JoVE Logo
Yazarlar
Bize Ulaşın

Oturum Aç

Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliği gereklidir. Oturum açın veya ücretsiz deneme sürümünü başlatın.

Bu Makalede

  • Özet
  • Özet
  • Giriş
  • Protokol
  • Sonuçlar
  • Tartışmalar
  • Açıklamalar
  • Teşekkürler
  • Malzemeler
  • Referanslar
  • Yeniden Basımlar ve İzinler

Özet

Retina pigment epitelyal (RPE) kültürlerinde oksijen tüketim oranlarını (OCR) ölçmek için yeni bir cihaz sunuyoruz. Cihaz, plakalar standart bir hücre kültürü inkübatöründeyken standart hücre kültürü plakaları üzerinde standart ortamla büyütülen RPE üzerinde bir seferde haftalarca OCR'yi ölçebilir.

Özet

Mitokondriyal metabolizma, retinada fotoreseptörün sağkalımı için önemli olan tek bir hücre tabakası olan retina pigment epitelinin (RPE) normal işlevi için kritik öneme sahiptir. RPE mitokondriyal disfonksiyonu, gelişmiş dünyada geri dönüşü olmayan körlüğün önde gelen nedeni olan yaşa bağlı makula dejenerasyonu (AMD) ve retina dekolmanlarının kör edici bir komplikasyonu olan proliferatif vitreoretinopatinin (PVR) ayırt edici bir özelliğidir. RPE dejeneratif koşulları, in vivo RPE'yi taklit etmek için oldukça farklılaşmış ve polarize edilmiş RPE kültür sistemleri tarafından iyi modellenmiştir. Bununla birlikte, mitokondriyal fonksiyonun bir temsilcisi olan oksijen tüketim oranlarının (OCR) izlenmesi, bu tür kültür sistemlerinde zor olmuştur, çünkü ideal RPE polarizasyonunu ve farklılaşmasını destekleyen koşullar kolay OCR ölçümlerine izin vermez.

Burada, RPE'yi standart bir hücre kültürü inkübatöründe optimal büyüme substratları ve fizyolojik kültür ortamı üzerinde tutarken, iyi farklılaşmış RPE kültürlerinde OCR'yi haftalarca izlemek için yeni bir sistem olan Resipher'ı tanıtıyoruz. Bu sistem, hücrelerin üzerindeki ortamda bulunan oksijen konsantrasyonu gradyanını ölçerek OCR'yi hesaplar. Bu sistemin OCR'yi tespit etmek için diğer yöntemlere göre avantajlarını ve RPE kültürlerinde OCR'yi ölçmek için sistemin nasıl kurulacağını tartışıyoruz. Sistemi kullanmayla ilgili önemli ipuçlarını ve püf noktalarını ele alıyor, verileri yorumlama konusunda uyarıda bulunuyor ve beklenmeyen sonuçları gidermeye yönelik yönergeleri ele alıyoruz.

Ayrıca, sistem tarafından algılanan hücrelerin üzerindeki ortamdaki oksijen gradyanına dayalı olarak hipoksi, normoksi veya hiperoksi RPE kültürleri deneyiminin seviyesini tahmin etmek için çevrimiçi bir hesap makinesi de sağlıyoruz. Son olarak, bir PVR modelinde RPE hücrelerinin metabolik durumunu ölçmek ve RPE'nin metabolik olarak hipoksiye nasıl adapte olduğunu anlamak için sistemin iki uygulamasını gözden geçiriyoruz. Bu sistemin yüksek derecede polarize ve diferansiye RPE kültürlerinde kullanılmasının, hem fizyolojik hem de hastalık durumları altında RPE mitokondriyal metabolizması hakkındaki anlayışımızı artıracağını tahmin ediyoruz.

Giriş

Retina pigment epiteli (RPE), retinadaki ışığa duyarlı fotoreseptörler ile kan dolaşımı arasında bir bariyer oluşturan, fonksiyonel olarak postmitotik, oldukça polarize epitel hücrelerinin tek tabakasıdır, koryokapillaris olarak adlandırılan bir kılcal yataktır. Glia destekleyici nöronların rolü gibi, RPE de fotoreseptör dış segmentlerinin fagositozu, besinlerin taşınması ve fotoreseptörler için metabolik destek ve temel büyüme faktörlerinin salgılanması dahil olmak üzere fotoreseptörleri desteklemek için sayısız işlevi yerine getirir ve bunların tümü görsel işlevi sürdürmek için kritik öneme sahiptir.

RPE'nin dejenerasyonu, birkaç yaygın dejeneratif görme bozukluğunun temelini oluşturur. Dünyada tedavi edilemez görme kaybının en yaygın nedenlerinden biri olan yaşa bağlı makula dejenerasyonunda (AMD), RPE ölür ve bu nedenle üstteki fotoreseptörler ikincil bir dejenerasyona uğrar. Proliferatif vitreoretinopatide (PVR), RPE bunun yerine normalde hareketsiz olan postmitotik durumundan çıkar, çoğalır ve metabolizmasındaki değişikliklerle mezenkimal duruma (epitelyalden mezenkimal geçişe [EMT] olarak adlandırılır) farklılaşır. RPE farklılaşması, fotoreseptörlere RPE desteğinin kaybına neden olurken aynı zamanda daha fibrotik bir durumu tetikler. Bu, hem fotoreseptör dejenerasyonu hem de RPE'nin neden olduğu yara izi ile sonuçlanırve her ikisi de görme kaybını tetikler 1,2.

