen klicken.
   5. Definieren Sie die Platteneinrichtung und wählen Sie das entsprechende Gerät und den Plattenstil aus. Klicken Sie auf die Schaltfläche Platte hinzufügen und wählen Sie Gerät; Wählen Sie den Plattentyp aus. Wählen Sie die Behandlung aus und klicken Sie auf die entsprechende Vertiefung.
   6. Klicken Sie auf die Schaltfläche Jetzt starten , um das Experiment zu starten. Vergewissern Sie sich, dass die Anzeige auf der Website und die LED am Hub durchgehend grün leuchten.
   7. Lassen Sie das System 15 bis 60 Minuten laufen, um sicherzustellen, dass jeder Sensor ordnungsgemäß kalibriert ist und den Luftsauerstoff genau erkennt, der in einem vollständig befeuchteten Zellkultur-Inkubator mit 5 % CO₂ in einer Konzentration von ~200 μM liegen sollte (Abbildung 2Bi).
      HINWEIS: Wenn einer der Sensoren mehr als 20 % vom Durchschnitt der anderen Sensoren in einem Standard-Zellkultur-Inkubator abweicht, sollten Sie dies bei der Datenanalyse ausschließen, da der Sensor fehlerhaft ist (Abbildung 2Bii).
      HINWEIS: Wenn alle Sensoren mehr als 20 % vom Durchschnitt der anderen Sensoren und von dem erwarteten atmosphärischen O₂ abweichen, der in einem Standard-Zellkultur-Inkubator als 200 μM angegeben wird, wurde der Sensordeckel zu oft verwendet. Ersetzen Sie ihn durch einen neuen Sensordeckel (Abbildung 2Biii).
      HINWEIS: Das Abrufen der O_2-Messwerte in der Luft vor Beginn eines Experiments verbessert die Fehlerbehebung danach erheblich. Wenn ein bestimmtes Bohrloch nach Abschluss eines Experiments als Ausreißer auftritt und dieses Bohrloch einen Sensor hatte, der nicht kalibriert war, liegt das Problem möglicherweise am Sensor und nicht am biologischen Replikat.
   8. Nehmen Sie das Gerät vom Sensordeckel ab (lösen Sie jedoch nicht das USB-Kabel vom Gerät). Legen Sie das Gerät kopfüber in den Inkubator, damit der Motor des Geräts zurückgesetzt werden kann. Verwenden Sie das Gerät erst wieder, wenn alle Motorgeräusche verstummt sind (ca. 20-30 s).
      HINWEIS: Es ist wichtig, dass das Gerät während eines Experiments immer über das USB-Kabel mit dem Hub verbunden ist, auch wenn das Gerät nicht am Sensordeckel befestigt ist. Auf diese Weise kann das Gerät die Umgebung des Zellkultur-Inkubators kontinuierlich überwachen und Berichte darüber erstellen.
   9. Setzen Sie die Platte mit dem Sensordeckel wieder in die Zellkulturhaube ein, zusammen mit einer 96-Well-Platte, die die RPE-Kulturen enthält. Ändern Sie das Medium in der Platte mit RPE-Kulturen mit demselben Medium und demselben Volumen für alle Wells, um OCR-Basiswerte für jedes Well zu erhalten. Achten Sie darauf, alle Vertiefungen ohne RPE mit sterilem Wasser zu füllen, um eine Verdunstung zu verhindern.
      HINWEIS: Im Allgemeinen empfehlen wir 60-100 μl RPE-Nährmedien pro 96-Well, basierend auf Daten, die zeigen, dass ein geringeres Medienvolumen zu einem schnellen Nährstoffmangel führt, ein höheres Medienvolumen jedoch zu unbeabsichtigter Hypoxie führt⁹.
   10. Übertragen Sie den Sensordeckel auf die Platte mit den Zellkulturen und den Standarddeckel (ohne Resipher) auf der Platte mit den Zellkulturen auf die leere 96-Well-Empfängerplatte, um die Sterilität des Standarddeckels zu erhalten, die an verschiedenen Stellen während des Experiments benötigt wird.
   11. Setzen Sie die Platte mit den Zellkulturen und den Sensordeckel wieder in den Zellkultur-Inkubator ein. Richten Sie das Gerät erneut aus, montieren Sie es auf dem Sensordeckel und verbinden Sie es über das mitgelieferte USB-Kabel mit dem Hub (Zusammenbau des "Sandwiches"). Vergewissern Sie sich, dass die Anzeigen auf der Website-Oberfläche und im Hub grün leuchten.
