邻位配体检测，用于定位 DNA 损伤位点的蛋白质

摘要

在这里，我们提出了一种简单快速的方案，用于检测 DNA 损伤位点的蛋白质相互作用。

摘要

DNA 损伤反应是一种遗传信息保护机制，可保护细胞免受受损 DNA 的延续。在此过程中合作的蛋白质的表征允许确定多种疾病治疗干预的替代靶标，例如癌症、衰老相关疾病和慢性炎症。邻位配体测定 （PLA） 作为一种估计蛋白质之间相互作用以及细胞器或细胞结构之间的空间接近度的工具出现，例如，允许在压力条件下进行时间定位和共定位分析。该方法很简单，因为它类似于传统的免疫荧光，允许同时对细胞器、细胞结构或特定标记物（如线粒体、内质网、PML 小体或 DNA 双链标记物 yH2AX）进行染色。S139 在组蛋白 2A 变体 H2AX 位点的磷酸化，当时称为 yH2AX，被广泛用作 DNA 双链断裂的非常敏感和特异性的标志物。yH2AX 染色的每个病灶对应于损伤后几分钟发生的一次 DNA 断裂。分析 yH2AX 病灶的变化是研究目标蛋白质是否与 DNA 损伤反应 （DDR） 有关的最常用检测方法。无论预期是否在 DNA 损伤位点中起直接作用，荧光显微镜用于验证目标蛋白质与 yH2AX 病灶的共定位。然而，总的来说，除了新的超分辨率荧光方法外，与 DNA 损伤位点的局部相互作用可能有点主观。在这里，我们展示了一种使用 yH2AX 作为损伤部位标志物来评估蛋白质在 DDR 通路中定位的测定法。该测定可用于表征导致 DNA 损伤的不同损伤下的时间定位。

引言

由于自发的化学反应，细胞 DNA 损伤每天都在发生，并且遗传毒性因子（辐射和化学物质，如依托泊苷）和氧化应激等外源性因素也会增加^{DNA 损伤 1,2,3}。这些细胞具有复杂的机制，可以纠正无数不同类型的 DNA 损伤，从去除碱基到复制性叉扭转或中断，再到最有害的损伤：DNA 双链断裂 ^4,5。

参与 DDR 的几种蛋白质已经被表征，出色的修订版探索了非同源末端连接 （NHEJ） 和同源重组 （HR） 的途径，这是双链断裂 （DSB） 修复中隐含的主要途径 ^5,6。组蛋白 H2A 变体 H2AX 在丝氨酸 139 位点的磷酸化（此后称为 y-H2AX）多年来一直被用作双链断裂的敏感可靠标志物。在损伤后的最初几分钟内观察到 H2AX 的磷酸化，并且可以持续数小时⁷。

使用 γ-H2AX 病灶免疫荧光检测的优势在于表征病灶的时间和空间分布，以及它与其他蛋白质的共染色。此外，免疫荧光不需要裂解，这保留了细胞环境信息并使其信息量更大。此外，由于 γ-H2AX 是从 头形成的，因此在没有 DNA 损伤的情况下它并不丰富，使其成为特异性标记⁷。

H2AX 主要被 DSB 的传感器蛋白激酶共济失调-毛细血管扩张症突变 （ATM） 和 DNA 依赖性蛋白激酶 （DNA-PK） 磷酸化。Ku70/80 （XRCC6 X 射线修复交叉互补 6/ XRCC5 X 射线修复交叉互补 5） 和 DNA-蛋白激酶催化亚基 （DNA-PKcs） 负责 DSB 鉴定和 DNA 末端保护，而 Artemis 进行末端加工以促进 XRCC4-连接酶 IV 复合物的连接。H2AX 在 DSB 侧翼位点的磷酸化是募集多种修复蛋白的信号，也是细胞周期停滞、死亡或存活信号转导的信号⁸。