RPE'nin fotoreseptörlere desteğinin büyük bir kısmı metaboliktir ve metabolik düzensizlik, AMD ve PVR dahil olmak üzere çok sayıda retina hastalığında kritik bir faktördür. RPE, fotoreseptörler ile oksijen ve besin kaynakları olan koryokapillaris arasında düzenleyici bir bariyer görevi görür. Bu nedenle, RPE'nin metabolize etmeyi seçtiği şeye karşı RPE'nin koryokapilleristen fotoreseptörlere geçmeyi seçtiği şey, fotoreseptör metabolizmasını ve sağkalımını güçlü bir şekilde yönetir. Çok sayıda çalışma, RPE'nin normal sağlığı için büyük ölçüde mitokondriyal metabolizmaya bağımlı olduğunu ve fotoreseptörlerin bunun yerine büyük ölçüde glikoliz3'e dayandığını göstermiştir. Bu, fotoreseptörler ve RPE arasında tamamlayıcı, iç içe geçmiş metabolik durumlar kavramını ortaya çıkarmıştır. Spesifik olarak, RPE, tercih edilen fotoreseptör metabolik substratlarının metabolizmasını azaltır ve bunun yerine fotoreseptörlerin tüketmediği metabolitlerle birlikte fotoreseptör metabolizmasının yan ürünlerini kullanır. PVR ve AMD gibi hastalıklarda, kanıtlar RPE'nin daha glikolitik hale geldiğini ve mitokondriyal metabolizmaya daha az bağımlı hale geldiğini güçlü bir şekilde göstermektedir; RPE glikolize doğru bu kayma, ihtiyaç duyduğu metabolitlerin fotoreseptörlerini aç bırakarak dejenerasyonu tetikleyebilir 4,5,6. RPE ve fotoreseptör metabolizmasının ne kadar birbirine bağımlı olduğu ve retina hastalığının altında ne kadar değişmiş metabolizma olduğu göz önüne alındığında, RPE metabolizmasının terapötik amaçlar için modellenmesi ve manipüle edilmesine büyük ilgi vardır.

RPE mitokondriyal metabolizmasını in vivo olarak incelemek ideal olsa da, RPE mitokondriyal metabolizmasının birçok yönü sadece bir in vitro kültür sisteminde pratik olarak incelenebilir. Son birkaç on yılda, yüksek kaliteli RPE kültürlerine doğru önemli ilerlemeler kaydedilmiştir, öyle ki, en dikkatli şekilde tımar edilen RPE kültürleri şu anda insan klinik çalışmalarında hücre replasman tedavisi için kullanılmaktadır7. Bu tür yüksek kaliteli kültürleri korumak için, RPE'nin deneyden aylar önce belirli ortamlarda, belirli substratlarda büyütülmesi gerekir. Bu koşullarla, RPE kültürleri maksimum düzeyde farklılaşır ve polarize edilir, bu da in vivo RPE'ye yaklaşır. Ne yazık ki, şu anda mitokondriyal metabolizmayı özellikle in vivo olarak RPE'den ölçebilecek hiçbir ekipman mevcut değildir. Retina kılcal damar ağının oksijen izlemesi, elektron paramanyetik rezonans (EPR) oksimetre8 kullanılarak in vivo olarak gerçekleştirilmiş olsa da, RPE analizi için bu mümkün değildir. RPE metabolizması in vivo ve in vitro arasındaki farklar iyi tanımlanmamıştır, ancak RPE kültürlerinin RPE'ye benzer şekilde yüksek mitokondriyal aktiviteye sahip olduğu gösterilmiştir in vivo 3,9, bu da RPE mitokondriyal metabolizması hakkında önemli bilgiler edinilebileceğini düşündürmektedir.

Tüm mitokondriyal metabolizma oksijen tüketimine yol açtığından, RPE oksijen tüketim oranlarının (OCR) ölçülmesi mitokondriyal metabolizma için sadık bir vekildir. Maksimum RPE polarizasyonunu ve farklılaşmasını destekleyen koşullar genellikle Denizatı Analizörü gibi şu anda mevcut olan tekniklerle uzun vadeli doğru OCR ölçümlerini engellediğinden, RPE kültürlerinde OCR'yi ölçmek zor olmuştur. Bu yöntem makalesinde, polarizasyonu ve farklılaşmayı maksimum düzeyde destekleyen koşullar altında yetiştirilen RPE'de OCR'nin haftalar boyunca sürekli olarak ölçülmesine izin veren Resipher (bundan böyle "sistem" olarak anılacaktır) olarak adlandırılan yeni bir cihaz tanıtılmaktadır. RPE farklılaşmasını ve polarizasyonunu maksimum düzeyde destekleyen RPE kültür koşullarında OCR'nin bu sistem tarafından ölçülebilme kolaylığı, mevcut OCR ölçüm cihazları arasında benzersizdir.

Bu makale, sistemi RPE kültürleriyle kullanmak için ipuçları ve püf noktaları sağlar, ardından iki özel uygulamanın bir gösterimi yapılır. İlk olarak, PVR'yi taklit eden RPE EMT, dönüştürücü büyüme faktörü-beta'ya (TGFβ) maruz kalarak tetiklenir1,10,11,12. Sistem, EMT süreci sırasında RPE metabolizmasının nasıl geliştiğini izlemek için kullanılır. İkinci olarak, hipoksi'nin RPE metabolizmasındaki rolü bu sistem kullanılarak araştırılmıştır. Hipoksi, koryokapillaris13,14 yaşla birlikte inceldiği için AMD'nin patogenezine önemli bir katkıda bulunur. Bu sistemi hipoksi odalarıyla birleştirmek, yaşlanmaya eşlik eden ince hipoksi ile değişmiş RPE mitokondriyal metabolizmasını modellemeye izin verir. Son olarak, RPE kültürlerinin hipoksik, normoksik veya hiperoksik koşullarda olup olmadığını belirlemeye izin vermek için Resipher verilerini kullanan bir çevrimiçi hesap makinesi tanıtıldı. Bu tür bilgiler, in vitro RPE kültür çalışmalarından RPE metabolizması hakkında herhangi bir sonuç çıkarmak için kritik öneme sahiptir.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protokol

İnsan birincil veya iPSC-RPE kültürleri oluşturmaya yönelik protokoller için aşağıdaki referanslara bakın 15,16,17,18. Bu protokoller için insan dokusunun edinilmesi ve kullanılması, Michigan Üniversitesi Kurumsal İnceleme Kurulu (HUM00105486) tarafından gözden geçirildi ve izin verildi.

