مقايسة ترابط القرب لتوطين البروتينات في مواقع تلف الحمض النووي

Summary

هنا ، نقدم بروتوكولا بسيطا وسريعا للكشف عن تفاعل البروتين في مواقع تلف الحمض النووي.

Abstract

استجابة تلف الحمض النووي هي حماية للمعلومات الجينية تحمي الخلايا من إدامة الحمض النووي التالف. يسمح توصيف البروتينات التي تتعاون في هذه العملية بتحديد أهداف بديلة للتدخل العلاجي في العديد من الأمراض ، مثل السرطان والأمراض المرتبطة بالشيخوخة والالتهابات المزمنة. ظهر اختبار الترابط القريب (PLA) كأداة لتقدير التفاعل بين البروتينات بالإضافة إلى القرب المكاني بين العضيات أو الهياكل الخلوية ويسمح بالتوطين الزمني وتحليل التوطين المشترك في ظل ظروف الإجهاد ، على سبيل المثال. هذه الطريقة بسيطة لأنها تشبه التألق المناعي التقليدي وتسمح بتلوين عضية أو بنية خلوية أو علامة معينة مثل الميتوكوندريا أو الشبكة الإندوبلازمية أو أجسام PML أو علامة الحمض النووي المزدوجة ، yH2AX في وقت واحد. تستخدم فسفرة S139 في متغير هيستون 2A ، H2AX ، التي يشار إليها بعد ذلك باسم yH2AX ، على نطاق واسع كعلامة حساسة للغاية ومحددة لفواصل الحمض النووي المزدوج. يتوافق كل تركيز من تلطيخ yH2AX مع كسر واحد في الحمض النووي يحدث بعد بضع دقائق من التلف. تحليل التغييرات في بؤر yH2AX هو الاختبار الأكثر شيوعا لدراسة ما إذا كان البروتين محل الاهتمام متورطا في استجابة تلف الحمض النووي (DDR). ما إذا كان من المتوقع حدوث دور مباشر في موقع تلف الحمض النووي ، يتم استخدام الفحص المجهري الفلوري للتحقق من تحديد موقع البروتين محل الاهتمام مع بؤر yH2AX. ومع ذلك ، باستثناء طرق التألق الجديدة فائقة الدقة ، في استنتاج ، يمكن أن يكون التفاعل المحلي مع مواقع تلف الحمض النووي ذاتيا بعض الشيء. هنا ، نعرض فحصا لتقييم توطين البروتينات في مسار DDR باستخدام yH2AX كعلامة على موقع الضرر. يمكن استخدام هذا الاختبار لتوصيف التوطين الزمني تحت إهانات مختلفة تسبب تلف الحمض النووي.

Introduction

يحدث تلف الحمض النووي الخلوي يوميا بسبب التفاعلات الكيميائية العفوية ويزداد أيضا بسبب العوامل الخارجية مثل العوامل السامة للجينات (الإشعاع والمواد الكيميائية مثل إيتوبوزيد) والإجهاد التأكسدي^1،2،3. تحتوي الخلايا على آلية معقدة تصحح عددا لا يحصى من الأنواع المختلفة من تلف الحمض النووي ، من إزالة القواعد إلى التواء الشوكة التكاثري أو الانقطاع إلى الآفة الأكثر ضررا: كسر الحمض النووي المزدوج^4،5.

تم بالفعل تمييز العديد من البروتينات التي تشارك في DDR ، وتستكشف المراجعات الممتازة مسارات الانضمام النهائي غير المتماثل (NHEJ) وإعادة التركيب المتماثل (HR) ، وهي المسارات الرئيسية التي تنطوي عليها إصلاح فواصل الخيط المزدوج (DSB)^5،6. تم استخدام فسفرة متغير هيستون H2A ، H2AX ، في serine 139 (الذي سمي لاحقا y-H2AX) لسنوات عديدة كعلامة حساسة وموثوقة لكسر الخيط المزدوج. لوحظ فسفرة H2AX في الدقائق الأولى بعد التلف ويمكن أن يستمر لساعات⁷.

تتمثل ميزة استخدام الكشف عن التألق المناعي لبؤر γ-H2AX في توصيف التوزيع الزمني والمكاني للبؤر ، بالإضافة إلى تلطيخها المشترك مع البروتينات الأخرى. علاوة على ذلك ، لا يتطلب التألق المناعي التحلل ، مما يحافظ على معلومات السياق الخلوي ويجعله أكثر إفادة. إلى جانب ذلك ، نظرا لأن γ-H2AX يتشكل من جديد ، فإنه لا يوجد بكثرة في حالة عدم وجود تلف في الحمض النووي ، مما يجعله علامة محددة⁷.