       HINWEIS: Die O 2-Konzentrationsdaten werden sofort angezeigt, während die OCR-Daten erst angezeigt werden, nachdem genügend O₂ -Daten gesammelt wurden, etwa 1 Stunde.
   12. Lassen Sie das Gerät die OCR an jedem Well mindestens 12 bis 24 Stunden lang messen, um eine OCR zu erfassen.
       HINWEIS: Die Basis-OCR hängt von vielen Faktoren ab, einschließlich der Art des Mediums, das auf Zellen aufgebracht wird. In Abbildung 2C weisen Standard-RPE-Nährmedien mit unterschiedlichen FBS-Mengen (0 %, 5 %, 15 %) leicht unterschiedliche OCR-Werte auf. Darüber hinaus können Kulturen mit mehr FBS die mitochondriale Aktivität länger aufrechterhalten, nachdem das Medium auf die Zellen aufgetragen wurde, bevor die OCR aufgrund einer Depletion der mitochondrialen Metaboliten abfällt (rechte Seite der Kurve).
   13. Sobald eine OCR zu Studienbeginn erhalten wurde, wiederholen Sie die Schritte 1.2.8 bis 1.2.12, aber ändern Sie das Medium auf der Platte mit RPE-Kulturen an die experimentellen Bedingungen (in der Regel ± einem Medikament oder einem Vergleich verschiedener Medienbedingungen).
       HINWEIS: Routinemäßige Medienwechsel können ebenfalls auf die gleiche Weise gehandhabt werden. Jedes Mal, wenn der Zellkultur-Inkubator geöffnet wird, ist mit erheblichen Unterbrechungen der OCR-Messwerte zu rechnen, da diese von Temperatur, Luftfeuchtigkeit, CO_{2 -} Konzentrationen und anderen Faktoren abhängen, die alle vorübergehend durch das Öffnen der Inkubatortür gestört werden. Während der Entnahme des Geräts aus dem Sensordeckel ist es nicht erforderlich, das Experiment online zu unterbrechen. Nachdem die Tür des Zellkultur-Inkubators geöffnet oder das Medium auf der zu sondierenden Platte gewechselt wurde, dauert es in der Regel 2-4 Stunden, bis der Sauerstoffgradient wieder hergestellt ist und mit der Messung einer genauen OCR begonnen wird.
   14. Nachdem die Daten erhalten wurden, subtrahieren Sie die OCR zu Studienbeginn für jede Vertiefung von der OCR, nachdem die Versuchsbedingung angewendet wurde, um die durch die Behandlung ausgelöste Delta-OCR zu bestimmen.
   15. Nachdem das Experiment abgeschlossen ist, sterilisieren Sie den Sensordeckel und verwenden Sie ihn wieder (der 3-5x wiederverwendet werden kann, obwohl die Leistung bei wiederholtem Gebrauch nachlässt). Um den Messdeckel zu sterilisieren, tauchen Sie den gesamten Deckel 10 Minuten lang in 70 % Ethanol in eine Zellkulturhaube, nehmen Sie ihn dann aus dem Eintauchen und legen Sie ihn mit der Sondenseite nach oben in den Schrank (vermeiden Sie es, die empfindlichen Sondenspitzen zu berühren) und lassen Sie Ethanol und Wasser vollständig verdampfen, bevor Sie den Messdeckel auf eine neue 96-Well-Empfängerplatte setzen.
3. Nehmen Sie Hellfeldbilder auf, um OCR-Werte auf die Zellennummer zu normalisieren.
   HINWEIS: Die Melaninakkumulation in RPE erleichtert die Normalisierung der OCR auf der Grundlage einer einfachen Zählung der Zellzahlen in lebenden Kulturen mit einem Hellfeldmikroskop.
   1. Entfernen Sie das Gerät und stellen Sie es auf den Kopf, wie in Schritt 1.2.8 beschrieben. Tauschen Sie in der Zellkulturhaube den Sensordeckel auf der RPE-Kulturplatte gegen einen Standarddeckel mit 96 Vertiefungen aus.
   2. Nehmen Sie mit einem inversen Standardmikroskop Hellfeldbilder von jeder Vertiefung auf.
      HINWEIS: Halten Sie den Bereich auf dem Bild zwischen den Vertiefungen konsistent (relative Position in der Vertiefung und Objektivvergrößerung).