1. Sistemin RPE kültürüne genel uygulaması

  1. Sistemle uyumlu 96 oyuklu plakalarda plaka insan kaynaklı pluripotent kök hücre (iPSC) türevi RPE veya birincil insan RPE hücreleri.
    1. 24 oyuklu hücre kültürü plakalarında halihazırda mevcut olgun kültürlerin yetiştirildiğini varsayarsak, hücreleri bir kez fosfat tamponlu salin (PBS) ile yıkayın ve ardından 500 μL% 0.25 tripsin-EDTA ekleyin (Malzeme Tablosu). Bir hücre kültürü inkübatöründe 10-40 dakika inkübe edin, hücreler yuvarlanana ve neredeyse ayrılmaya hazır olana kadar her 5-10 dakikada bir kontrol edin.
    2. Hücre kültürü plastiğinden ayırmak için ortamı hücrelerin üzerine nazikçe pipetleyin, ardından 3x hacimde hücre kültürü ortamına (24 oyuk başına 1.500 μL) aktarın, oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 250 × g'da bir santrifüjde döndürün.
      NOT: RPE hücre kültürü ortamı tarifi Tablo 1'de detaylandırılmıştır ve daha önce yayınlanmış referanslarda 9,15,16,17,18 mevcuttur.
    3. RPE hücre kültürü ortamındaki hücreleri% 15 fetal sığır serumu (FBS) ile yeniden süspanse edin ve hücreleri bir hemositometre ile sayın.
    4. 96 oyuklu bir plakanın (genellikle 225-300 × 105 hücre/cm2) her bir oyuğu için 74.000 hücreyi, üreticinin talimatlarını izleyerek son derece özel hücre dışı matris kaplama substratları (Malzeme Tablosu) ile kapladıktan sonra tohumlayın.
      NOT: Tohum hücreleri yalnızca Resipher uyumlu bir plaka üzerinde (Malzeme Tablosu) ve yalnızca algılama kapağındaki prob dizisine karşılık gelen kuyucuklarda (32 kanallı kapak için sütun 3, 4, 9 ve 10; bkz. Sistemin algılama kapağı 4, 32 veya 96 kanallı sensörlerle mevcuttur (Şekil 1A-D'deki sensör konumlarına bakın) ve bir dizi standart hücre kültürü plakası uyumludur.
    5. Kenar kuyuları buharlaşmaya eğilimli olduğundan, oksijen mevcudiyetini önemli ölçüde etkiler ve bu nedenle OCR okumaları, tüm kenar kuyularında (96 oyuklu bir plakanın A ve H Sıraları) hücrelerin tohumlanmasını önler. Ayrıca, buharlaşma etkilerini azaltmak için 96 kuyulu plakanın boş kuyularının her birine 200 μL steril su ekleyin.
    6. Hücrelerin yerleşmesine izin vermek için plakayı 10 dakika boyunca sabit bir masa yüzeyinde tutun; Sonra inkübatöre geri koyun. Besiyerini 24-72 saat sonra değiştirin, yerine %5 FBS'li standart RPE kültür besiyeri koyun. En az 4 hafta boyunca kültür, haftada 2 kez medya değiştirme.
      NOT: Hücreler pigmentli, parke taşı ve oldukça kompakt olduklarında deney için hazırdır (Şekil 1E).
  2. Sistemle veri kurulumu ve elde etme
    1. Algılama kapağını boş bir 96 oyuklu alıcı plakaya yerleştirin ve ardından bunu hücre kültürü inkübatörüne geri yerleştirin. Cihazı algılama kapağına hizalayın ve monte edin ve sağlanan USB kablosuyla Hub'a bağlayın. Bu, bir Resipher "sandviçi" oluşturur (Şekil 2A).
    2. Lucid lab web sitesi uygulamasına (https://lab.lucidsci.com/) gidin ve yeni bir deney oluşturmak için sağ üst köşedeki Yeni Deney düğmesine tıklayın.
    3. Deneyin başlığını adlandırın ve belirli bir çalışma için ilgili deney notlarını girin (örneğin, kullanılan iPSC-RPE'nin geçiş numarası).
    4. Kuyu koşulları ve tedavi grupları oluşturun. Örneğin, ortamdaki farklı serum konsantrasyonlarının OCR üzerindeki etkilerini test ediyorsanız, grup adında Serum'u seçin, ardından kullanılacak ortam serum konsantrasyonlarını girin ve + düğmesine tıklayarak daha fazla serum yüzdesi değeri ekleyin. Hangi kuyucukların belirli bir serum yüzdesi alacağını atayın ve bu kuyucuklar için bir renk deseni seçin. Grup ekle düğmesine tıklayarak gerektiği gibi daha fazla grup ekleyin (örneğin, test edilecek farklı bir deneysel değişken).
    5. Plaka kurulumunu tanımlayın ve ilgili Cihazı ve plaka stilini seçin. Plaka ekle düğmesine tıklayın ve Cihaz'ı seçin; Plaka tipini seçin. Tedaviyi seçin ve ilgili kuyuya tıklayın.
    6. Denemeyi başlatmak için şimdi başlat düğmesini tıklayın. Web sitesindeki göstergenin ve Hub üzerindeki LED'in sabit yeşil olduğunu kontrol edin.
    7. Her sensörün uygun şekilde kalibre edildiğinden ve %5 CO 2 içeren tamamen nemlendirilmiş bir hücre kültürü inkübatöründe ~200 μM konsantrasyonda olması gereken atmosferik oksijeni doğru bir şekilde tespit ettiğinden emin olmak için sistemin 15-60 dakika çalışmasına izinverin (Şekil 2Bi).