يتم فسفرة H2AX في الغالب بواسطة بروتين كيناز ترنح توسع الشعيرات المتحور (ATM) وبروتين كيناز المعتمد على الحمض النووي (DNA-PK) ، مستشعرات DSBs. Ku70 / 80 (XRCC6 إصلاح الأشعة السينية المكمل المتقاطع 6 / XRCC5 إصلاح الأشعة السينية المكمل 5) والوحدة الفرعية التحفيزية لبروتين الحمض النووي كيناز (DNA-PKcs) هي المسؤولة عن تحديد DSB وحماية نهايات الحمض النووي ، بينما تقوم Artemis بالمعالجة النهائية لتسهيل الربط بواسطة مركب XRCC4-Ligase IV. تعمل فسفرة H2AX في المواقع التي تحيط ب DSBs كإشارة لتجنيد العديد من بروتينات الإصلاح والإشارات لإيقاف دورة الخلية أو الموت أو البقاء^{على قيد الحياة 8}.

يعد تحليل التغييرات في بؤر y-H2AX هو الاختبار الأكثر شيوعا لدراسة ما إذا كان البروتين محل الاهتمام متورطا في استجابة تلف الحمض النووي. ما إذا كان من المتوقع وجود دور مباشر في موقع تلف الحمض النووي ، يتم استخدام الفحص المجهري الفلوري للتحقق من التوطين المشترك للبروتين محل الاهتمام مع بؤر y-H2AX. ومع ذلك ، باستثناء طرق التألق الجديدة فائقة الدقة ، قد يكون استنتاج التفاعل المحلي مع مواقع تلف الحمض النووي أمرا صعبا. علاوة على ذلك ، يعتمد اكتشاف التألق المناعي عادة على العديد من جزيئات البروتين في موقع تلف الحمض النووي ، مما يجعل من الصعب تحديد البروتينات النادرة⁹.

هنا ، نعرض اختبارا لتقييم توطين البروتينات المشاركة في مسار DDR باستخدام y-H2AX كعلامة على موقع الضرر. يمكن استخدام هذا الاختبار لتوصيف التوطين الزمني تحت إهانات مختلفة تسبب تلف الحمض النووي.

ظهر اختبار ترابط القرب (PLA) كأداة لتقدير التفاعل بين البروتينات بالإضافة إلى القرب المكاني بين العضيات أو الهياكل الخلوية^10،11ويسمح بالتوطين الزمني وتحليل التوطين المشترك في ظل ظروف الإجهاد ، على سبيل المثال. الطريقة بسيطة لأنها تشبه التألق المناعي التقليدي وتسمح بالتلوين المتزامن للعضيات أو العلامات الخاصة بالهيكل الخلوي ، مثل الميتوكوندريا أو الشبكة الإندوبلازمية أو أجسام PML أو علامة الحمض النووي المزدوجة ، yH2AX. يسمح استخدام PLA بتحديد تفاعل البروتين أثناء تلف الحمض النووي بطريقة حساسة ومحددة وموثوقة يمكن استخدامها لمراقبة التفاعل أثناء دورة الخلية ، استجابة للمنبهات المختلفة ، وفي أوقات مختلفة بعد الإجهاد السام الجيني.

نعرض هنا استخدام PLA بالتزامن مع التألق المناعي التقليدي γ-H2AX لتوطين تفاعل Nek4-Ku70 بعد تلف الحمض النووي الناجم عن الإيتوبوسيد. Nek4 ، أحد أفراد عائلة Nek (كينازات مرتبطة ب NIMA) ، ليس له دور واضح في الاستجابة لتلف الحمض النووي. في عام 2012 ، أظهر نجوين وزملاؤه أن Nek4 يتفاعل مع بروتينات Ku70 / Ku80 ، وفي غياب Nek4 ، لا يتم تجنيد هذه البروتينات في موقع تلف الحمض النووي ، وتضعف فسفرة H2AX¹². التوطين الخلوي لهذا التفاعل غير معروف حتى الآن. لقد لاحظنا انخفاضا في فسفرة Ku70 في الخلايا التي تعبر عن Nek4 متحور كيناز ميت¹³ولكن ما إذا كان Nek4 يفسفريلات مباشرة Ku70 لا يزال يتعين توضيحه. بالنظر إلى أن تفاعل Nek4 مع Ku70 يزداد بعد علاج الإيتوبوسيد وفقا لدراسات الترسيب المناعي¹² ، فإننا نحاول توطين هذا التفاعل باستخدام PLA وعلامة γ-H2AX.

