DNA損傷部位におけるタンパク質の局在化のための近接リガンドアッセイ

要約

ここでは、DNA損傷部位でのタンパク質相互作用を検出するためのシンプルで迅速なプロトコールを紹介します。

要約

DNA損傷応答は、損傷したDNAの永続化から細胞を保護する遺伝情報の保護手段です。このプロセスに協力するタンパク質の特性評価により、がん、老化関連疾患、慢性炎症など、いくつかの疾患に対する治療介入のための代替標的を特定することができます。近接リガンドアッセイ(PLA)は、タンパク質間の相互作用や、オルガネラや細胞構造間の空間的近接性を推定するためのツールとして登場し、例えばストレス条件下での時間的局在化および共局在化の分析を可能にします。この方法は、従来の免疫蛍光法に類似しており、オルガネラ、細胞構造、またはミトコンドリア、小胞体、PML体、DNA二本鎖マーカーyH2AXなどの特定のマーカーを同時に染色できるため、簡単です。ヒストン2A変異体H2AX(当時yH2AXと呼ばれる)でのS139のリン酸化は、DNA二本鎖切断の非常に感度が高く特異的なマーカーとして広く使用されています。yH2AX染色の各焦点は、損傷の数分後に発生するDNAの1つの切断に対応します。yH2AX病巣の変化の解析は、目的のタンパク質がDNA損傷応答(DDR)に関与しているかどうかを研究するための最も一般的なアッセイです。DNA損傷部位への直接的な役割が予想されるかどうかにかかわらず、蛍光顕微鏡法を使用して、目的のタンパク質とyH2AX病巣との共局在を確認します。しかし、新しい超解像蛍光法を除けば、結論として、DNA損傷部位との局所的な相互作用は少し主観的なものになり得る。ここでは、yH2AXを損傷部位のマーカーとして、DDR経路におけるタンパク質の局在を評価するアッセイを示します。このアッセイは、DNA損傷を引き起こすさまざまな傷害下での時間的局在を特徴付けるために使用できます。

概要

細胞DNAの損傷は、自然発生的な化学反応のために毎日発生し、遺伝毒性物質(放射線やエトポシドなどの化学物質)や酸化ストレスなどの外因性因子によっても増加します^1,2,3。細胞は、塩基の除去から複製的なフォークねじれまたは中断、最も有害な病変であるDNA二本^鎖切断4,5まで、無数の異なるタイプのDNA損傷を矯正する複雑な機構を持っています。

DDRに関与するいくつかのタンパク質はすでに特徴付けられており、優れた改訂により、二本鎖切断(DSB^)修復5,6に暗示される主要な経路である非相同末端結合(NHEJ)および相同組換え(HR)の経路が探索されています。ヒストンH2A変異体であるH2AX(以下、y-H2AX)のセリン139(以降y-H2AXと命名)のリン酸化は、二本鎖切断の高感度で信頼性の高いマーカーとして長年使用されてきました。H2AXのリン酸化は、損傷後の最初の数分で観察され、数時間持続することがあります⁷。

γ-H2AX病巣の免疫蛍光検出を使用する利点は、病巣の時間的および空間的分布の特性評価、および他のタンパク質との共染色です。さらに、免疫蛍光法は溶解を必要としないため、細胞のコンテキスト情報を保持し、より有益な情報を得ることができます。また、γ-H2AXは de novoで形成されるため、DNA損傷がないと豊富に存在せず、特異的な^{マーカー7}となる。

H2AXは、主にプロテインキナーゼ運動失調-毛細血管拡張症変異(ATM)およびDNA依存性プロテインキナーゼ(DNA-PK)によってリン酸化されます。Ku70/80(XRCC6 X線修復交差補完6/XRCC5 X線修復交差補完5)およびDNA-プロテインキナーゼ触媒サブユニット(DNA-PKcs)は、DSBの同定とDNA末端の保護に関与していますが、ArtemisはXRCC4-リガーゼIV複合体によるライゲーションを促進するために末端処理を行います。DSBに隣接する部位でのH2AXのリン酸化は、いくつかの修復タンパク質の動員および細胞周期の停止、死、または生存のためのシグナル伝達のシグナルとして作用^する8。

y-H2AX病巣の変化の解析は、目的のタンパク質がDNA損傷応答に関与しているかどうかを研究するための最も一般的なアッセイです。DNA損傷部位における直接的な役割が予想されるかどうかにかかわらず、蛍光顕微鏡法を使用して、目的のタンパク質とy-H2AX病巣との共局在を確認します。しかし、新しい超解像蛍光法を除けば、DNA損傷部位との局所的な相互作用を結論付けるのは難しい場合があります。さらに、免疫蛍光検出は通常、DNA損傷部位の多くのタンパク質分子に依存しているため、希少なタンパク質を同定することは困難である⁹。