分析 y-H2AX 病灶的变化是研究目标蛋白质是否与 DNA 损伤反应有关的最常用检测方法。无论预期是否在 DNA 损伤位点中起直接作用，荧光显微镜用于验证目标蛋白质与 y-H2AX 病灶的共定位。然而，除了新的超分辨率荧光方法外，得出与 DNA 损伤位点的局部相互作用结论可能很棘手。此外，免疫荧光检测通常依赖于 DNA 损伤位点的许多蛋白质分子，因此难以识别稀缺蛋白质⁹。

在这里，我们展示了一种使用 y-H2AX 作为损伤部位标志物来评估参与 DDR 通路的蛋白质定位的测定法。该测定可用于表征导致 DNA 损伤的不同损伤下的时间定位。

邻位配体测定 （PLA） 作为一种工具出现，用于估计蛋白质之间的相互作用以及细胞器或细胞结构之间的空间接近度^10,11，^并允许在压力条件下进行时间定位和共定位分析。该方法很简单，因为它类似于传统的免疫荧光，允许同时对细胞器或细胞结构特异性标记物进行染色，例如线粒体、内质网、PML 小体或 DNA 双链标记物 yH2AX。使用 PLA 可以以灵敏、特异性和可靠的方式识别 DNA 损伤过程中的蛋白质相互作用，可用于监测细胞周期期间、响应不同刺激以及遗传毒性应激后不同时间的相互作用。

我们在这里展示了 PLA 与传统 γ-H2AX 免疫荧光一起使用，以定位依托泊苷诱导的 DNA 损伤后 Nek4-Ku70 相互作用。Nek4 是 Nek（NIMA 相关激酶）家族成员，在 DNA 损伤反应中没有明确的作用。2012 年，Nguyen 及其同事表明，Nek4 与 Ku70/Ku80 蛋白相互作用，在 Nek4 缺失的情况下，这些蛋白不会被募集到 DNA 损伤位点，并且 H2AX 磷酸化受损¹²。到目前为止，这种相互作用的细胞定位尚不清楚。我们已经观察到在表达 Nek4 激酶死亡突变体¹³的细胞中 Ku70 磷酸化减少，但 Nek4 是否直接磷酸化 Ku70 仍有待阐明。考虑到根据免疫沉淀研究¹² 依托泊苷处理后 Nek4 与 Ku70 的相互作用增加，我们尝试使用 PLA 和 γ-H2AX 标记定位这种相互作用。

通常，相互作用研究基于免疫沉淀测定，但这些是在 体外 进行的，不提供有关相互作用位置的信息。在可能的情况下，可以对分级细胞（细胞核、线粒体、细胞膜或胞质溶胶）进行免疫沉淀，但执行相互作用的时间过程既昂贵又费力。免疫荧光可以提供有关蛋白质细胞定位的信息，但证明相互作用可能很困难，并且取决于显微镜的分辨率。在这里，我们展示了使用 Proximity Ligand Assay 监测两种蛋白质在 DNA 损伤背景下相互作用的优势。

研究方案

1. 电池铺板

注：细胞可以接种在显微镜荧光载玻片、腔室或板中。建议使用小盖玻片或 96/384 孔板来测试多种条件和备用试剂。对于容易分离的细胞系（如 HEK293 细胞），建议使用盖玻片。盖玻片可以事先涂有聚-L-赖氨酸溶液以改善附着。

1. 考虑载体、技术控制和生物控制的板细胞。每种条件在 2 或 3 个孔中使用技术重复。
   注意：必须使用技术控制（包括辅助控制和控制仅一个主要控制控制）。如果可能，还应包括生物控制（例如，一种靶蛋白的过表达或敲低或已知会改变相互作用的条件）。
   1. 在补充有 10% 胎牛血清 （FBS）、4.5 g/L 葡萄糖和 4 mM L-谷氨酰胺的 Dulbecco 改良 Eagle 培养基 （DMEM） 中培养 U2OS 细胞，在 37 °C、5% CO₂ 和含有 90% 空气的潮湿气氛中。根据要测试的条件数量以及是否在 60 mm 板上使用 384 或盖玻片，请分别从 60 mm 或 100 mm 板开始。
   2. 当细胞达到 60%-70% 汇合时，使用 0.25% 胰蛋白酶-EDTA ¹⁴ 分流细胞。使用 Neubauer 腔室或自动计数器¹⁴ 对细胞进行计数。在含有多个 13 mm 圆形盖玻片的 60 mm 板中接种 4 x 10⁵ 个细胞，或在 384 孔板中每孔接种 4 x 10⁵ 个细胞，并在 37 °C 下在加湿的 5% CO₂ 培养箱中孵育 12 - 24 小时。