عادة ، تستند دراسات التفاعل إلى فحوصات الترسيب المناعي ، ولكنها في المختبر ولا توفر معلومات حول موقع التفاعل. عندما يكون ذلك ممكنا ، يمكن إجراء ترسيب مناعي للخلايا المجزأة (النواة أو الميتوكوندريا أو الغشاء الخلوي أو العصارة الخلوية) ، ولكن إجراء مسار زمني للتفاعل مكلف وشاق. يمكن أن يعطي التألق المناعي معلومات حول التوطين الخلوي للبروتينات ، ولكن إثبات التفاعل قد يكون صعبا ويعتمد على دقة المجاهر. هنا ، نعرض ميزة استخدام مقايسة Proximity Ligand لمراقبة تفاعل بروتينين في سياق تلف الحمض النووي.

Protocol

1. طلاء الخلية

ملاحظة: يمكن زرع الخلايا في شرائح أو غرف أو ألواح مضان مجهرية. يوصى باستخدام أغطية صغيرة أو ألواح بئر 96/384 لاختبار ظروف متعددة وكواشف احتياطية. ينصح باستخدام أغطية لخطوط الخلايا التي تنفصل بسهولة ، مثل خلايا HEK293. يمكن طلاء الغطاء مسبقا بمحلول بولي إل ليسين لتحسين المرفق.

1. خلايا الصفائح التي تفكر في السيارة والضوابط الفنية والضوابط البيولوجية. استخدم التكرارات الفنية في بئرين أو ثلاثة بئر لكل حالة.
   ملاحظة: استخدام الرقابة التقنية (الثانوية والأساسية الواحدة فقط) إلزامية. إذا كان ذلك ممكنا ، يجب أيضا تضمين المكافحة البيولوجية (على سبيل المثال ، الإفراط في التعبير أو ضربة قاضية لأحد البروتينات المستهدفة أو حالة معروفة بتغيير التفاعل ، على سبيل المثال).
   1. زراعة خلايا U2OS في وسط النسر المعدل (DMEM) من Dulbecco مكمل بنسبة 10٪ من مصل الأبقار الجنينية (FBS) ، و 4.5 جم / لتر من الجلوكوز ، و 4 ملي مولار من L-Glutamine على ألواح معالجة بزراعة الأنسجة عند 37 درجة مئوية في 5٪ ثاني أكسيد الكربون₂ وجو مرطب يحتوي على 90٪ هواء. اعتمادا على عدد الشروط المراد اختبارها وفي حالة استخدام 384 أو غطاء على لوحة 60 مم ، ابدأ من لوحة 60 أو 100 مم ، على التوالي.
   2. عندما تصل الخلايا إلى التقاء 60٪ -70٪ ، قم بتقسيم الخلايا باستخدام 0.25٪ تريبسين-EDTA ¹⁴. عد الخلايا باستخدام غرفة نيوباور أو عداد تلقائي¹⁴. لوحة 4 × 10⁵ خلايا في صفيحة 60 مم تحتوي على أغطية مستديرة متعددة مقاس 13 مم أو 4 × 10⁵ خلايا لكل بئر في لوح (صفائح) 384 بئرا وتحتضن لمدة 12 - 24 ساعة عند 37 درجة مئوية في حاضنة مرطب بنسبة 5٪ ثاني أكسيد الكربون₂ .

2. إعداد الحلول

ملاحظة: تم اختيار تركيز وأوقات العلاج بناء على نتائج الأدبيات ، والتي تشير إلى تنشيط مسارات إصلاح تلف الحمض النووي^15،16.

1. تحضير محلول مخزون Etoposide بتركيز 50 ملي مولار في DMSO. يمكن الاحتفاظ بمحلول المخزون عند -20 درجة مئوية لعدة أشهر. قم بتخفيف محلول الإيتوبوسيد لاستخدامه في وسط الاستزراع الكامل بتركيز نهائي 25 ميكرومتر. استخدم DMSO بنسبة 0.05٪ مخففة في وسط الثقافة الكامل كتحكم في السيارة.
2. تحضير 20x من سترات الصوديوم المالحة (SSC ؛ 3.0 M كلوريد الصوديوم ، 0.30 م سترات ثلاثي الصوديوم درجة الحموضة 7.0). يمكن الاحتفاظ بهذا المحلول لعدة أشهر عند 4 درجات مئوية.