ここでは、y-H2AXを損傷部位のマーカーとして、DDR経路に関与するタンパク質の局在を評価するアッセイを示します。このアッセイは、DNA損傷を引き起こすさまざまな傷害下での時間的局在を特徴付けるために使用できます。

近接リガンドアッセイ(PLA)は、タンパク質間の相互作用、ならびにオルガネラまたは細胞構造間の空間的近接性を推定するためのツールとして登場しました^10,11そして、例えば、ストレス条件下での時間的局在および共局在分析を可能にします。この方法は、従来の免疫蛍光法と同様に、ミトコンドリア、小胞体、PML体、DNA二本鎖マーカーyH2AXなどのオルガネラまたは細胞構造特異的マーカーの同時染色を可能にするため、簡単です。PLAを使用すると、DNA損傷時のタンパク質相互作用を高感度、特異性、信頼性の高い方法で同定でき、細胞周期中の相互作用、さまざまな刺激に対する応答、および遺伝毒性ストレス後のさまざまなタイミングでの相互作用のモニタリングに使用できます。

ここでは、従来のγ-H2AX免疫蛍光法と併用して、エトポシドによるDNA損傷後のNek4-Ku70相互作用を局在化するためのPLAの使用を示します。Nek4は、Nek(NIMA関連キナーゼ)ファミリーの一員であり、DNA損傷応答に明確な役割を果たしていません。2012年、Nguyenらは、Nek4がKu70/Ku80タンパク質と相互作用し、Nek4が存在しないと、これらのタンパク質はDNA損傷部位に動員されず、H2AXリン酸化が損なわれることを示しました¹²。この相互作用の細胞局在は、これまでのところ不明です。Nek4キナーゼ死変異体¹³を発現する細胞ではKu70のリン酸化の減少が観察されていますが、Nek4が直接Ku70をリン酸化するかどうかはまだ解明されていません。免疫沈降研究¹²によると、Nek4とKu70との相互作用がエトポシド処理後に増加することを考慮して、PLAとγ-H2AXマーカーを使用してこの相互作用を局在化しようとします。

通常、相互作用研究は免疫沈降アッセイに基づいていますが、これらは in vitro であり、相互作用の位置に関する情報は提供されません。可能であれば、分画細胞(核、ミトコンドリア、細胞膜、または細胞質ゾル)の免疫沈降を行うことができますが、相互作用の経時的な経過を行うには費用と手間がかかります。免疫蛍光法は、タンパク質の細胞内局在に関する情報を得ることができますが、相互作用の証明は困難であり、顕微鏡の分解能に依存します。ここでは、近接リガンドアッセイを使用して、DNA損傷の状況で2つのタンパク質の相互作用をモニターする利点を示します。

プロトコル

1. セルめっき

注:細胞は、顕微鏡の蛍光スライド、チャンバー、またはプレートに播種することができます。複数の条件や予備の試薬の試験には、小さなカバースリップまたは96/384ウェルプレートの使用をお勧めします。HEK293細胞のように簡単に剥離する細胞株には、カバースリップの使用が推奨されます。カバーガラスは、アタッチメントを改善するために、事前にポリ-L-リジン溶液でコーティングすることができます。

1. ビークル、技術的制御、および生物学的制御を考慮したプレートセル。条件ごとに2つまたは3つのウェルでテクニカルレプリケートを使用します。
   注: テクニカル コントロール (セカンダリと 1 つのプライマリのみ) の使用は必須です。可能であれば、生物学的コントロールも含めるべきです(例えば、標的タンパク質の1つの過剰発現またはノックダウン、または相互作用を変化させることが知られている状態など)。
   1. 10%のウシ胎児血清(FBS)、4.5 g/Lグルコース、および4 mMのL-グルタミンを添加したダルベッコのModified Eagle Medium(DMEM)でU2OS細胞を、5%_CO2 および90%の空気を含む加湿雰囲気で37°Cの組織培養処理プレート上で培養します。テストする条件の数に応じて、384または60 mmプレートのカバースリップを使用する場合は、それぞれ60 mmまたは100 mmプレートから開始します。
   2. 細胞が60%〜70%のコンフルエント度に達したら、0.25%トリプシン-^{EDTAを使用して細胞を分割します14}。ノイバウアーチャンバーまたは自動カウンターを使用して細胞をカウントします¹⁴.384ウェルプレートに複数の13 mm丸型カバースリップまたはウェルあたり4 x 10⁵セルを含む60 mmプレートに4 x 10⁵細胞をプレートし、加湿した5% CO₂インキュベーターで37°Cで12〜24時間インキュベートします。