   3. Ersetzen Sie in der Zellkulturhaube den standardmäßigen 96-Well-Deckel auf der RPE-Kulturplatte durch den Sensordeckel und setzen Sie ihn zur weiteren Überwachung wieder in den Inkubator ein.
   4. Zählen Sie die Zellzahl in jeder Vertiefung mit ImageJ oder einer anderen Software.
   5. Normalisieren Sie OCR auf die Zellzahl in den verschiedenen Versuchsgruppen. Das System meldet OCR in Einheiten von fmol∙(mm²)^-1∙^s-1-dem Verbrauch pro Querschnittseinheit. Um die OCR pro Zelle zu normalisieren, dividieren Sie die OCR daher durch die Zellzahl pro mm² (und nicht durch die Zellzahl pro Well). Äquivalent multiplizieren Sie die vom System gemeldete OCR mit der Querschnittsfläche des Wells (ca. 31 mm² für eine Standardplatte mit 96 Wells), um OCR in den Einheiten fmol∙^s-1∙^well-1 zu erhalten.
4. Kontrollen zur Bestimmung bioenergetischer RPE-Parameter.
   HINWEIS: Um sicherzustellen, dass das System und die RPE-Kulturen auf vorhersehbare Weise auf mitochondriale Manipulationen reagieren, können bestimmte kleine Moleküle getestet werden, die gut etabliert sind, um bestimmte Schritte der mitochondrialen oxidativen Phosphorylierung zu erreichen. Diese Tests sind analog zu den Schritten, die in einem mitochondrialen Stresstest mit dem Seahorse Analyzer¹⁰ durchgeführt werden, und liefern ein bioenergetisches Profil für RPE-Kulturen.
   1. Kultivieren Sie RPE-Zellen in 65 μl Standard-RPE-Kulturmedien mit 5 % FBS und messen Sie OCR für 24 Stunden, um eine Ausgangsbasis zu schaffen.
   2. Aspirieren Sie kultivierte Medien und fügen Sie 65 μl Standard-RPE-Kulturmedien mit 5 % FBS und mitochondrialen Entkopplern (3 μM Carbonylcyanid-p-trifluormethoxyphenylhydrazon [FCCP] oder 500 nM Bam15, Materialtabelle) hinzu. Über Nacht inkubieren.
      HINWEIS: Mitochondriale Entkoppler sollten die OCR signifikant erhöhen. Stellen Sie sicher, dass die erhöhte OCR nicht auf oder in der Nähe der theoretischen maximalen diffusionsbegrenzten OCR von ca. 275 fmol∙(mm²)^-1∙^s-1 für 65 μl Medien unter Standardkulturbedingungen liegt. Max OCR für verschiedene häufig verwendete Medienvolumes ist im Abschnitt Diskussion verfügbar.
   3. Nach der Inkubation über Nacht wird das Medium mit mitochondrialen Entkopplern aspiriert und durch 65 μl Standard-RPE-Kulturmedien mit 5 % FBS ersetzt. Beobachten Sie die Platte für weitere 24 Stunden, um die Wiederfindung der RPE-OCR nach der Entfernung der Medikamente zu bestimmen.
   4. Berechnen Sie die Auswirkungen von Entkopplern auf die OCR, indem Sie die nach der Behandlung erhaltene OCR von der vor der Behandlung erhaltenen OCR subtrahieren (Abbildung 3).
      HINWEIS: Die Erhöhung der OCR durch Zugabe von mitochondrialen Entkopplern bedeutet die mitochondriale Atmungskapazität der Zelle¹⁹.
   5. Um andere mitochondriale Parameter zu messen, die typischerweise während des mitochondrialen Stresstests mit einem Seahorse Analyzer erfasst werden, führen Sie die gleichen Schritte wie oben mit den folgenden Verbindungen durch (Abbildung 4).
      1. Verwenden Sie Oligomycin bei 1 μM, um die ATP-gebundene Atmung zu beurteilen.
      2. Verwenden Sie Antimycin A und Rotenon bei 1 μM, um eine nicht-mitochondriale Atmung zu beurteilen.
         HINWEIS: FCCP, Oligomycin, Antimycin A und Rotenon können für RPE toxisch sein. Wenn sie zu einem signifikanten Zelltod führen, sind OCR-Messungen nicht genau. Daher sollten OCR-Messungen nur zu einem Zeitpunkt durchgeführt werden, zu dem es keinen offensichtlichen Zelltod gibt, in der Regel innerhalb der ersten Stunden nach der Zugabe der Medikamente (Abbildung 4).