3. علاج الخلايا والتثبيت

ملاحظة: لا تسمح للخلايا بالجفاف في أي لحظة. حاول الاستفادة من الحلول السابقة قدر الإمكان. يجب تحديد الطريقة المناسبة لتثبيت الخلايا (الميثانول المثلج أو 4٪ بارافورمالدهيد (PFA)) مسبقا ، بالإضافة إلى تخفيف الأجسام المضادة ، باستخدام تجربة التألق المناعي التقليدية.

تنبيه: يجب التخلص من الميثانول بشكل صحيح.

1. قم بإزالة وسط الاستزراع من الآبار وأضف وسط استزراع يحتوي على إيتوبوسيد أو DMSO عند 25 ميكرومتر أو 0.05٪ على التوالي. احتضان الخلايا عند 37 درجة مئوية في 5٪ ثاني أكسيد الكربون₂ وجو مرطب يحتوي على 90٪ هواء مع إيتوبوسيد أو DMSO لمدة 3 فترات زمنية مختلفة: 20 دقيقة و 1 ساعة و 3 ساعات. عند استخدام 384 لوحة ، يجب إصلاح جميع الشروط في وقت واحد.
   1. لهذا ، ابدأ بعلاج الحالة بأطول فترة علاج ، مثل 3 ساعات. بعد ساعتين ، عالج حالة العلاج لمدة ساعة واحدة ، وعندما يتبقى 20 دقيقة للتثبيت ، عالج حالة 20 دقيقة. بعد ذلك ، يمكن إصلاح جميع الشروط في نفس الوقت.
2. قم بإزالة الوسط من الآبار واغسل الخلايا باستخدام PBS 3x.
3. قم بإصلاح الخلايا عن طريق إضافة الميثانول المثلج بحجم كاف لتغطية سطح البئر. احتضان لمدة 10 دقائق عند -20 درجة مئوية. اغسل الآبار باستخدام PBS 3x.
   ملاحظة: في هذه المرحلة ، يمكن إيقاف البروتوكول مؤقتا. يمكن تخزين الألواح عند 4 درجات مئوية لمدة أسبوع واحد.

4. النفاذية والحجب

ملاحظة: في حالة استخدام طريقة تثبيت PFA ، يجب تنفيذ خطوة من الحجب بالجلايسين قبل النفاذية. يمكن تحضير غرفة الرطوبة عن طريق وضع وعاء ماء داخل الحاضنة ، مما ينتج عنه رطوبة تبلغ حوالي 95٪. يمكن احتضان اللوحة أو الشرائح 384 في حاوية بلاستيكية مغلقة فوق ورق الترشيح أو الإسفنجة المبللة والفيلم الشفاف.

1. اضغط على PBS من العينات.
2. أضف 30-40 ميكرولتر من المخزن المؤقت للنفاذية (0.2٪ Triton X-100 في PBS) واحتضنه لمدة 20 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. اغسل 3x مع PBS
3. اضغط على PBS من العينات وأضف 30-40 ميكرولتر من محلول حجب 1x المقدم في مجموعة PLA (بدلا من ذلك ، يمكن استخدام 3٪ من ألبومين مصل الأبقار و Triton X-100 0.1٪ في محلول PBS) لكل بئر / غطاء.
4. احتضان اللوحة في غرفة رطوبة مسخنة مسبقا عند 37 درجة مئوية لمدة 1 ساعة.

5. حضانة الأجسام المضادة الأولية (PLA)

ملاحظة: في حالة استخدام أغطية ، من المهم التأكد من أن محلول الجسم المضاد يغطي جميع أسطح الغطاء. يجب إيلاء اهتمام خاص لاختيار الأجسام المضادة. يجب أن تكون الأجسام المضادة من أنواع حيوانية مختلفة ، ويجب ألا يكون الجسم المضاد الثانوي المستخدم ل γ-H2AX ضد مضيف الأنواع لإنتاج مجسات PLA. على سبيل المثال ، نشأت الأجسام المضادة الأولية المستخدمة لجيش التحرير الشعبى الصينى في الفئران الماعز. تم إنتاج مجسات جيش التحرير الشعبى الصينى ، ومضاد الفأر ، ومضاد للماعز في الحمار. تم إنتاج الجسم المضاد ضد γ-H2AX في الأرانب ، والثانوي المستخدم هو مضاد للأرانب المنتج في الحمير. بهذه الطريقة ، لن يتعرف الثانوي على مجسات PLA.