2. 溶液の調製

注:治療の濃度と時間は、DNA損傷修復経路^15,16の活性化を指摘する文献結果に基づいて選択されました。

1. エトポシドの原液を50 mM濃度のDMSOで調製します。ストック溶液は-20°Cで数ヶ月間保持できます。エトポシド溶液を全培地で使用するために、最終濃度25 μMで希釈します。ビヒクル制御として、完全培地で0.05%希釈したDMSOを使用します。
2. 20倍生理食塩水クエン酸ナトリウム(SSC;3.0 M NaCl、0.30 Mクエン酸三ナトリウムpH 7.0)を調製します。この溶液は、4°Cで数ヶ月間保持できます。

3. 細胞の治療と固定

注:細胞を乾燥させないでください。前の解決策をできるだけ活用してみてください。細胞固定の適切な方法(氷冷メタノールまたは4%パラホルムアルデヒド(PFA))は、従来の免疫蛍光実験を使用して抗体の希釈と同様に、事前に決定する必要があります。

注意:メタノールは適切に廃棄する必要があります。

1. 培地をウェルから取り出し、エトポシドまたはDMSOを含む培地をそれぞれ25 μMまたは0.05%で加えます。細胞を5% CO₂ で37°Cでインキュベートし、90%の空気を含む加湿雰囲気でエトポシドまたはDMSOと3つの異なる時間(20分、1時間、3時間)インキュベートします。384プレートを使用する場合、すべての条件を同時に固定する必要があります。
   1. このためには、3時間など、最も長い治療時間で状態を治療することから始めます。2時間後、1時間の治療条件を治療し、固定のために20分が残ったら、20分の状態を治療します。これにより、すべての条件を同時に修正することができます。
2. 培地をウェルから取り出し、細胞をPBS 3xで洗浄します。
3. ウェル表面を覆うのに十分な量の氷冷メタノールを加えて細胞を固定します。-20°Cで10分間インキュベートします。 PBS3xでウェルを洗います。
   注:この時点で、プロトコルを一時停止できます。プレートは4°Cで1週間保存できます。

4.透過化とブロッキング

注:PFA固定法を使用する場合は、透過処理の前にグリシンでブロッキングするステップを実行する必要があります。インキュベーター内にウォーターパンを置くことで湿度チャンバーを準備でき、湿度は約95%になります。384プレートまたはスライドは、濾紙または湿らせたスポンジと透明フィルムの上の密閉プラスチック容器でインキュベートできます。

1. サンプルからPBSをタップします。
2. 30-40 μLの透過化バッファー(0.2% Triton X-100 in PBS)を添加し、室温で20分間インキュベートします。PBSで3回洗う
3. サンプルからPBSを取り出し、PLAキットに含まれている30〜40μLの1xブロッキング溶液(または、PBS溶液中の3%のウシ血清アルブミンおよびTriton X-100 0.1%を使用することができます)を各ウェル/カバースリップに加えます。
4. 予熱した湿度チャンバー内で37°Cでプレートを1時間インキュベートします。

5. 一次抗体インキュベーション(PLA)

注:カバースリップを使用する場合は、抗体溶液がすべてのカバースリップ表面を覆っていることを確認することが重要です。抗体の選択には特に注意を払う必要があります。抗体は異なる動物種に由来するものでなければならず、γ-H2AXに使用される二次抗体は、PLAプローブ産生の種宿主に対するものであってはなりません。例えば、PLAに用いた一次抗体は、マウスやヤギの動物で産生されました。人民解放軍のプローブ、対マウス、および対ヤギはロバで製造されました。γ-H2AXに対する抗体はウサギで産生され、二次的に利用されたのはロバで産生された抗ウサギです。この方法では、セカンダリは PLA プローブを認識しません。

