DNA損傷部位におけるタンパク質の局在化のための近接リガンドアッセイ

要約

ここでは、DNA損傷部位でのタンパク質相互作用を検出するためのシンプルで迅速なプロトコールを紹介します。

要約

DNA損傷応答は、損傷したDNAの永続化から細胞を保護する遺伝情報の保護手段です。このプロセスに協力するタンパク質の特性評価により、がん、老化関連疾患、慢性炎症など、いくつかの疾患に対する治療介入のための代替標的を特定することができます。近接リガンドアッセイ(PLA)は、タンパク質間の相互作用や、オルガネラや細胞構造間の空間的近接性を推定するためのツールとして登場し、例えばストレス条件下での時間的局在化および共局在化の分析を可能にします。この方法は、従来の免疫蛍光法に類似しており、オルガネラ、細胞構造、またはミトコンドリア、小胞体、PML体、DNA二本鎖マーカーyH2AXなどの特定のマーカーを同時に染色できるため、簡単です。ヒストン2A変異体H2AX(当時yH2AXと呼ばれる)でのS139のリン酸化は、DNA二本鎖切断の非常に感度が高く特異的なマーカーとして広く使用されています。yH2AX染色の各焦点は、損傷の数分後に発生するDNAの1つの切断に対応します。yH2AX病巣の変化の解析は、目的のタンパク質がDNA損傷応答(DDR)に関与しているかどうかを研究するための最も一般的なアッセイです。DNA損傷部位への直接的な役割が予想されるかどうかにかかわらず、蛍光顕微鏡法を使用して、目的のタンパク質とyH2AX病巣との共局在を確認します。しかし、新しい超解像蛍光法を除けば、結論として、DNA損傷部位との局所的な相互作用は少し主観的なものになり得る。ここでは、yH2AXを損傷部位のマーカーとして、DDR経路におけるタンパク質の局在を評価するアッセイを示します。このアッセイは、DNA損傷を引き起こすさまざまな傷害下での時間的局在を特徴付けるために使用できます。

概要

細胞DNAの損傷は、自然発生的な化学反応のために毎日発生し、遺伝毒性物質(放射線やエトポシドなどの化学物質)や酸化ストレスなどの外因性因子によっても増加します^1,2,3。細胞は、塩基の除去から複製的なフォークねじれまたは中断、最も有害な病変であるDNA二本^鎖切断4,5まで、無数の異なるタイプのDNA損傷を矯正する複雑な機構を持っています。

DDRに関与するいくつかのタンパク質はすでに特徴付けられており、優れた改訂により、二本鎖切断(DSB^)修復5,6に暗示される主要な経路である非相同末端結合(NHEJ)および相同組換え(HR)の経路が探索されています。ヒストンH2A変異体であるH2AX(以下、y-H2AX)のセリン139(以降y-H2AXと命名)のリン酸化は、二本鎖切断の高感度で信頼性の高いマーカーとして長年使用されてきました。H2AXのリン酸化は、損傷後の最初の数分で観察され、数時間持続する....

プロトコル

1. セルめっき

注:細胞は、顕微鏡の蛍光スライド、チャンバー、またはプレートに播種することができます。複数の条件や予備の試薬の試験には、小さなカバースリップまたは96/384ウェルプレートの使用をお勧めします。HEK293細胞のように簡単に剥離する細胞株には、カバースリップの使用が推奨されます。カバーガラスは、アタッチメントを改善するために、事前にポリ-L-リジン溶液でコーティングすることができます。

1. ビークル、技術的制御、および生物学的制御を考慮したプレートセル。条件ごとに2つまたは3つのウェルでテクニカルレプリケートを使用します。
   注: テクニカル コントロール (セカンダリと 1 つのプライマリのみ) の使用は必須です。可能であれば、生物学的コントロールも含めるべきです(例えば、標的タンパク質の1つの過剰発現またはノックダウン、または相互作用を変化させることが知られている状態など)。
   1. 10%のウシ胎児血清(FBS)、4.5 g/Lグルコース、および4 mMのL-グルタミンを添加したダルベッコのModified Eagle Medium(DMEM)でU2OS細胞を、5%_CO2 および90%の空気を含む加湿雰囲気で37°Cの組織培養処理プレート上で培養します。テストする条件の数に応じて、384または60 mmプ....

ディスカッション

このデータは、DNA損傷マーカーにPLAを併用すると、DNA損傷応答プロファイリングで最も多くの情報を提供できることを示しており、傷害後の相互作用の空間的および時間的挙動を示しています。PLAは、二量体化の同定、オルガネラの接触決定、タンパク質-核酸相互作用、および主にタンパク質-タンパク質相互作用10,11,19,20に使用されてきた汎用性の高い方法です。

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Black 384-well plates	Perkin Elmer Cell carrier plates
Donkey  anti- Rabbit Alexa Fluor 488	Invitrogen	A21206	1:300
Duo link Donkey anti Mouse Minus	Sigma	DUO92004
Duolink antibody diluent	Sigma	DUO82008
Duolink blocking solution 1X	Sigma	DUO82007
Duolink Detection reagent Far red	Sigma	DUO92013
Duolink Donkey anti goat plus	Sigma	DUO92003
Duolink Donkey anti rabbit plus	Sigma	DUO92002
Etoposide	Sigma	E1383
Goat anti Nek4	Santa Cruz Biotechnology	SC-5517	goat anti Nek4 was used at 1:50 dilution
Hoechst 33342	Thermo	H1399	0.6 µg/mL
Leica DMI microscope	Leica
Mouse anti Ku70	Thermo	MA5-13110	mouse anti Ku70 was used at 1:100 dilution
Mouse anti TOPIIβ	Santa Cruz Biotechnology	SC-365071	1:25
Rabbit anti Nek5	Santa Cruz Biotechnology	SC-84527	1:25
Rabbit anti Y H2AX	Cell Signalling	9718S	1:100 dilution
U2OS cell line	ATCC	HTB-96