1. تمييع الأجسام المضادة الأولية (الفأر المضاد ل Ku70 1: 100 والماعز المضاد ل Nek4 1:50 ؛ الأرانب المضادة ل Nek5 1:25 والفأر المضاد ل TOPIIβ 1:25) في مخفف الأجسام المضادة المتوفرة في المجموعة (بدلا من ذلك ، يمكن استخدام 3٪ من ألبومين مصل الأبقار و Triton X-100 0.1٪ في محلول PBS). قم بإعداد 30 ميكرولتر من محلول الأجسام المضادة لكل حالة في حالة استخدام أغطية أو 20 ميكرولتر لكل بئر إذا كنت تستخدم لوحا بسعة 384 بئرا.
2. اضغط على حل الحظر. أضف محلول الجسم المضاد الأساسي لكل بئر. احتضن عند 4 درجات مئوية طوال الليل في غرفة الرطوبة.

6. حضانة مسبار جيش التحرير الشعبى الصينى

ملاحظة: اختر المجسات ، مع مراعاة ليس فقط الأجسام المضادة الأولية ولكن أيضا تلك المعدة للاستخدام في خطوات التألق المناعي. عند استخدام ألواح 384 بئرا للحضانة الطويلة 37 درجة مئوية ، يمكن استخدام الدوران البطيء لتحسين توزيع محلول الجسم المضاد.

1. تمييع مجسات الطرح والزائد 1: 5 في مخفف الجسم المضاد. قم بإعداد 10 ميكرولتر لكل بئر في حالة استخدام ألواح 384 بئرا أو 20 ميكرولتر لكل عينة إذا كنت تستخدم أغطية. الاستفادة من المجموعات التالية: الحمار المضاد للفأر ناقص مع الحمار المضاد للماعز زائد ؛ حمار مضاد للفأر ناقص مع حمار مضاد للأرانب زائد.
2. اضغط على محلول الأجسام المضادة الأساسي. اغسل 1x باستخدام TBS-T (50 ملي مولار من الرقم الهيدروجيني 7.5 ، 150 ملي كلوريد الصوديوم ، 0.05٪ من Tween-20). اغسل 3 مرات لمدة 5 دقائق مع TBS-T في درجة حرارة الغرفة. قم بإجراء غسيل إضافي باستخدام TBS-T.
3. اضغط وأضف محلول مسبار PLA مع 10 ميكرولتر للألواح و 20 ميكرولتر للأغطية. احتضن في غرفة الرطوبة المسخنة مسبقا عند 37 درجة مئوية لمدة 1 ساعة.

7. الربط

ملاحظة: انتظر لإضافة Ligase حتى مباشرة قبل إضافته إلى العينات. يجب حفظ اللغاز في كتلة تجميد (-20 درجة مئوية). قم بإزالة محلول الغسيل بالكامل قبل إضافة محلول الليغاز. تجنب ترك الخلايا بدون محلول لفترات طويلة من الزمن. عند استخدام ألواح 384 بئرا للحضانة 37 درجة مئوية ، يمكن استخدام الدوران البطيء لتحسين توزيع محلول الجسم المضاد.

1. قم بتخفيف المخزن المؤقت للربط 5x في ماء عالي النقاء. قم بإعداد 10 ميكرولتر لكل بئر في حالة استخدام ألواح 384 بئرا أو 20 ميكرولتر في حالة استخدام أغطية.
2. اضغط على حل مسبار PLA. اغسل 1x باستخدام TBS-T. اتبعه بثلاث غسلات إضافية ، كل منها لمدة 5 دقائق ، باستخدام TBS-T. اغسل مرة أخيرة واضغط على TBS-T قبل الخطوة التالية.
3. أضف Ligase إلى محلول 1x Ligation في الساعة 1:40 ، مباشرة قبل تطبيقه على العينات. احتضن في غرفة الرطوبة المسخنة مسبقا عند 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة إلى 1 ساعة.