1. 一次抗体(マウス抗Ku70 1:100、ヤギ抗Nek4 1:50、ウサギ抗Nek5 1:25、マウス抗TOPIIβ 1:25)をキット付属の抗体希釈液で希釈します(あるいは、ウシ血清アルブミン3%、トリトンX-100 0.1%のPBS溶液を使用することができます)。カバースリップを使用する場合は条件ごとに30 μL、384ウェルプレートを使用する場合はウェルごとに20 μLの抗体溶液を調製します。
2. ブロッキングソリューションをタップします。一次抗体溶液を各ウェルに添加します。4°Cで一晩、湿度チャンバー内でインキュベートします。

6. PLAプローブのインキュベーション

注:プローブは、一次抗体だけでなく、免疫蛍光ステップで使用することを目的とした抗体も考慮して選択してください。384ウェルプレートを37°Cの長時間インキュベーションに使用する場合、低速回転を使用して抗体溶液の分布を改善することができます。

1. マイナスプローブとプラスプローブを抗体希釈液で1:5に希釈します。384ウェルプレートを使用する場合はウェルあたり10 μL、カバースリップを使用する場合はサンプルあたり20 μLを調製します。次の組み合わせを利用します:ロバアンチマウスマイナスとドンキーアンチヤギプラス。ドンキーアンチマウスマイナスとドンキーアンチウサギプラス。
2. 一次抗体溶液をタップオフします。TBS-T(50 mM Tris pH 7.5、150 mM NaCl、Tween-20の0.05%)で1回洗浄します。TBS-Tを室温で各5分間3回洗浄します。TBS-Tで追加洗濯を行ってください。
3. プレートに10 μL、カバースリップに20 μLのPLAプローブ溶液をタップオフして追加します。予熱した湿度チャンバーで37°Cで1時間インキュベートします。

7. ライゲーション

注:リガーゼの追加は、サンプルに追加する直前まで待ってください。リガーゼはフリーザーブロック(-20°C)に保管する必要があります。リガーゼ溶液を追加する前に、すべての洗浄液を完全に取り除いてください。溶液を長期間放置して細胞を放置することは避けてください。37°Cインキュベーションに384ウェルプレートを使用する場合、低速回転を使用して抗体溶液の分布を改善することができます。

1. 5xライゲーションバッファーを高純度の水で希釈します。384ウェルプレートを使用する場合はウェルあたり10 μLを調製し、カバースリップを使用する場合は20 μLを調製します。
2. PLAプローブ溶液をタップします。TBS-Tで1回洗ってください。続いて、TBS-Tを使用して、それぞれ5分間の3回の追加洗浄を行います。最後に洗って、次のステップの前にTBS-Tをタップしてください。
3. リガーゼを1x Ligation溶液に1:40で追加し、サンプルに適用する直前に行ってください。予熱した湿度チャンバーで37°Cで30分から1時間インキュベートします。

8. 増幅と洗浄

注:ポリメラーゼの添加は、サンプルに添加する直前までお待ちください。増幅バッファーは光に敏感です。バッファーを含むすべての溶液を光から保護します。ポリメラーゼはフリーザーブロック(-20°C)に保管する必要があります。溶液を長期間放置して細胞を放置することは避けてください。384ウェルプレートを37°Cインキュベーションに使用する場合、ゆっくりとした回転で抗体溶液の分布を改善することができます。

1. ポリメラーゼ溶液を添加する前に、すべての洗浄液を完全に取り除いてください。溶液を長期間放置して細胞を放置することは避けてください。5倍増幅バッファーを高純度の水で希釈します。384ウェルプレートを使用する場合はウェルあたり10 μLを調製し、カバースリップを使用する場合は20 μLを調製します。
2. ライゲーション溶液をタップします。TBS-Tで1回洗ってください。続いて、TBS-Tを使用して、それぞれ5分間の3回の追加洗浄を行います。最後に洗って、次のステップの前にTBS-Tをタップしてください。
3. ポリメラーゼを1:80希釈で1x増幅溶液に加え、サンプルにアプライドする直前に行ってください。予熱した湿度チャンバーで37°Cで100分間インキュベートします。
   注:この手順以降は、直接光が当たることを避けてください
4. 増幅バッファーをタップします。1x SSCバッファーで2回、各10分間洗浄します。0.01x SSCバッファーで2回、各2分間洗浄します。

9. γ-H2AX染色(免疫蛍光法 - IF)