2. 溶液的制备

注意：治疗的浓度和时间是根据文献结果选择的，文献结果指出了 DNA 损伤修复途径的激活^15,16。

1. 在 DMSO 中制备 50 mM 浓度的依托泊苷储备溶液。储备溶液可在 -20 °C 下保存数月。稀释依托泊苷溶液，用于终浓度为 25 μM 的完全培养基中。使用在完全培养基中稀释的 0.05% DMSO 作为载体对照。
2. 制备 20x 盐水柠檬酸钠（SSC;3.0 M NaCl，0.30 M 柠檬酸三钠 pH 7.0）。该溶液可在 4 °C 下保存数月。

3. 细胞处理和固定

注意：任何时候都不要让细胞干燥;尝试尽可能多地利用前面的解决方案。必须事先使用常规免疫荧光实验确定适当的细胞固定方法（冰冷的甲醇或 4% 多聚甲醛 （PFA））以及抗体稀释度。

注意：甲醇必须妥善处理。

1. 从孔中取出培养基，并分别加入含有 25 μM 或 0.05% 依托泊苷或 DMSO 的培养基。将细胞在 37 °C 的 5% CO₂ 和含有 90% 空气的潮湿气氛中与依托泊苷或 DMSO 一起孵育 3 个不同的时间段：20 分钟、1 小时和 3 小时。使用 384 板时，必须同时固定所有条件。
   1. 为此，首先用最长的治疗时间（例如 3 小时）治疗病症。2 小时后，处理 1 小时的处理条件，当还剩 20 分钟固定时，处理 20 分钟的条件。在此之后，可以同时修复所有条件。
2. 从孔中取出培养基，用 PBS 3x 洗涤细胞。
3. 通过添加冰冷的甲醇来固定细胞，其体积足以覆盖孔表面。在 -20 °C 下孵育 10 分钟。 用 PBS 3x 洗涤孔。
   注意：此时，可以暂停协议。板可以在 4 °C 下储存 1 周。

4. 透化和封闭

注：如果使用 PFA 固定方法，则必须在透化之前执行甘氨酸封闭步骤。可以通过在培养箱内放置水盘来准备湿度箱，从而产生大约 95% 的湿度。384 板或玻片可以在滤纸或湿海绵和透明薄膜上方的密闭塑料容器中孵育。

1. 从样品中敲掉 PBS。
2. 加入 30-40 μL 透化缓冲液（PBS 中的 0.2% Triton X-100）并在室温下孵育 20 分钟。用 PBS 洗涤 3 次
3. 从样品中敲掉 PBS，并向每个孔/盖玻片中加入 30-40 μL PLA 试剂盒中提供的 1x 封闭溶液（或者，可以使用 3% 的牛血清白蛋白和 0.1% 的 Triton X-100 PBS 溶液溶液）。
4. 将板在 37 °C 的预热湿度室中孵育 1 小时。

5. 一抗孵育 （PLA）

注：如果使用盖玻片，请务必确保抗体溶液覆盖所有盖玻片表面。必须特别注意抗体的选择。抗体必须来自不同的动物物种，并且用于 γ-H2AX 的二抗不得针对 PLA 探针生产的物种宿主。例如，用于 PLA 的一抗是在小鼠和山羊动物中产生的。PLA 探针、抗小鼠和抗山羊是在驴中产生的。抗 γ-H2AX 抗体在兔子中产生，二次利用的抗兔抗体是在驴中产生。这样，辅助设备将无法识别 PLA 探针。