      NOT: Standart bir hücre kültürü inkübatörü kurulumunda sensörlerden herhangi biri diğer sensörlerin ortalamasından %20'den fazla indirimliyse, sensör arızalı olduğu için veri analizinde bu kuyuyu hariç tutmayı düşünün (Şekil 2Bii).
      NOT: Tüm sensörler, diğer sensörlerin ortalamasından ve standart bir hücre kültürü inkübatörü kurulumunda 200 μM olarak bildirilen beklenen atmosferik O2'den %2'den fazla indirimliyse, algılama kapağı çok fazla kullanılmıştır; yeni bir algılama kapağı ile değiştirin (Şekil 2Biii).
      NOT: Bir deneye başlamadan önce havadaki O2 okumalarının elde edilmesi, daha sonra sorun gidermeyi önemli ölçüde iyileştirir. Bir deney yapıldıktan sonra belirli bir kuyu aykırı değer olarak görünüyorsa ve bu kuyu kalibrasyon dışı bir sensöre sahipse, sorun biyolojik kopyada değil, sensörde olabilir.
    8. Cihazı algılama kapağından çıkarın (ancak USB kablosunu Cihazdan çıkarmayın). Cihazdaki motorun sıfırlanmasını sağlamak için Cihazı inkübatöre baş aşağı yerleştirin. Tüm motor sesleri kesilene kadar (yaklaşık 20-30 s) Cihazı tekrar kullanmayın.
      NOT: Bir deney sırasında, Cihaz algılama kapağı kapalıyken bile, Cihazı her zaman USB kablosuyla Hub'a bağlı tutmak önemlidir. Bu, Cihazın hücre kültürü inkübatör ortamını sürekli olarak izlemesini ve raporlamasını sağlar.
    9. Algılama kapaklı plakayı, RPE kültürlerini içeren 96 oyuklu bir plaka ile birlikte hücre kültürü başlığına geri yerleştirin. Her kuyucuk için temel OCR değerlerini elde etmek için plakadaki ortamı tüm kuyucuklar için aynı ortama ve aynı hacme sahip RPE kültürleri ile değiştirin. Buharlaşmayı önlemeye yardımcı olmak için RPE'siz tüm kuyuları steril suyla doldurduğunuzdan emin olun.
      NOT: Genel olarak, daha düşük ortam hacimlerinin hızlı besin tükenmesine yol açtığını, ancak daha yüksek ortam hacimlerinin kasıtsız hipoksiye yol açtığını gösteren verilere dayanarak, 96 kuyucuk başına 60-100 μL RPE kültür ortamı öneririz9.
    10. Deney sırasında çeşitli noktalarda ihtiyaç duyulacak olan standart kapağın sterilitesini korumak için algılama kapağını hücre kültürlerini içeren plakaya ve hücre kültürlerini içeren plaka üzerindeki standart (Resipher olmayan) kapağı boş 96 oyuklu alıcı plakaya aktarın.
    11. Hücre kültürlerinin bulunduğu plakayı ve algılama kapağını hücre kültürü inkübatörüne geri yerleştirin. Bir kez daha, Cihazı algılama kapağına hizalayın ve monte edin ve sağlanan USB kablosuyla Hub'a bağlayın ("sandviç"in montajı). Web sitesi arayüzündeki ve Hub'daki göstergelerin tümünün sabit yeşil olduğunu kontrol edin.
      NOT: O2 konsantrasyon verileri hemen görünecek, OCR verileri ise yalnızca yeterli O2 verisi toplandıktan sonra, yaklaşık 1 saat sonra görünecektir.
    12. Temel OCR'yi yakalamak için Cihazın her bir kuyuda OCR'yi en az 12-24 saat ölçmesine izin verin.
      NOT: Taban Çizgisi OCR, hücrelere uygulanan ortam türü de dahil olmak üzere birçok faktöre bağlı olarak farklılık gösterir. Şekil 2C'de, farklı miktarlarda FBS'ye (%0, %5, %15) sahip standart RPE kültür ortamı biraz farklı OCR değerlerine sahiptir. Ayrıca, daha fazla FBS'ye sahip kültürler, mitokondriyal metabolitlerin tükenmesi (eğrinin sağ tarafı) nedeniyle OCR düşmeden önce hücrelere ortam uygulandıktan sonra mitokondriyal aktiviteyi daha uzun süre sürdürebilir.
    13. Bir temel OCR elde edildikten sonra, 1.2.8-1.2.12 adımlarını tekrarlayın, ancak RPE kültürleriyle plaka üzerindeki ortamı kişinin deneysel koşullarına göre değiştirin (tipik olarak, bir ilaç veya farklı ortam koşullarının karşılaştırılması ±).
      NOT: Rutin medya değişiklikleri de aynı şekilde ele alınabilir. Hücre kültürü inkübatörü her açıldığında, sıcaklık, nem, CO2 konsantrasyonları ve inkübatör kapısının açılmasıyla geçici olarak bozulan diğer faktörlere bağlı olduklarından, OCR okumalarında önemli bir bozulma bekleyin. Cihazın algılama kapağından herhangi bir şekilde çıkarılması sırasında, deneyi çevrimiçi olarak duraklatmaya gerek yoktur. Hücre kültürü inkübatörünün kapısı açıldıktan veya problanan plaka üzerindeki ortam değiştirildikten sonra, oksijen gradyanını yeniden oluşturmak ve doğru bir OCR ölçmeye başlamak genellikle 2-4 saat sürecektir.
    14. Veriler elde edildikten sonra, tedavi tarafından tetiklenen Delta OCR'yi belirlemek için deneysel koşul uygulandıktan sonra her bir kuyu için temel OCR'yi OCR'den çıkarın.