8. التضخيم والغسيل

ملاحظة: انتظر لإضافة البوليميراز حتى قبل إضافته إلى العينة مباشرة. المخزن المؤقت للتضخيم حساس للضوء. حماية جميع المحاليل التي تحتوي على المخزن المؤقت من الضوء. يجب حفظ البوليميراز في كتلة تجميد (-20 درجة مئوية). تجنب ترك الخلايا بدون محلول لفترة طويلة من الزمن. عند استخدام ألواح 384 بئرا للحضانة 37 درجة مئوية ، يمكن أن يؤدي الدوران البطيء إلى تحسين توزيع محلول الجسم المضاد.

1. قم بإزالة محلول الغسيل بالكامل قبل إضافة محلول البوليميراز. تجنب ترك الخلايا بدون محلول لفترة طويلة من الزمن. قم بتخفيف المخزن المؤقت للتضخيم 5x في الماء عالي النقاء. قم بإعداد 10 ميكرولتر لكل بئر في حالة استخدام ألواح 384 بئرا أو 20 ميكرولتر في حالة استخدام أغطية.
2. اضغط على محلول الربط. اغسل 1x باستخدام TBS-T. اتبعه بثلاث غسلات إضافية ، كل منها لمدة 5 دقائق ، باستخدام TBS-T. اغسل مرة أخيرة واضغط على TBS-T قبل الخطوة التالية.
3. أضف البوليميراز إلى محلول التضخيم 1x عند تخفيف 1:80 ، مباشرة قبل تطبيقه على العينات. احتضن في غرفة الرطوبة المسخنة مسبقا عند 37 درجة مئوية لمدة 100 دقيقة.
   ملاحظة: من هذه الخطوة فصاعدا ، تجنب عرض الضوء المباشر
4. اضغط على المخزن المؤقت للتضخيم. اغسل 2x مع 1x SSC المؤقت لمدة 10 دقائق لكل منهما. اغسل 2x مع 0.01x SSC المؤقت لمدة دقيقتين لكل منهما.

9. تلطيخ γ-H2AX (التألق المناعي - IF)

ملاحظة: يتم إجراء وضع العلامات على γ-H2AX بعد الانتهاء من PLA.

1. حضانة الأجسام المضادة الأولية (IF)
   1. تمييع الأجسام المضادة الأولية (Rabbit anti yH2AX في 1: 100) في محلول الحجب (بدلا من ذلك ، يمكن استخدام 3٪ من ألبومين مصل الأبقار و Triton X-100 0.1٪ في محلول PBS). قم بإعداد 30 ميكرولتر من محلول الأجسام المضادة لكل بئر في حالة استخدام أغطية أو 20 ميكرولتر إذا كنت تستخدم صفيحة 384 بئرا.
   2. اضغط على حل SSC 0.01x. اغسل 2x مع PBS.
   3. أضف محلول الجسم المضاد الأساسي لكل بئر. احتضان في درجة حرارة الغرفة لمدة 1 ساعة.
2. حضانة الأجسام المضادة الثانوية (IF)
   ملاحظة: تأكد من أن الأجسام المضادة الثانوية المختارة لا تتعرف على الأجسام المضادة أو المجسات لجيش التحرير الشعبى الصينى. بالإضافة إلى ذلك ، يجب أن يكون الطول الموجي للجسم المضاد الثانوي مختلفا عن الطول الموجي لكاشف الكشف عن PLA. على سبيل المثال: يحتوي كاشف الكشف عن PLA الخاص بنا على الفلوروفور 647 ، والثانوي الذي استخدمناه للكشف عن γ-H2AX هو 488.
   1. تمييع الأجسام المضادة الثانوية (الحمار المضاد للأرانب Alexa Fluor 488) في محلول الحجب (بدلا من ذلك ، يمكن استخدام 3٪ من ألبومين مصل الأبقار و Triton X - 100 0.1٪ في محلول PBS) عند تخفيف 1: 300. قم بإعداد 30 ميكرولتر من محلول الأجسام المضادة لكل حالة في حالة استخدام أغطية أو 20 ميكرولتر لكل بئر إذا كنت تستخدم لوحا بسعة 384 بئرا. أضف صبغة Hoechst 33342 بتركيز نهائي 0.6 ميكروغرام / مل.
   2. اضغط على محلول الأجسام المضادة الأساسي. اغسل 3 مرات باستخدام TBS-T.
   3. أضف محلول الجسم المضاد الثانوي إلى كل بئر. احتضن في درجة حرارة الغرفة لمدة 20 دقيقة.
   4. اغسل 5 مرات باستخدام TBS-T. اغسل 2x مع 1x SSC عازلة. اغسل 2x مع المخزن المؤقت 0.01x SSC.
      ملاحظة: في هذه المرحلة ، يمكن تخزين الألواح لعدة أسابيع عند 4 درجات مئوية (في SSC 0.01X) محمية من الضوء. في حالة استخدام أغطية ، يمكن تركيب الشرائح ، وبعد يوم واحد ، يمكن تخزين الشرائح عند -20 درجة مئوية.

