Yüksek Derecede Diferansiye ve Polarize Retinal Pigment Epitel Kültürlerinde Oksijen Tüketim Oranlarının Uzun Süreli İzlenmesi

Özet

Retina pigment epitelyal (RPE) kültürlerinde oksijen tüketim oranlarını (OCR) ölçmek için yeni bir cihaz sunuyoruz. Cihaz, plakalar standart bir hücre kültürü inkübatöründeyken standart hücre kültürü plakaları üzerinde standart ortamla büyütülen RPE üzerinde bir seferde haftalarca OCR'yi ölçebilir.

Özet

Mitokondriyal metabolizma, retinada fotoreseptörün sağkalımı için önemli olan tek bir hücre tabakası olan retina pigment epitelinin (RPE) normal işlevi için kritik öneme sahiptir. RPE mitokondriyal disfonksiyonu, gelişmiş dünyada geri dönüşü olmayan körlüğün önde gelen nedeni olan yaşa bağlı makula dejenerasyonu (AMD) ve retina dekolmanlarının kör edici bir komplikasyonu olan proliferatif vitreoretinopatinin (PVR) ayırt edici bir özelliğidir. RPE dejeneratif koşulları, in vivo RPE'yi taklit etmek için oldukça farklılaşmış ve polarize edilmiş RPE kültür sistemleri tarafından iyi modellenmiştir. Bununla birlikte, mitokondriyal fonksiyonun bir temsilcisi olan oksijen tüketim oranlarının (OCR) izlenmesi, bu tür kültür sistemlerinde zor olmuştur, çünkü ideal RPE polarizasyonunu ve farklılaşmasını destekleyen koşullar kolay OCR ölçümlerine izin vermez.

Burada, RPE'yi standart bir hücre kültürü inkübatöründe optimal büyüme substratları ve fizyolojik kültür ortamı üzerinde tutarken, iyi farklılaşmış RPE kültürlerinde OCR'yi haftalarca izlemek için yeni bir sistem olan Resipher'ı tanıtıyoruz. Bu sistem, hücrelerin üzerindeki ortamda bulunan oksijen konsantrasyonu gradyanını ölçerek OCR'yi hesaplar. Bu sistemin OCR'yi tespit etmek için diğer yöntemlere göre avantajlarını ve RPE kültürlerinde OCR'yi ölçmek için sistemin nasıl kurulacağını tartışıyoruz. Sistemi kullanmayla ilgili önemli ipuçlarını ve püf noktalarını ele alıyor, verileri yorumlama konusunda uyarıda bulunuyor ve beklenmeyen sonuçları gidermeye yönelik yönergeleri ele alıyoruz.

Ayrıca, sistem tarafından algılanan hücrelerin üzerindeki ortamdaki oksijen gradyanına dayalı olarak hipoksi, normoksi veya hiperoksi RPE kültürleri deneyiminin seviyesini tahmin etmek için çevrimiçi bir hesap makinesi de sağlıyoruz. Son olarak, bir PVR modelinde RPE hücrelerinin metabolik durumunu ölçmek ve RPE'nin metabolik olarak hipoksiye nasıl adapte olduğunu anlamak için sistemin iki uygulamasını gözden geçiriyoruz. Bu sistemin yüksek derecede polarize ve diferansiye RPE kültürlerinde kullanılmasının, hem fizyolojik hem de hastalık durumları altında RPE mitokondriyal metabolizması hakkındaki anlayışımızı artıracağını tahmin ediyoruz.

Giriş

Retina pigment epiteli (RPE), retinadaki ışığa duyarlı fotoreseptörler ile kan dolaşımı arasında bir bariyer oluşturan, fonksiyonel olarak postmitotik, oldukça polarize epitel hücrelerinin tek tabakasıdır, koryokapillaris olarak adlandırılan bir kılcal yataktır. Glia destekleyici nöronların rolü gibi, RPE de fotoreseptör dış segmentlerinin fagositozu, besinlerin taşınması ve fotoreseptörler için metabolik destek ve temel büyüme faktörlerinin salgılanması dahil olmak üzere fotoreseptörleri desteklemek için sayısız işlevi yerine getirir ve bunların tümü görsel işlevi sürdürmek için kritik öneme sahiptir.

RPE'nin dejenerasyonu, birkaç yaygın d....

Protokol

İnsan birincil veya iPSC-RPE kültürleri oluşturmaya yönelik protokoller için aşağıdaki referanslara bakın 15,16,17,18. Bu protokoller için insan dokusunun edinilmesi ve kullanılması, Michigan Üniversitesi Kurumsal İnceleme Kurulu (HUM00105486) tarafından gözden geçirildi ve izin verildi.

1. Sistemin RPE kültürüne genel uygulaması

1. Sistemle uyumlu 96 oyuklu plakalarda plaka insan kaynaklı pluripotent kök hücre (iPSC) türevi RPE veya birincil insan RPE hücreleri.
   1. 24 oyuklu hücre kült....

Tartışmalar

RPE'nin mitokondriyal metabolizması, AMD ve PVR dahil olmak üzere yaygın kör edici retina hastalıklarının patogenezinde kritik bir rol oynar. RPE mitokondriyal metabolizmasının in vitro olarak modellenmesi, kişinin metabolik durumunu çevre dokularınkinden izole etmesine ve dokuyu kontrollü bir şekilde farklı hastalık simüle eden hakaretlere maruz bırakmasına olanak tanır. RPE mitokondriyal metabolizmasının bu tür in vitro modellemesi, in vivo RPE'ye yakın bir şekilde ya.......

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.25% Trypsin-EDTA	Gibco	#25-200-056
3,3',5-triiodo-L-thyronine sodium salt	Sigma	T5516
32-channel Resipher lid	Lucid Scientific	NS32-101A for Falcon
Antimycin A from streptomyces sp.	Sigma	A8674-25MG	Inhibitor of Complex III of the electron transport chain
BAM15	Sigma	SML1760-5MG	Uncoupling agent to increase mitochondrial respiration
DMSO, cell culture grade	Sigma-aldrich	D4540-100ML	Vehicle for reconstituting mitochondrial drugs
Extracellular matrix coating substrates: Synthemax II-SC	Corning	#3535	Extracellular matrix for hfRPE
Extracellular matrix coating substrates: Vitronectin	Gibco	A14700	Extracellular matrix for iPSC-RPE
FCCP	Sigma	C2920-10MG	Uncoupling agent to increase mitochondrial respiration
Fetal Bovine Serum (Bio-Techne S11550H)	Bio-Techne	S11550H
Hydrocortisone-Cyclodextrin	Sigma	H0396
Hypoxia chamber	Embrient Inc.	MIC-101
N1 Media Supplement	Sigma	N6530
Non-Essential Amino Acids Solution	Gibco	11140050
O2 sensor	Sensit technology or Forensics Detectors	P100 or FD-90A-O2
Penicillin-Streptomycin	Gibco	15140-122
Recombinant human TGFβ2	Peprotech	100-35B	Transforming growth factor beta-2 to induce epithelial-mesenchymal transition
Rotenone	Sigma	R8875-1G	Inhibitor of Complex I of the electron transport chain
System-compatible plate	Corning	#353072
Taurine	Sigma	T8691
αMEM (Alpha Modification of Eagle's Media)	Corning	15-012-CV