    15. Deney tamamlandıktan sonra, algılama kapağını sterilize edin ve yeniden kullanın (tekrarlanan kullanımla performans düşse de 3-5 kez tekrar kullanılabilir). Algılama kapağını sterilize etmek için, tüm kapağı bir hücre kültürü başlığına 10 dakika boyunca %70 etanole daldırın, ardından daldırmadan çıkarın ve kabin probu tarafı yukarı bakacak şekilde dinlendirin (hassas prob uçlarına dokunmaktan kaçının) ve etanol ve suyun tamamen buharlaşmasına izin verin algılama kapağını yeni bir 96 oyuklu alıcı plakaya koymadan önce.
  3. OCR değerlerini hücre numarasına göre normalleştirmek için parlak alan görüntüleri çekin.
    NOT: RPE'deki melanin birikimi, parlak alan mikroskobu kullanılarak canlı kültürlerde basit bir hücre sayısı sayımına dayalı olarak OCR'nin normalleştirilmesini kolaylaştırır.
    1. Cihazı çıkarın ve adım 1.2.8'de olduğu gibi baş aşağı yerleştirin. Hücre kültürü başlığında, RPE kültür plakasındaki algılama kapağını standart 96 oyuklu bir kapakla değiştirin.
    2. Standart bir ters mikroskop kullanarak, her kuyucuğun parlak alan görüntülerini alın.
      NOT: Alanı kuyular arasında bir görüntü tutarlı tutun (kuyudaki göreceli konum ve objektif büyütme).
    3. Hücre kültürü başlığında, RPE kültür plakasındaki standart 96 oyuklu kapağı algılama kapağıyla değiştirin ve daha fazla izleme için inkübatöre geri yerleştirin.
    4. ImageJ veya başka bir yazılımla her bir kuyucuktaki hücre numarasını sayın.
    5. Farklı deney gruplarında OCR'yi hücre numarasına normalleştirin. Sistem, OCR'yi fmol ∙ (mm2) -1∙s-1-kesit birim alanı başına tüketim birimlerinde bildirir. Bu nedenle, hücre başına OCR'yi normalleştirmek için OCR'yi mm2 başına hücre sayısına bölün (kuyu başına hücre sayısı yerine). Eşdeğer olarak, fmol∙s-1∙well-1 birimlerinde OCR elde etmek için sistem tarafından bildirilen OCR'yi kuyunun kesit alanıyla (standart 96 kuyulu bir plaka için yaklaşık 31 mm2) çarpın.
  4. RPE biyoenerjetik parametrelerinin belirlenmesi için kontroller.
    NOT: Sistem ve RPE kültürlerinin mitokondriyal manipülasyonlara öngörülebilir şekillerde yanıt verdiğinden emin olmak için, mitokondriyal oksidatif fosforilasyonun belirli adımlarını hedeflemek için iyi kurulmuş belirli küçük moleküller test edilebilir. Bu testler, Denizatı Analizörü10 kullanılarak bir Mitokondriyal Stres Testinde gerçekleştirilen adımlara benzer ve RPE kültürleri için biyoenerjetik bir profil sağlar.
    1. RPE hücrelerini %5 FBS ile 65 μL standart RPE kültür ortamında kültürleyin ve bir taban çizgisi oluşturmak için 24 saat boyunca OCR'yi ölçün.
    2. Kültürlenmiş ortamı aspire edin ve% 5 FBS ve mitokondriyal ayrıştırıcılarla (3 μM karbonil siyanür-p-triflometoksifenilhidrazon [FCCP] veya 500 nM Bam15, Malzeme Tablosu) 65 μL standart RPE kültür ortamı ekleyin. Gece boyunca kuluçkaya yatırın.
      NOT: Mitokondriyal ayrıştırıcılar OCR'yi önemli ölçüde artırmalıdır. Artan OCR'nin, standart kültür koşullarında 65 μL ortam için yaklaşık 275 fmol∙ (mm2) -1∙s-1 olan teorik maksimum difüzyon sınırlı OCR'de veya yakınında olmadığından emin olun. Yaygın olarak kullanılan farklı medya hacimleri için maksimum OCR, Tartışma bölümünde mevcuttur.
    3. Gece boyunca inkübasyondan sonra, ortamı mitokondriyal ayrıştırıcılarla aspire edin ve %5 FBS'li 65 μL standart RPE kültür ortamı ile değiştirin. İlaçların çıkarılmasından sonra RPE OCR'nin geri kazanımını belirlemek için plakayı 24 saat daha gözlemleyin.
    4. Tedaviden sonra elde edilen OCR'yi tedaviden önce elde edilen OCR'den çıkararak ayrıştırıcıların OCR üzerindeki etkilerini hesaplayın (Şekil 3).
      NOT: Mitokondriyal ayrıştırıcıların eklenmesiyle OCR'deki artış, hücre19'un yedek mitokondriyal solunum kapasitesini gösterir.
    5. Bir Denizatı Analizörü ile Mitokondriyal Stres Testi sırasında tipik olarak yakalanan diğer mitokondriyal parametreleri ölçmek için, yukarıdaki adımların aynısını aşağıdaki bileşiklerle gerçekleştirin (Şekil 4).
      1. ATP'ye bağlı solunumu değerlendirmek için 1 μM'de oligomisin kullanın.
      2. Herhangi bir mitokondriyal olmayan solunumu değerlendirmek için 1 μM'de antimisin A ve rotenon kullanın.
        NOT: FCCP, oligomisin, antimisin A ve rotenon RPE için toksik olabilir. Önemli hücre ölümüne neden olurlarsa, OCR ölçümleri doğru olmayacaktır. Bu nedenle, OCR ölçümleri sadece belirgin bir hücre ölümünün olmadığı bir zaman noktasında, genellikle ilaçlar eklendikten sonraki ilk birkaç saat içinde elde edilmelidir (Şekil 4).