10. الحصول على الصور

1. استخدم مجهر مضان تقليدي وهدف 63x. حدد وقت العرض من خلال مقارنة الضوابط السلبية والإيجابية لتجنب التشبع وانهيار النقاط.
   ملاحظة: يعزز استخدام المجاهر متحدة البؤر اكتشاف نقاط PLA. يمكن أيضا استخدام هدف 20x لزيادة عدد النوى المكتشفة.
2. بمجرد ضبط وقت العرض ، قم بإجراء جميع عمليات الاستحواذ على نقاط PLA بنفس المعلمات. حاول الحصول على صور من مناطق مختلفة من الآبار أو الغطاء لتجنب القطع الأثرية بسبب الحضانة غير المتجانسة.
3. احفظ جميع القنوات التي تحمل نفس نمط الاسم. إذا التقط المجهر صورا في القنوات بشكل منفصل ، فاحفظ الصور المقابلة التي تحمل نفس الاسم ، مع إضافة PLA أو Nucleus فقط في بداية اسم الملف للتمييز بين القناة.

11. تحليل الصور

ملاحظة: تم إنشاء ماكرو لتحليل النقاط لكل نواة في الصورة J/FIJI¹⁷ ولاستخدامه مع المجاهر حيث يجب إضافة معلومات المقياس يدويا. يجب أن يكون حجم البكسل للعدسة الشيئية المستخدمة معروفا. ضع الصور لكل قناة في مجلدات مختلفة (ملف الترميز التكميلي 1 ، الشكل التكميلي 1).
ملاحظة: يأخذ الماكرو في الاعتبار القنوات الفلورية التي تم الحصول عليها بشكل منفصل. في هذه الحالة ، من المهم حفظ جميع الصور التي تحمل نفس الاسم.

1. يسمح الماكرو بتحديد منطقة معينة في الحقل. استخدم الخيار تحديد عائد استثمار عندما تعرض منطقة في الصورة عناصر يمكن أن تضر بالتحليل. اختر عائد الاستثمار في بداية التحليل واستخدمه لجميع الصور.
   ملاحظة: هذه ميزة اختيارية. إذا لم يتم تحديدها ، النظر في الصورة بأكملها في التحليل (الشكل التكميلي 2).
2. يجب إنشاء ملف عائد الاستثمار قبل استخدام الماكرو، كما هو موضح أدناه. لتحديد عائد الاستثمار، استخدم أداة مستطيل، وحدد المنطقة المراد تحليلها، وأضفها إلى مدير عائد الاستثمار بالنقر فوق تحرير > تحديد> إضافة إلى المدير. احفظ عائد الاستثمار بالنقر فوق المزيد> حفظ.
3. في ImageJ ¹⁷ ، افتح الصور من ظروف مختلفة لضبط معلمات التحليل. يجب أن يحدد المستخدم هذه المعلمات وأن يحددها مع البيانات في برنامج الماكرو (ملف الترميز التكميلي 1)
   1. تصحيح الخلفية: لإزالة الخلفية، انقر على معالجة> طرح الخلفية. اختبر نصف قطر الكرة المتدحرجة المختلفة باستخدام وظيفة المعاينة). لقد استخدمنا المتداول 10 لنقاط جيش التحرير الشعبى الصينى ودحرجة 100 للنواة.
   2. قم بإزالة التشويش بالنقر فوق Process > Noise > Despeckle. بالنسبة للنواة ، استخدم الوظيفة السلسة لتحسين ملء النواة بالنقر فوق Process>Smooth.
   3. ضبط الحد: قم بالتحويل إلى صورة 8 بت واضبط الحد بالنقر فوق Image > Type > 8 بت و Image > Adjust >Threshold. اضبط العتبة وفقا لذلك لتصور جميع النواة أو النقاط الموجودة في الصورة مع تجنب التشبع المفرط وانهيار الهياكل. قم بتدوين ملاحظات عن القيم واختبرها في صور مختلفة للتحقق مما إذا كان الحد يعمل مع صور مختلفة.
   4. قم بالتحويل إلى قناع بالنقر فوق معالجة > ثنائي > تحويل إلى قناع. في حالة النواة، انقر فوق عملية > تعبئة ثقوب > الثنائية متبوعة بعملية > ثنائي > مستجمعات المياه. في حالة نقاط PLA ، انقر فوق عملية > مستجمعات المياه الثنائية >.
   5. لعد النوى ، قم بقياس مساحة أو طول النوى المختلفة لتقدير متوسط الحجم. استخدم قيمة تقريبية لتحليل الجسيمات. انقر فوق تحليل > تحليل الجسيمات، ثم حدد تعيين الحجم: 15 إلى ما لا نهاية (تعتمد هذه القيم على حجم النوى). تحقق من الخيارات التالية: إظهار: قناع; عرض النتائج نتائج واضحة; لَخَّصَ; إضافة إلى المدير؛ استبعاد على الحواف.
   6. لحساب نقاط PLA ، قم بقياس مساحة أو نصف قطر النقاط لتقدير متوسط الحجم. حدد تطبيق قناع النواة (تطبيق القناع هو دالة على المكون الإضافي GDSC ، تحقق مما إذا كان مثبتا) متبوعا بتحليل > تحليل الجسيمات وتعيينها. 0.02-3 (تعتمد هذه القيم على حجم النوى). تحقق من الخيارات التالية: إظهار: قناع; عرض النتائج نتائج واضحة; لَخَّصَ; إضافة إلى المدير؛ استبعاد على الحواف.
4. توضح النتائج عدد النقاط لكل نواة في كل نواة موجودة في الصورة. احفظ هذه البيانات.