注:γ-H2AXのラベリングは、PLAが終了した後に実行されます。

1. 一次抗体インキュベーション(IF)
   1. 一次抗体(ウサギ抗yH2AX)をブロッキング溶液で希釈します(あるいは、3%のウシ血清アルブミンおよびトリトンX-100の0.1%PBS溶液を使用することができます)。カバースリップを使用する場合はウェルあたり30 μL、384ウェルプレートを使用する場合は20 μLの抗体溶液を調製します。
   2. 0.01x SSC溶液をタップします。PBSで2回洗ってください。
   3. 一次抗体溶液を各ウェルに添加します。室温で1時間インキュベートします。
2. 二次抗体インキュベーション(IF)
   注:選択した二次抗体がPLA抗体またはプローブを認識しないことを確認してください。また、二次抗体の波長はPLA検出試薬の波長と異なる必要があります。例えば、当社のPLA検出試薬には蛍光色素647が含まれており、γ-H2AX検出に使用した二次試薬は488です。
   1. 二次抗体(Donkey anti-Rabbit Alexa Fluor 488)をブロッキング溶液(あるいは、3%のウシ血清アルブミンおよびTriton X-100 0.1%のPBS溶液を使用可能)で1:300希釈します。カバースリップを使用する場合は条件ごとに30 μL、384ウェルプレートを使用する場合はウェルごとに20 μLの抗体溶液を調製します。Hoechst 33342色素を最終濃度0.6 μg/mLで添加します。
   2. 一次抗体溶液をタップオフします。TBS-Tで3回洗ってください。
   3. 二次抗体溶液を各ウェルに加えます。室温で20分間インキュベートします。
   4. TBS-Tで5回洗ってください。1x SSCバッファーで2x洗浄します。0.01x SSCバッファーで2x洗浄します。
      注:この時点で、プレートは光から保護された4°C(SSC 0.01X)で数週間保存できます。カバースリップを使用する場合はスライドを取り付け、1日後にスライドを-20°Cで保存することができます。

10. 画像取得

1. 従来の蛍光顕微鏡と63倍対物レンズを使用します。ネガティブコントロールとポジティブコントロールを比較して露出時間を決定し、飽和やドットの崩壊を防ぎます。
   注:共焦点顕微鏡を使用すると、PLAドット検出が強化されます。20倍対物レンズは、検出される核の数を増やすためにも使用できます。
2. 展示時間が調整されたら、同じパラメータでPLAドットのすべての取得を実行します。異なるウェルまたはカバースリップ領域から画像を取得するようにして、不均質なインキュベーションによるアーティファクトを回避してください。
3. すべてのチャンネルを同じ名前パターンで保存します。顕微鏡がチャンネルで別々に写真を撮る場合は、対応する画像を同じ名前で保存し、ファイル名の先頭にPLAまたはNucleusのみを追加してチャンネルを区別します。

11. 画像解析

注:マクロは、画像J / FIJI¹⁷ の核あたりのドットの分析と、スケール情報を手動で追加する必要がある顕微鏡で使用するために作成されました。使用する対物レンズのピクセルサイズがわかっている必要があります。各チャンネルの画像を異なるフォルダに配置します(補足コーディングファイル1、補足図1)。
注:マクロでは、個別に取得された蛍光チャネルを考慮します。この場合、すべての画像を同じ名前で保存することが重要です。