2. EMT geçiren RPE'de mitokondriyal metabolizmadaki değişikliklerin ölçülmesi

  1. Bölüm 1.2'de belirtilen protokolün aynısını izleyin.
  2. Temel OCR ölçümlerini aldıktan sonra EMT'yi indüklemek için, RPE kültürlerine TGF-β2 (10 ng / mL) ekleyin ve OCR'yi 3 hafta boyunca izleyin. Ortamı her 2-3 günde bir taze TGFβ2 ile yenileyin (Şekil 5).
  3. Haftada en az 2 kez, hücre sayısının değişmediğinden emin olmak için bölüm 1.3'teki gibi parlak alan görüntüleri elde edin. Sayım değişirse, OCR değerlerini her bir kutucuktaki hücre numarasına göre normalleştirin.
    NOT: Aynı protokol, hücreler inkübatördeyken kültür periyodu boyunca uzun süreli OCR değişikliklerini izlemek için diğer EMT indükleyicileri için de kullanılabilir.

3. Hipoksik RPE'de mitokondriyal metabolizmadaki değişikliklerin ölçülmesi

NOT: Sistemin hipoksik, normoksik veya hiperoksik koşullar altında uygulanması, "sandviçin" standart bir hücre kültürü inkübatörüne yerleştirilmiş bir hipoksi odasında (Malzeme Tablosu) tutulması dışında, bölüm 1.2 ile aynıdır.

  1. USB type-c kablosunu monte etmek için hipoksi odasının kapağına bir delik açın ve silikon veya macunla kapatın (Şekil 6A).
  2. Algılama kapağını, hücre kültürü plakası ile davlumbaza monte edin ve bunları hipoksi odasına aktarın.
  3. Hipoksi odasına "sandviçi" (plaka, algılama kapağı, Cihaz) yerleştirin. Ayrıca hipoksi odasına, nemin korunmasına yardımcı olmak için steril su içeren bir Petri kabı yerleştirin. Son olarak, hipoksi odasına taşınabilir bir O2 sensörü yerleştirin (Malzeme Tablosu). Kurulum, Şekil 6A'da görüntülenir.
  4. Hazneyi kapatın ve hipoksik O2 konsantrasyonu ve standart hücre kültürü konsantrasyonu CO2 olan bir gaz silindirine bağlayın (örn.% 1O2 ve% 5 CO2).
  5. Oksijen sensörü istenen O2 konsantrasyonunu gösterene kadar, genellikle %1 ile %10 arasında bir yerde, hipoksi odasındaki havayı silindirdeki %1 O2/5% CO2 havası ile yavaşça değiştirin.
    NOT: Taşınabilir O2 sensörünün dengelenmesi için zaman gerekir, bu nedenle silindirden gelen gaz hipoksi odasına yavaşça eklenmelidir.
  6. Hipoksi odasının giriş ve çıkış valflerini kapatın ve tüm odayı inkübatöre aktarın.
  7. Denemeyi bölüm 1.2'deki gibi ayarlayın ve başlatın.
    NOT: Hücrelere eklemeden önce hipoksi odasındaki ortamın önceden dengelenmesi, hücre tek tabakasının gerçek hipoksi yaşaması için geçen süreyi azaltabilir (Şekil 6B).

4. Hücrelerin hipoksik, normoksik veya hiperoksik koşullarda olup olmadığını belirlemek için RPE tek tabakasındakiO2 konsantrasyonunun hesaplanması

NOT: Sistem, tek katmanlı kültür için ilgili önerilen algılama kapağıyla birlikte standart bir plakanın kullanıldığı varsayılarak, varsayılan olarak kuyu tabanının yaklaşık 1 ila 1.5 mm üzerindeki O2 konsantrasyonunu ölçer (bkz. https://lucidsci.com/docs/LucidScientific_Sensing_Lid_Selection_Guide.pdf). Hücre tek tabakasındaki O2 konsantrasyonu doğrudan ölçülmese de, sistemden gelen veriler RPE seviyesindeki O2 konsantrasyonunu tahmin etmek için kullanılabilir. Spesifik olarak, O2'nin mevcut olduğu medya sütununun üst kısmı ile O2'nin tüketildiği medya sütununun alt kısmı arasında bir oksijen gradyanı olduğunu bilerek, Fick'in Difüzyon Yasaları, hücre tek katmanındaki O2 seviyelerini tahmin etmek için ölçülen OCR oranı ile birleştirilebilir. Bu tahmin için bir hesap makinesi çevrimiçi olarak sağlanır: https://lucidsci.com/notes?entry=oxygen_diffusion (ve https://observablehq.com/@lucid/oxygen-diffusion-and-flux-in-cell-culture'ta açık kaynaklı etkileşimli bir not defteri biçiminde, bu hesap makinesinin kaynak kodu şu adreste bulunabilir: https://github.com/lucidsci/oxygen-diffusion-calculator).

  1. Hesap makinesine erişildiğinde, ortam hacmini mikrolitre cinsinden (örn. 100 μL) girin.
  2. Doymuş oksijen konsantrasyonunu hava-sıvı arayüzüne (hücrelerin üzerindeki ortam sütununun üst kısmı) girin. Bu değer, %5O2 ve %95 nem ile standart atmosfer basıncında ~185 μM'dir.
    NOT: Bu, yalnızca ortam kuyularındaki (kuyunun dibinde hücre olmayan) sistem probları tarafından yapılan O2 ölçümlerinden de belirlenebilir.
  3. Flux girişine, sistem tarafından bildirilen Flux/OCR'yi girin.
  4. Bu değerlere dayanarak, ortam sütunundaki her yükseklikteki kararlı durum oksijen konsantrasyonu hesaplanır ve çizimde gösterilir (Şekil 7). Arsanın x ekseni , kuyu tabanının üzerindeki mm cinsinden yüksekliktir. Y ekseni , bu yükseklikte (μM cinsinden) hesaplananO2 konsantrasyonudur .
  5. Kuyu dibindeki (hücrelerin bulunduğu yer) O2 konsantrasyonu, grafiğin altındaki çizgide rapor edilir.
    NOT: Genel olarak, in vivo RPE'nin %4-9'luk bir O2 konsantrasyonu gördüğü tahmin edilmektedir. Standart atmosfer koşullarında her 10 μMO2 , yaklaşık% 1O2'ye karşılık gelir. Bu nedenle, hücre düzeyindeki normoksia yaklaşık 40-90 μMO2'dir. Medya sütunu ne kadar yüksek olursa, O2 o kadar düşük RPE tek katman9 seviyesinde olacaktır. Böylece, hücreler hipoksik koşullarda görünüyorsa, ortam hacmi azaltılabilir. Hücreler hiperoksik koşullarda görünüyorsa, ortam hacmi arttırılabilir.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Sonuçlar