1. 在试剂盒中提供的抗体稀释剂中稀释一抗（小鼠抗 Ku70 1：100 和山羊抗 Nek4 1：50;兔抗 Nek5 1：25 和小鼠抗 TOPIIβ 1：25）（或者，可以使用 3% 的牛血清白蛋白和 Triton X-100 0.1% 的 PBS 溶液）。如果使用盖玻片，则每个条件准备 30 μL 抗体溶液，如果使用 384 孔板，则每孔准备 20 μL。
2. 点击阻塞解决方案。向每个孔中加入一抗溶液。在 4 °C 下在湿度室中孵育过夜。

6. PLA 探针孵育

注：选择探针时，不仅要考虑一抗，还要考虑用于免疫荧光步骤的抗体。当使用 384 孔板进行 37 °C 长时间孵育时，可采用缓慢旋转来改善抗体溶液的分布。

1. 在抗体稀释剂中以 1：5 的比例稀释 minus 和 plus 探针。如果使用 384 孔板，每孔准备 10 μL，如果使用盖玻片，则每个样品准备 20 μL。使用以下组合：驴防鼠减号与驴防山羊加号;驴防鼠减号与驴防兔加号。
2. 轻弹一抗溶液。用 TBS-T（50 mM Tris pH 7.5,150 mM NaCl，0.05% 的吐温-20）洗涤 1 次。在室温下用 TBS-T 洗涤 3 次，每次 5 分钟。用 TBS-T 进行额外的洗涤。
3. 轻弹并加入 PLA 探针溶液，其中 10 μL 用于板，20 μL 用于盖玻片。在 37 °C 的预热湿度室中孵育 1 小时。

7. 结扎

注：请等到将其添加到样品中之前再添加连接酶。连接酶必须保存在冷冻块 （-20 °C） 中。在加入连接酶溶液之前，完全去除所有洗涤液。避免让细胞长时间没有溶液。当使用 384 孔板进行 37 °C 孵育时，可以使用缓慢旋转来改善抗体溶液的分布。

1. 用高纯水稀释 5x 连接缓冲液。如果使用 384 孔板，每孔准备 10 μL，如果使用盖玻片，则每孔准备 20 μL。
2. 轻敲 PLA 探针解决方案。用 TBS-T 洗涤 1 次。然后使用 TBS-T 再洗涤 3 次，每次持续 5 分钟。最后一次清洗并在下一步之前敲掉 TBS-T。
3. 在 1：40 的 1x 连接溶液中加入连接酶，然后立即将其应用于样品中。在预热的湿度室中于 37 °C 孵育 30 分钟至 1 小时。

8. 放大和洗涤

注：请等到添加到样品中之前再添加聚合酶。扩增缓冲液对光敏感;保护所有含有缓冲液的溶液避光。聚合酶必须保存在冷冻块 （-20 °C） 中。避免让细胞长时间没有溶液。当使用 384 孔板进行 37 °C 孵育时，缓慢旋转可以改善抗体溶液的分布。

1. 在加入聚合酶溶液之前，完全去除所有洗涤液。避免让细胞长时间没有溶液。在高纯水中稀释 5x 扩增缓冲液。如果使用 384 孔板，每孔准备 10 μL，如果使用盖玻片，则每孔准备 20 μL。
2. 轻弹连接溶液。用 TBS-T 洗涤 1 次。然后使用 TBS-T 再洗涤 3 次，每次持续 5 分钟。最后一次清洗并在下一步之前敲掉 TBS-T。
3. 将聚合酶以 1：80 稀释度添加到 1x 扩增溶液中，然后立即将其应用于样品中。在预热的湿度室中于 37 °C 孵育 100 分钟。
   注意：从此步骤开始，避免阳光直射
4. 轻敲扩增缓冲液。用 1x SSC 缓冲液洗涤 2 次，每次 10 分钟。用 0.01x SSC 缓冲液洗涤 2 次，每次 2 分钟。