2. Messung von Veränderungen des mitochondrialen Stoffwechsels bei RPE unter EMT

1. Befolgen Sie das gleiche Protokoll wie in Abschnitt 1.2 beschrieben.
2. Um eine EMT nach OCR-Ausgangsmessungen zu induzieren, fügen Sie TGF-β2 (10 ng/ml) zu RPE-Kulturen hinzu und überwachen Sie die OCR über einen Zeitraum von 3 Wochen. Aktualisieren Sie das Medium alle 2 bis 3 Tage mit frischem TGFβ2 (Abbildung 5).
3. Mindestens 2x pro Woche Hellfeldbilder wie in Abschnitt 1.3 aufnehmen, um sicherzustellen, dass sich die Zellzahl nicht verändert. Wenn sich die Anzahl ändert, normalisieren Sie die OCR-Werte auf die Zellennummer in jedem Well.
   HINWEIS: Das gleiche Protokoll kann für andere EMT-Induktoren verwendet werden, um langfristige OCR-Veränderungen während des gesamten Kulturzeitraums zu überwachen, während sich die Zellen im Inkubator befinden.

3. Messung von Veränderungen im mitochondrialen Stoffwechsel bei hypoxischem RPE

HINWEIS: Die Anwendung des Systems unter hypoxischen, normoxischen oder hyperoxischen Bedingungen ist die gleiche wie in Abschnitt 1.2, mit der Ausnahme, dass das "Sandwich" in einer Hypoxiekammer (Materialtabelle) in einem Standard-Zellkultur-Inkubator aufbewahrt wird.