Resipher deneyi için "sandviç" kurulumu Şekil 2A'da gösterilmiştir. 96 oyuklu plaka üzerindeki 3, 4, 9 ve 10 numaralı sütunlara karşılık gelen 32 problu algılama kapakları, hücre plakası ile Cihaz arasına oturur. Hub'a bağlandıktan sonra Cihaz, algılama kapağını yukarı ve aşağı hareket ettirmek için motorları etkinleştirir ve ortam kolonundaki O2 konsantrasyonunu hücre tek tabakasının üzerindeki bir yükseklik aralığında (tipik olarak 1-1,5 mm) ...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Tartışmalar

RPE'nin mitokondriyal metabolizması, AMD ve PVR dahil olmak üzere yaygın kör edici retina hastalıklarının patogenezinde kritik bir rol oynar. RPE mitokondriyal metabolizmasının in vitro olarak modellenmesi, kişinin metabolik durumunu çevre dokularınkinden izole etmesine ve dokuyu kontrollü bir şekilde farklı hastalık simüle eden hakaretlere maruz bırakmasına olanak tanır. RPE mitokondriyal metabolizmasının bu tür in vitro modellemesi, in vivo RPE'ye yakın bir şekilde ya...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Açıklamalar

Richard A. Bryan ve Kin Lo, Resipher sistemini üreten Lucid Scientific'in çalışanlarıdır.

Teşekkürler

Dr. Daniel Hass ve Jim Hurley'e, O2 çözünürlüğünü yeni ve koşullu ortamlarda bir kontrol olarak test etme fikri için teşekkür ederiz. Dr. Magali Saint-Geniez'e el yazması üzerindeki editoryal katkıları için teşekkür ederiz. Kellogg Göz Merkezi, Instrument and Electronic Services Core'dan Scott Szalay'a, hipoksi odasını Resipher USB kablosuyla güçlendirdiği için teşekkür ederiz. HFT araştırması için hiçbir federal fon kullanılmadı. Elektronik Hizmetler Çekirdeği, Ulusal Göz Enstitüsü'nden P30 EY007003 tarafından desteklenmektedir. Bu çalışma, Körlüğü Önleme Araştırmaları'ndan (RPB) sınırsız bir bölüm hibesi ile desteklenmektedir. J.M.L.M., James Grosfeld Kuru Yaşa Bağlı Makula Dejenerasyonu Girişimi, E. Matilda Ziegler Körler Vakfı, Eversight göz bankası hibesi, Ulusal Göz Enstitüsü'nden K08EY033420 hibesi ve Dee ve Dickson Brown'ın yanı sıra David ve Lisa Drews Umudu Keşfetme Vakfı tarafından desteklenmektedir. D.Y.S., UNSW Scientia Programı tarafından desteklenmektedir. L.A.K., Iraty Ödülü, Monte J. Wallace, Michel Plantevin, Ulusal Göz Enstitüsü'nden bir R01EY027739 hibe ve Savunma Bakanlığı Ordusu Tıbbi Araştırma Satın Alma Faaliyeti VR220059 tarafından desteklenmektedir.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Malzemeler

NameCompanyCatalog NumberComments
0.25% Trypsin-EDTAGibco#25-200-056
3,3',5-triiodo-L-thyronine sodium saltSigmaT5516
32-channel Resipher lidLucid ScientificNS32-101A for Falcon
Antimycin A from streptomyces sp.SigmaA8674-25MGInhibitor of Complex III of the electron transport chain
BAM15SigmaSML1760-5MGUncoupling agent to increase mitochondrial respiration
DMSO, cell culture gradeSigma-aldrichD4540-100MLVehicle for reconstituting mitochondrial drugs
Extracellular matrix coating substrates:
Synthemax II-SC		Corning#3535Extracellular matrix for hfRPE
Extracellular matrix coating substrates: VitronectinGibcoA14700Extracellular matrix for iPSC-RPE
FCCPSigmaC2920-10MGUncoupling agent to increase mitochondrial respiration
Fetal Bovine Serum (Bio-Techne S11550H)Bio-TechneS11550H
Hydrocortisone-CyclodextrinSigmaH0396
Hypoxia chamberEmbrient Inc.MIC-101
N1 Media SupplementSigmaN6530
Non-Essential Amino Acids SolutionGibco11140050
O2 sensorSensit technology or Forensics DetectorsP100 or FD-90A-O2
Penicillin-StreptomycinGibco15140-122
Recombinant human TGFβ2Peprotech100-35BTransforming growth factor beta-2 to induce epithelial-mesenchymal transition
RotenoneSigmaR8875-1GInhibitor of Complex I of the electron transport chain
System-compatible plateCorning#353072
TaurineSigmaT8691
αMEM (Alpha Modification of Eagle's Media)Corning15-012-CV