1. このマクロでは、フィールド内の特定の領域を選択できます。[ ROI の選択 ] オプションを使用する (画像内の領域に、分析に悪影響を及ぼす可能性のあるアーティファクトが示されている場合)。分析の開始時にROIを選択し、すべての画像に使用します。
   注: これはオプション機能です。選択しない場合、画像全体が分析で考慮されます(補足図2)。
2. ROI ファイルは、以下で説明するように、マクロを使用する前に作成する必要があります。ROI を選択するには、四角形ツールを使用して分析する領域を選択し、[選択の編集] >> [マネージャーに追加] をクリックして ROI マネージャーに追加します。ROI を保存するには、[More] > [Save] をクリックします。
3. ImageJ ¹⁷では、さまざまな条件の画像を開いて、分析用のパラメータを調整します。これらのパラメーターは、ユーザーが決定し、データとともにマクロ・プログラム (補足コーディング・ファイル 1) で指定する必要があります
   1. 背景の補正: 背景を削除するには、[ 処理] > [背景の減算] をクリックします。プレビュー機能を使用して、さまざまな転がりボール半径をテストします)。PLAドットにはローリング10を、原子核にはローリング100を使用しました。
   2. ノイズを除去するには、「プロセス」>「ノイズ」>スペックル除去をクリックします。核の場合は、関数 smooth を使用して、Process>Smooth をクリックして核の充填を改善します。
   3. しきい値の調整:8ビット画像に変換し、[Image (画像)] > [Type > 8 bit] (8 ビット画像> [Adjust >Threshold] (しきい値の調整) をクリックしてしきい値を調整します。それに応じてしきい値を調整して、画像に存在するすべての核またはドットを視覚化しますが、過度の飽和や構造の崩壊を回避します。値をメモし、さまざまな画像でテストして、しきい値が異なる画像で機能するかどうかを確認します。
   4. [処理] > [バイナリ] > [マスクに変換] をクリックして、マスクに変換します。核の場合は、[Process > Binary > Fill holes] をクリックし、[Process >of Binary > Watershed] をクリックします。PLA ドットの場合は、[Process] > [Binary > Watershed] をクリックします。
   5. 核を数えるには、さまざまな核の面積または長さを測定して、平均サイズを推定します。近似値を使用して粒子を解析します。「解析」>「粒子を解析」をクリックし、「サイズを設定: 15-無限大」を選択します (これらの値は原子核のサイズによって異なります)。次のオプションをオンにします: 表示: マスク;結果を表示します。明確な結果。要約;マネージャーに追加;エッジで除外します。
   6. PLAドットをカウントするには、ドットの面積または半径を測定して平均サイズを推定します。 Apply Nucleus Mask (Apply MaskはGDSCプラグイン上の機能ですので、インストールされているか確認してください)を選択し、 Analyze>Analyzeパーティクルを設定して設定します。0.02-3 (これらの値は原子核のサイズによって異なります)。次のオプションをオンにします: 表示: マスク;結果を表示します。明確な結果。要約;マネージャーに追加;エッジで除外します。
4. 結果は、画像に存在する各核の核あたりのドット数を示しています。このデータを保存します。

12. 結合された画像の視覚化

1. PLA、nucleus、γ-H2AXに対応するチャンネルを開きます。すべての画像について、手順 11.4.1 と 11.4.2 で説明したように、背景を差し引き、ノイズを除去します。
2. 明るさとコントラストを自動または手動で調整し、同じチャンネルのすべての条件で同じ値を使用します。 [画像] > [明るさ/コントラスト] >調整] を選択します。
3. 画像を結合(結合)するには、「画像」>「カラー」>「チャネルを結合」を選択します。スケール バーを追加するには、[分析] > [ツール] > [スケール バー] を選択します。名前を付けて保存。TIFF ファイル。

結果

エトポシド処理をしていない状態でNek4-Ku70の相互作用が観察されています。ただし、この相互作用は原子核の外側で発生する可能性があります(図1A)。Nek4-Ku70相互作用はDNA損傷後に増加し、核に集中します(図1A)。Nek5-トポイソメラーゼII β(TOPIIβ)相互作用の場合、文献結果¹⁸に基づくポジティブコントロー?...

ディスカッション

このデータは、DNA損傷マーカーにPLAを併用すると、DNA損傷応答プロファイリングで最も多くの情報を提供できることを示しており、傷害後の相互作用の空間的および時間的挙動を示しています。PLAは、二量体化の同定、オルガネラの接触決定、タンパク質-核酸相互作用、および主にタンパク質-タンパク質相互作用10,11,19,20に使用されてきた汎用性の高い方法です。

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Black 384-well plates	Perkin Elmer Cell carrier plates
Donkey  anti- Rabbit Alexa Fluor 488	Invitrogen	A21206	1:300
Duo link Donkey anti Mouse Minus	Sigma	DUO92004
Duolink antibody diluent	Sigma	DUO82008
Duolink blocking solution 1X	Sigma	DUO82007
Duolink Detection reagent Far red	Sigma	DUO92013
Duolink Donkey anti goat plus	Sigma	DUO92003
Duolink Donkey anti rabbit plus	Sigma	DUO92002
Etoposide	Sigma	E1383
Goat anti Nek4	Santa Cruz Biotechnology	SC-5517	goat anti Nek4 was used at 1:50 dilution
Hoechst 33342	Thermo	H1399	0.6 µg/mL
Leica DMI microscope	Leica
Mouse anti Ku70	Thermo	MA5-13110	mouse anti Ku70 was used at 1:100 dilution
Mouse anti TOPIIβ	Santa Cruz Biotechnology	SC-365071	1:25
Rabbit anti Nek5	Santa Cruz Biotechnology	SC-84527	1:25
Rabbit anti Y H2AX	Cell Signalling	9718S	1:100 dilution
U2OS cell line	ATCC	HTB-96