邻位配体检测，用于定位 DNA 损伤位点的蛋白质

摘要

在这里，我们提出了一种简单快速的方案，用于检测 DNA 损伤位点的蛋白质相互作用。

摘要

DNA 损伤反应是一种遗传信息保护机制，可保护细胞免受受损 DNA 的延续。在此过程中合作的蛋白质的表征允许确定多种疾病治疗干预的替代靶标，例如癌症、衰老相关疾病和慢性炎症。邻位配体测定 （PLA） 作为一种估计蛋白质之间相互作用以及细胞器或细胞结构之间的空间接近度的工具出现，例如，允许在压力条件下进行时间定位和共定位分析。该方法很简单，因为它类似于传统的免疫荧光，允许同时对细胞器、细胞结构或特定标记物（如线粒体、内质网、PML 小体或 DNA 双链标记物 yH2AX）进行染色。S139 在组蛋白 2A 变体 H2AX 位点的磷酸化，当时称为 yH2AX，被广泛用作 DNA 双链断裂的非常敏感和特异性的标志物。yH2AX 染色的每个病灶对应于损伤后几分钟发生的一次 DNA 断裂。分析 yH2AX 病灶的变化是研究目标蛋白质是否与 DNA 损伤反应 （DDR） 有关的最常用检测方法。无论预期是否在 DNA 损伤位点中起直接作用，荧光显微镜用于验证目标蛋白质与 yH2AX 病灶的共定位。然而，总的来说，除了新的超分辨率荧光方法外，与 DNA 损伤位点的局部相互作用可能有点主观。在这里，我们展示了一种使用 yH2AX 作为损伤部位标志物来评估蛋白质在 DDR 通路中定位的测定法。该测定可用于表征导致 DNA 损伤的不同损伤下的时间定位。

引言

由于自发的化学反应，细胞 DNA 损伤每天都在发生，并且遗传毒性因子（辐射和化学物质，如依托泊苷）和氧化应激等外源性因素也会增加^{DNA 损伤 1,2,3}。这些细胞具有复杂的机制，可以纠正无数不同类型的 DNA 损伤，从去除碱基到复制性叉扭转或中断，再到最有害的损伤：DNA 双链断裂 ^4,5。

参与 DDR 的几种蛋白质已经被表征，出色的修订版探索了非同源末端连接 （NHEJ） 和同源重组 （HR） 的途径，这是双链断裂 （DSB） 修复中隐含的主要途径 ^5,6。组蛋白 H2A 变体 H2AX 在丝氨酸 139 位点的磷酸化（此后称为 y-H2AX）多年来一直被用作双链断裂的敏感可靠标志物。在损伤后的最初几分钟内观察到 H2AX 的磷酸化，并且可以持续数小时⁷。

使用 γ-H2AX 病灶免疫荧....

研究方案

1. 电池铺板

注：细胞可以接种在显微镜荧光载玻片、腔室或板中。建议使用小盖玻片或 96/384 孔板来测试多种条件和备用试剂。对于容易分离的细胞系（如 HEK293 细胞），建议使用盖玻片。盖玻片可以事先涂有聚-L-赖氨酸溶液以改善附着。

1. 考虑载体、技术控制和生物控制的板细胞。每种条件在 2 或 3 个孔中使用技术重复。
   注意：必须使用技术控制（包括辅助控制和控制仅一个主要控制控制）。如果可能，还应包括生物控制（例如，一种靶蛋白的过表达或敲低或已知会改变相互作用的条件）。
   1. 在补充有 10% 胎牛血清 （FBS）、4.5 g/L 葡萄糖和 4 mM L-谷氨酰胺的 Dulbecco 改良 Eagle 培养基 （DMEM） 中培养 U2OS 细胞，在 37 °C、5% CO₂ 和含有 90% 空气的潮湿气氛中。根据要测试的条件数量以及是否在 60 mm 板上使用 384 或盖玻片，请分别从 60 mm 或 100 mm 板开始。
   2. 当细胞达到 60%-70% 汇合时，使用 0.25% 胰蛋白酶-EDTA ¹⁴ 分流细胞。使用 Neubauer 腔室或自动计数器¹⁴ 对细胞进行计数。在含有多个 13 mm....

讨论

数据表明，将 PLA 与 DNA 损伤标记物同时使用可以在 DNA 损伤反应分析中提供最多的信息，显示损伤后相互作用的空间和时间行为。PLA 是一种通用方法，已用于二聚化鉴定、细胞器接触测定、蛋白质-核酸相互作用，主要是蛋白质-蛋白质相互作用 10,11,19,20。执行 PLA 的关键步骤?.......

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Black 384-well plates	Perkin Elmer Cell carrier plates
Donkey  anti- Rabbit Alexa Fluor 488	Invitrogen	A21206	1:300
Duo link Donkey anti Mouse Minus	Sigma	DUO92004
Duolink antibody diluent	Sigma	DUO82008
Duolink blocking solution 1X	Sigma	DUO82007
Duolink Detection reagent Far red	Sigma	DUO92013
Duolink Donkey anti goat plus	Sigma	DUO92003
Duolink Donkey anti rabbit plus	Sigma	DUO92002
Etoposide	Sigma	E1383
Goat anti Nek4	Santa Cruz Biotechnology	SC-5517	goat anti Nek4 was used at 1:50 dilution
Hoechst 33342	Thermo	H1399	0.6 µg/mL
Leica DMI microscope	Leica
Mouse anti Ku70	Thermo	MA5-13110	mouse anti Ku70 was used at 1:100 dilution
Mouse anti TOPIIβ	Santa Cruz Biotechnology	SC-365071	1:25
Rabbit anti Nek5	Santa Cruz Biotechnology	SC-84527	1:25
Rabbit anti Y H2AX	Cell Signalling	9718S	1:100 dilution
U2OS cell line	ATCC	HTB-96