Referanslar

  1. Shu, D. Y., Butcher, E., Saint-Geniez, M. EMT and EndMT: emerging roles in age-related macular degeneration. Int J Mol Sci. 21 (12), 4271(2020).
  2. Shu, D. Y., Lovicu, F. J. Myofibroblast transdifferentiation: the dark force in ocular wound healing and fibrosis. Prog Retin Eye Res. 60, 44-65 (2017).
  3. Hurley, J. B. Retina metabolism and metabolism in the pigmented epithelium: a busy intersection. Annu Rev Vis Sci. 7, 665-692 (2021).
  4. Wu, W., et al. Deficient RPE mitochondria energetics leads to subretinal fibrosis in age-related macular degeneration. Invest Ophthalmol Vis Sci. 64 (8), 2420(2023).
  5. Hansman, D. S., et al. Metabolic reprogramming of the retinal pigment epithelium by cytokines associated with age-related macular degeneration. Biosci Rep. 44 (4), BSR20231904BSR20231904(2024).
  6. Li, K. X., et al. Modulation of pyruvate kinase M2 activity as a therapy in a primary RPE cell culture model of proliferative vitreoretinopathy. Invest Ophthalmol Vis Sci. 62 (8), 2213(2021).
  7. Gupta, S., et al. Progress in stem cells-based replacement therapy for retinal pigment epithelium: in vitro differentiation to in vivo delivery. Stem Cells Transl Med. 12 (8), 536-552 (2023).
  8. Wilson, D. F., et al. Oxygen distribution and vascular injury in the mouse eye measured by phosphorescence-lifetime imaging. Appl Opt. 44 (25), 5239-5248 (2005).
  9. Hass, D. T., et al. Medium depth influences O2 availability and metabolism in human RPE cultures. Invest Ophthalmol Vis Sci. 64 (14), 4(2023).
  10. Shu, D. Y., Butcher, E. R., Saint-Geniez, M. Suppression of PGC-1α drives metabolic dysfunction in TGFβ2-Induced EMT of retinal pigment epithelial cells. Int J Mol Sci. 22 (9), 4701(2021).
  11. Shu, D. Y., et al. Dimethyl fumarate blocks tumor necrosis factor-alpha-driven inflammation and metabolic rewiring in the retinal pigment epithelium. Front Mol Neurosci. 15, 896786(2022).
  12. Ng, P. Q., Saint-Geniez, M., Kim, L. A., Shu, D. Y. Divergent metabolomic signatures of TGFβ2 and TNFα in the induction of retinal epithelial-mesenchymal transition. Metabolites. 13 (2), 213(2023).
  13. Kar, D., et al. Choriocapillaris impairment is associated with delayed rod-mediated dark adaptation in age-related macular degeneration. Invest Ophthalmol Vis Sci. 64 (12), 41(2023).
  14. Curcio, C. A., Kar, D., Owsley, C., Sloan, K. R., Ach, T. Age-related macular degeneration, a mathematically tractable disease. Invest Ophthalmol Vis Sci. 65 (3), 4(2024).
  15. Maminishkis, A., et al. Confluent monolayers of cultured human fetal retinal pigment epithelium exhibit morphology and physiology of native tissue. Invest Ophthalmol Vis Sci. 47 (8), 3612-3624 (2006).
  16. Maminishkis, A., Miller, S. S. Experimental models for study of retinal pigment epithelial physiology and pathophysiology. J Vis Exp: JoVE. (45), e2032(2010).
  17. Zhang, Q., et al. A platform for assessing outer segment fate in primary human fetal RPE cultures. Exp Eye Res. 178, 212-222 (2019).
  18. Sharma, R., Bose, D., Montford, J., Ortolan, D., Bharti, K. Triphasic developmentally guided protocol to generate retinal pigment epithelium from induced pluripotent stem cells. STAR Protoc. 3 (3), 101582(2022).
  19. Marchetti, P., Fovez, Q., Germain, N., Khamari, R., Kluza, J. Mitochondrial spare respiratory capacity: Mechanisms, regulation, and significance in non-transformed and cancer cells. FASEB J. 34 (10), 13106-13124 (2020).
  20. Rosenfeld, P. J., Trivizki, O., Gregori, G., Wang, R. K. An update on the hemodynamic model of age-related macular degeneration. Am J Ophthalmol. 235, 291-299 (2022).
  21. Fitch, T. C., et al. Real-time analysis of bioenergetics in primary human retinal pigment epithelial cells using high-resolution respirometry. J Vis Exp: JoVE. (192), (2023).
  22. Calton, M. A., Beaulieu, M. O., Benchorin, G., Vollrath, D. Method for measuring extracellular flux from intact polarized epithelial monolayers. Mol Vis. 24, 425-433 (2018).
  23. Grumbine, M. K., et al. Maintaining and assessing various tissue and cell types of the eye using a novel pumpless fluidics system. J Vis Exp: JoVE. (197), (2023).
  24. Mu, C., Shearer, J. Protocol for measuring respiratory function of mitochondria in frozen colon tissue from rats. STAR Protoc. 4 (4), 102560(2023).
  25. Rocha, D. S., Manucci, A. C., Bruni-Cardoso, A., Kowaltowski, A. J., Vilas-Boas, E. A. A practical and robust method to evaluate metabolic fluxes in primary pancreatic islets. Mol Metab. 83, 101922(2024).
  26. Kanaan, M. N., et al. Cystine/glutamate antiporter xCT controls skeletal muscle glutathione redox, bioenergetics and differentiation. Redox Biol. 73, 103213(2024).
  27. da Veiga Moreira, J., et al. Methylene blue metabolic therapy restrains in vivo ovarian tumor growth. Cancers. 16 (2), 355(2024).
  28. McNally, L. A., Altamimi, T. R., Fulghum, K., Hill, B. G. Considerations for using isolated cell systems to understand cardiac metabolism and biology. J Mol Cell Cardiol. 153, 26-41 (2021).
  29. Misare, K. R., et al. The consequences of tetraploidy on Caenorhabditis elegans physiology and sensitivity to chemotherapeutics. Sci Rep. 13 (1), 18125(2023).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Yeniden Basımlar ve İzinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya resimlerini yeniden kullanma izni talebi

Izin talebi

Daha Fazla Makale Keşfet

BiyolojiSay 210retina pigment epiteli RPEoksijen t ketim oranlar OCRmitokondrih cre k lt rmetabolizmaya a ba l makula dejenerasyonu AMD

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Gizlilik

Kullanım Şartları

İlkeler

Bize Ulaşın

KÜTÜPHANEYE TAVSİYE ET

JoVE HABER BÜLTENLERİ

Araştırma

Eğitim

Yazarlar

Kütüphaneciler

JoVE Hakkında

Telif Hakkı © 2020 MyJove Corporation. Tüm hakları saklıdır