1. Bohren Sie ein Loch in den Deckel der Hypoxiekammer, durch das das USB-Typ-C-Kabel geführt wird, und versiegeln Sie es mit Silikon oder Kitt (Abbildung 6A).
2. Montieren Sie den Sensordeckel mit der Zellkulturplatte in der Haube und übertragen Sie sie in die Hypoxiekammer.
3. Stellen Sie das "Sandwich" (Platte, Sensordeckel, Gerät) in der Hypoxiekammer auf. Stellen Sie auch eine Petrischale mit sterilem Wasser in die Hypoxiekammer, um die Luftfeuchtigkeit aufrechtzuerhalten. Platzieren Sie abschließend einen tragbaren O₂ -Sensor in der Hypoxiekammer (Materialtabelle). Das Setup ist in Abbildung 6A dargestellt.
4. Verschließen Sie die Kammer und schließen Sie sie an eine Gasflasche mit einer hypoxischen Konzentration von O₂ und der Standard-Zellkulturkonzentration von CO₂ an (z. B. 1 % O₂ und 5 % CO₂) an.
5. Tauschen Sie die Luft in der Hypoxiekammer langsam gegen die 1 % O₂/5 % CO₂ -Luft in der Flasche aus, bis der Sauerstoffsensor die gewünschte O₂ -Konzentration anzeigt, normalerweise irgendwo zwischen 1 % und 10 %.
   HINWEIS: Der tragbare O₂ -Sensor benötigt Zeit, um sich auszugleichen, daher sollte das Gas aus der Flasche langsam in die Hypoxiekammer gegeben werden.
6. Schließen Sie die Einlass- und Auslassventile der Hypoxiekammer und übertragen Sie die gesamte Kammer in den Inkubator.
7. Richten Sie das Experiment wie in Abschnitt 1.2 ein und starten Sie es.
   HINWEIS: Das Voräquilibrieren von Medien in der Hypoxiekammer vor der Zugabe zu Zellen kann die Zeit verkürzen, die die Zellmonoschicht benötigt, um eine echte Hypoxie zu erleben (Abbildung 6B).

4. Berechnung der_{O2-Konzentration} an der RPE-Monoschicht, um zu bestimmen, ob sich Zellen in hypoxischen, normoxischen oder hyperoxischen Bedingungen befinden

HINWEIS: Das System misst die O₂ -Konzentration standardmäßig zwischen ca. 1 und 1,5 mm über dem Boden der Vertiefung, vorausgesetzt, es wird eine Standardplatte mit dem entsprechenden empfohlenen Messdeckel für Monolayer-Kulturen verwendet (siehe https://lucidsci.com/docs/LucidScientific_Sensing_Lid_Selection_Guide.pdf). Während die_{O2-Konzentration} an der Zellmonoschicht nicht direkt gemessen wird, können die Daten des Systems verwendet werden, um die_{O2-Konzentration} auf der Ebene des RPE abzuschätzen. Insbesondere in dem Wissen, dass zwischen dem oberen Teil der Mediensäule, wo O₂ verfügbar ist, und dem unteren Teil der Mediensäule, wo O₂ verbraucht wird, ein Sauerstoffgradient besteht, können die Fickschen Diffusionsgesetze mit der gemessenen OCR-Rate kombiniert werden, um die O₂ -Spiegel in der Zellmonoschicht zu extrapolieren. Ein Rechner für diese Schätzung wird online zur Verfügung gestellt: https://lucidsci.com/notes?entry=oxygen_diffusion (und in Form eines interaktiven Open-Source-Notizbuchs bei https://observablehq.com/@lucid/oxygen-diffusion-and-flux-in-cell-culture, der Quellcode dieses Rechners ist unter https://github.com/lucidsci/oxygen-diffusion-calculator zu finden).

1. Sobald der Rechner aufgerufen ist, geben Sie das Medienvolumen in Mikrolitern ein (z. B. 100 μL).
2. Geben Sie die Konzentration des gesättigten Sauerstoffs an der Grenzfläche zwischen Luft und Flüssigkeit (oben in der Mediensäule über den Zellen) ein. Dieser Wert beträgt ~185 μM bei normalem Atmosphärendruck mit 5 % O₂ und 95 % Luftfeuchtigkeit.
   HINWEIS: Dies kann auch anhand von O_2-Messungen mit Systemsonden in reinen Medienvertiefungen (ohne Zellen am Boden der Vertiefung) bestimmt werden.
3. Geben Sie in der Eingabe Flux den vom System gemeldeten Flux/OCR ein.
4. Basierend auf diesen Werten wird die stationäre Sauerstoffkonzentration in jeder Höhe in der Medienspalte berechnet und im Diagramm dargestellt (Abbildung 7). Die x-Achse des Diagramms ist die Höhe in mm über dem Boden der Vertiefung. Die y-Achse ist die berechnete O₂ -Konzentration in dieser Höhe (in μM).
5. Die O₂ -Konzentration am Boden der Vertiefung (wo sich die Zellen befinden) wird in der Zeile unter dem Diagramm angegeben.
   HINWEIS: Im Allgemeinen wird geschätzt, dass RPE in vivo eine_{O2-Konzentration} von 4-9% aufweist. Jeweils 10 μM O₂ unter normalen atmosphärischen Bedingungen entsprechen etwa 1 % O₂. Somit beträgt die Normoxie auf der Ebene der Zellen etwa 40-90 μM O₂. Je höher die Mediensäule ist, desto niedriger befindet sich O₂ auf dem Niveau der RPE-Monoschicht⁹. Wenn sich die Zellen also in hypoxischen Bedingungen zu befinden scheinen, kann das Medienvolumen reduziert werden. Wenn sich Zellen in hyperoxischen Bedingungen zu befinden scheinen, kann das Medienvolumen erhöht werden.