9. γ-H2AX 染色（免疫荧光 - IF）

注意：γ-H2AX 的标记是在 PLA 完成后进行的。

1. 一抗孵育 （IF）
   1. 在封闭溶液中稀释一抗（兔抗 yH2AX 以 1：100 的比例稀释）（或者，可以使用 3% 的牛血清白蛋白和 0.1% 的 Triton X-100 PBS 溶液）。如果使用盖玻片，每孔准备 30 μL 抗体溶液，如果使用 384 孔板，则每孔准备 20 μL。
   2. 点击 0.01x SSC 解决方案。用 PBS 洗涤 2 次。
   3. 向每个孔中加入一抗溶液。在室温下孵育 1 小时。
2. 二抗孵育 （IF）
   注：确保所选的二抗无法识别 PLA 抗体或探针。此外，二抗的波长必须与 PLA 检测试剂的波长不同。例如：我们的 PLA 检测试剂包含荧光基团 647，我们用于 γ-H2AX 检测的二抗试剂是 488。
   1. 以 1：300 的稀释度在封闭溶液（或者，可以使用 3% 牛血清白蛋白和 Triton X - 100 0.1% 的 PBS 溶液中）稀释二抗（驴抗兔 Alexa Fluor 488）。如果使用盖玻片，则每个条件准备 30 μL 抗体溶液，如果使用 384 孔板，则每孔准备 20 μL。添加终浓度为 0.6 μg/mL 的 Hoechst 33342 染料。
   2. 轻弹一抗溶液。用 TBS-T 洗涤 3 次。
   3. 向每个孔中加入二抗溶液。在室温下孵育 20 分钟。
   4. 用 TBS-T 洗涤 5 次。用 1x SSC 缓冲液洗涤 2 次。用 0.01x SSC 缓冲液洗涤 2 次。
      注意：此时，板可以在 4 °C（SSC 0.01X）避光下储存数周。如果使用盖玻片，则可以安装载玻片，1 天后，可以将载玻片储存在 -20 °C。

10. 图像采集

1. 使用常规荧光显微镜和 63 倍物镜。通过比较阴性对照和阳性对照来确定曝光时间，以避免饱和和点折叠。
   注意：使用共聚焦显微镜增强了 PLA 点检测。20 倍物镜也可用于增加检测到的细胞核数量。
2. 调整曝光时间后，使用相同的参数执行 PLA 点的所有采集。尝试从不同的孔或盖玻片区域采集图像，以避免由于非均匀孵育而导致的伪影。
3. 保存具有相同名称模式的所有通道。如果显微镜分别在通道中拍照，请保存同名的相应图像，仅在文件名开头添加 PLA 或 Nucleus 以区分通道。

11. 图像分析

注意：创建了一个宏，用于分析图像 J/FIJI¹⁷ 中每个细胞核的点，并与必须手动添加比例信息的显微镜一起使用。所用物镜的像素大小必须已知。将每个通道的图像放在不同的文件夹中（补充编码文件 1，补充图 1）。
注：宏考虑单独获得的荧光通道。在这种情况下，保存所有具有相同名称的图像非常重要。