12. تصور الصور المدمجة

1. افتح القنوات المقابلة لجيش التحرير الشعبى الصينى والنواة و γ-H2AX. اطرح الخلفية وقم بإزالة التشويش، كما هو مذكور في الخطوتين 11.4.1 و 11.4.2 لجميع الصور.
2. اضبط السطوع والتباين تلقائيا أو يدويا باستخدام نفس القيمة لجميع الحالات من نفس القناة. حدد Image > Adjust > Bright/Contrast.
3. اجمع الصور (الدمج) عن طريق تحديد صورة > اللون > دمج القنوات. أضف شريط المقياس عن طريق تحديد تحليل أدوات > > شريط المقياس. حفظ باسم. ملف TIFF.

النتائج

لقد لاحظنا تفاعل Nek4-Ku70 في غياب علاج الإيتوبوزيد. ومع ذلك ، يمكن أن يحدث هذا التفاعل خارج النواة (الشكل 1 أ). يزداد تفاعل Nek4-Ku70 بعد تلف الحمض النووي ويتركز في النواة (الشكل 1 أ). في حالة تفاعل Nek5-Topoisomerase II β (TOPIIβ) ، المستخدم في هذا الاختبار كعنصر ?...

Discussion

تظهر البيانات أن استخدام PLA بالتزامن مع علامة تالفة بالحمض النووي يمكن أن يوفر أكبر قدر من المعلومات في توصيف الاستجابة لتلف الحمض النووي ، مما يدل على السلوك المكاني والزماني للتفاعل بعد الإهانة. PLA هي طريقة متعددة الاستخدامات تم استخدامها لتحديد التلامس ، وتحديد اتصال...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Black 384-well plates	Perkin Elmer Cell carrier plates
Donkey  anti- Rabbit Alexa Fluor 488	Invitrogen	A21206	1:300
Duo link Donkey anti Mouse Minus	Sigma	DUO92004
Duolink antibody diluent	Sigma	DUO82008
Duolink blocking solution 1X	Sigma	DUO82007
Duolink Detection reagent Far red	Sigma	DUO92013
Duolink Donkey anti goat plus	Sigma	DUO92003
Duolink Donkey anti rabbit plus	Sigma	DUO92002
Etoposide	Sigma	E1383
Goat anti Nek4	Santa Cruz Biotechnology	SC-5517	goat anti Nek4 was used at 1:50 dilution
Hoechst 33342	Thermo	H1399	0.6 µg/mL
Leica DMI microscope	Leica
Mouse anti Ku70	Thermo	MA5-13110	mouse anti Ku70 was used at 1:100 dilution
Mouse anti TOPIIβ	Santa Cruz Biotechnology	SC-365071	1:25
Rabbit anti Nek5	Santa Cruz Biotechnology	SC-84527	1:25
Rabbit anti Y H2AX	Cell Signalling	9718S	1:100 dilution
U2OS cell line	ATCC	HTB-96