Ergebnisse

Der "Sandwich"-Aufbau für das Resipher-Experiment ist in Abbildung 2A dargestellt. Sensordeckel mit 32 Sonden, die den Spalten 3, 4, 9 und 10 auf der 96-Well-Platte entsprechen, befinden sich zwischen der Zellplatte und dem Gerät. Nach dem Anschließen an die Nabe aktiviert das Gerät Motoren, um den Sensordeckel auf und ab zu bewegen und die_{O2-Konzentration} in der Mediensäule in einem Höhenbereich über der Zellen-Monoschicht (typischerweise 1-1,5 mm) zu messen. Der_O2-Gr...

Diskussion

Der mitochondriale Metabolismus des RPE spielt eine entscheidende Rolle bei der Pathogenese häufiger erblindender Netzhauterkrankungen, einschließlich AMD und PVR. Die Modellierung des mitochondrialen RPE-Stoffwechsels in vitro ermöglicht es, seinen Stoffwechselzustand von dem des umgebenden Gewebes zu isolieren und das Gewebe auf kontrollierte Weise verschiedenen krankheitssimulierenden Beleidigungen auszusetzen. Eine solche in vitro-Modellierung des mitochondrialen RPE-Stoffwechsels wurde durch das...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.25% Trypsin-EDTA	Gibco	#25-200-056
3,3',5-triiodo-L-thyronine sodium salt	Sigma	T5516
32-channel Resipher lid	Lucid Scientific	NS32-101A for Falcon
Antimycin A from streptomyces sp.	Sigma	A8674-25MG	Inhibitor of Complex III of the electron transport chain
BAM15	Sigma	SML1760-5MG	Uncoupling agent to increase mitochondrial respiration
DMSO, cell culture grade	Sigma-aldrich	D4540-100ML	Vehicle for reconstituting mitochondrial drugs
Extracellular matrix coating substrates: Synthemax II-SC	Corning	#3535	Extracellular matrix for hfRPE
Extracellular matrix coating substrates: Vitronectin	Gibco	A14700	Extracellular matrix for iPSC-RPE
FCCP	Sigma	C2920-10MG	Uncoupling agent to increase mitochondrial respiration
Fetal Bovine Serum (Bio-Techne S11550H)	Bio-Techne	S11550H
Hydrocortisone-Cyclodextrin	Sigma	H0396
Hypoxia chamber	Embrient Inc.	MIC-101
N1 Media Supplement	Sigma	N6530
Non-Essential Amino Acids Solution	Gibco	11140050
O2 sensor	Sensit technology or Forensics Detectors	P100 or FD-90A-O2
Penicillin-Streptomycin	Gibco	15140-122
Recombinant human TGFβ2	Peprotech	100-35B	Transforming growth factor beta-2 to induce epithelial-mesenchymal transition
Rotenone	Sigma	R8875-1G	Inhibitor of Complex I of the electron transport chain
System-compatible plate	Corning	#353072
Taurine	Sigma	T8691
αMEM (Alpha Modification of Eagle's Media)	Corning	15-012-CV