1. 宏允许在字段中选择特定区域。使用选项 Select a ROI when the image in the region shows of a artifacts that may be bad to analysis （当图像中的某个区域显示可能对分析有害的伪影时选择 ROI）。在分析开始时选择 ROI 并将其用于所有图像。
   注意：这是一项可选功能。如果未选择，则将在分析中考虑整个图像（补充图 2）。
2. ROI 文件应在使用宏之前创建，如下所述。对于 ROI 选择，请使用矩形工具，选择要分析的区域，然后单击 Edit > Selection（编辑选择）>Add to Manager（添加到管理器）将其添加到 ROI 管理器中。通过单击 更多> 保存.
3. 在 ImageJ ¹⁷ 中，打开来自不同条件的图像以调整分析参数。这些参数必须由用户确定，并与数据一起在宏程序中指定（补充编码文件 1）
   1. 背景校正：要删除背景，请单击 Process（处理>减去背景）。使用预览功能测试不同的滚动球半径）。我们对 PLA 点使用滚动 10，对原子核使用滚动 100。
   2. 通过单击处理 > 杂色 > 去斑.对于细胞核，使用函数 smooth 通过单击 Process（处理）>Smooth（平滑）来改善细胞核的填充。
   3. 调整阈值：转换为 8 位图像并通过 单击 图像>调整阈值 类型 > 8 位 和 图像 > 调整 >阈值.相应地调整阈值以可视化图像中存在的所有原子核或点，但避免过度饱和和结构坍缩。记下这些值并在不同的图像中进行测试，以检查阈值是否适用于不同的图像。
   4. 通过单击 “处理>二进制”>转换为掩码转换为掩码。对于核心， 请单击 Process > Binary > Fill holes ，然后单击 Process > Binary > Watershed。对于 PLA 点，请单击 Process > Binary > Watershed。
   5. 对于细胞核计数，测量不同细胞核的面积或长度以估计平均大小。使用近似值来分析粒子。单击 “分析”（Analyze）>“分析粒子”（Analyze particles）， 然后选择“ 设置大小： 15 无限远”（Set size： 15-infinity ）（这些值取决于原子核的大小）。选中以下选项：显示：蒙版;显示结果;清晰的结果;总结;添加到 Manager;在边上排除。
   6. 要计算 PLA 点，请测量点的面积或半径以估计平均大小。选择 Apply Nucleus Mask （应用遮罩是 GDSC 插件的一项功能，请检查是否已安装），然后选择 Analyze > Analyze particles 并设置。0.02-3（这些值取决于细胞核的大小）。选中以下选项：显示：蒙版;显示结果;清晰的结果;总结;添加到 Manager;在边上排除。
4. 结果显示了图像中存在的每个细胞核中每个细胞核的点数。保存此数据。

12. 可视化合并的图像

1. 打开对应于 PLA、nucleus 和 γ-H2AX 的通道。减去背景并去除杂色，如所有图像的步骤 11.4.1 和 11.4.2 中所述。
2. 自动或手动调整亮度和对比度，针对同一通道的所有条件使用相同的值。选择 图像>调整>亮度/对比度。
3. 通过选择 Image > Color > Merge channels（合并通道）来合并图像（合并）。通过选择 Analyze > Tools > Scale bar 来添加比例尺。另存为。TIFF 文件。

结果

我们已经观察到在没有依托泊苷处理的情况下 Nek4-Ku70 相互作用。然而，这种相互作用可以发生在细胞核之外（图 1A）。DNA 损伤后 Nek4-Ku70 相互作用增加，并集中在细胞核中（图 1A）。在 Nek5-拓扑异构酶 II β （TOPIIβ） 相互作用的情况下，在该测定中用作基于文献结果的阳性对照¹⁸，依托泊苷处理大大增加了?...

讨论

数据表明，将 PLA 与 DNA 损伤标记物同时使用可以在 DNA 损伤反应分析中提供最多的信息，显示损伤后相互作用的空间和时间行为。PLA 是一种通用方法，已用于二聚化鉴定、细胞器接触测定、蛋白质-核酸相互作用，主要是蛋白质-蛋白质相互作用 10,11,19,20。执行 PLA 的关键步骤?...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Black 384-well plates	Perkin Elmer Cell carrier plates
Donkey  anti- Rabbit Alexa Fluor 488	Invitrogen	A21206	1:300
Duo link Donkey anti Mouse Minus	Sigma	DUO92004
Duolink antibody diluent	Sigma	DUO82008
Duolink blocking solution 1X	Sigma	DUO82007
Duolink Detection reagent Far red	Sigma	DUO92013
Duolink Donkey anti goat plus	Sigma	DUO92003
Duolink Donkey anti rabbit plus	Sigma	DUO92002
Etoposide	Sigma	E1383
Goat anti Nek4	Santa Cruz Biotechnology	SC-5517	goat anti Nek4 was used at 1:50 dilution
Hoechst 33342	Thermo	H1399	0.6 µg/mL
Leica DMI microscope	Leica
Mouse anti Ku70	Thermo	MA5-13110	mouse anti Ku70 was used at 1:100 dilution
Mouse anti TOPIIβ	Santa Cruz Biotechnology	SC-365071	1:25
Rabbit anti Nek5	Santa Cruz Biotechnology	SC-84527	1:25
Rabbit anti Y H2AX	Cell Signalling	9718S	1:100 dilution
U2OS cell line	ATCC	HTB-96