Dosage des ligands de proximité pour localiser les protéines dans les sites de dommages à l’ADN

Résumé

Ici, nous présentons un protocole simple et rapide pour la détection de l’interaction protéique aux sites de dommages à l’ADN.

Résumé

La réponse aux dommages à l’ADN est une sauvegarde de l’information génétique qui protège les cellules contre la perpétuation de l’ADN endommagé. La caractérisation des protéines qui coopèrent dans ce processus permet d’identifier des cibles alternatives pour une intervention thérapeutique dans plusieurs maladies, telles que le cancer, les maladies liées au vieillissement et l’inflammation chronique. Le Proximity Ligand Assay (PLA) est apparu comme un outil pour estimer l’interaction entre les protéines ainsi que la proximité spatiale entre les organites ou les structures cellulaires et permet l’analyse de la localisation temporelle et de la co-localisation dans des conditions de stress, par exemple. La méthode est simple car elle est similaire à l’immunofluorescence conventionnelle et permet la coloration simultanée d’un organite, d’une structure cellulaire ou d’un marqueur spécifique tel que les mitochondries, le réticulum endoplasmique, les corps PML ou le marqueur double brin de l’ADN, yH2AX. La phosphorylation de la S139 au variant de l’histone 2A, H2AX, alors appelée yH2AX, est largement utilisée comme marqueur très sensible et spécifique des cassures double brin de l’ADN. Chaque foyer de coloration yH2AX correspond à une cassure de l’ADN qui se produit quelques minutes après les dommages. L’analyse des changements dans les foyers yH2AX est le test le plus courant pour étudier si la protéine d’intérêt est impliquée dans la réponse aux dommages de l’ADN (DDR). Qu’un rôle direct dans le site de lésion de l’ADN soit attendu, la microscopie à fluorescence est utilisée pour vérifier la colocalisation de la protéine d’intérêt avec les foyers yH2AX. Cependant, à l’exception des nouvelles méthodes de fluorescence à super-résolution, pour conclure, l’interaction locale avec les sites de dommages à l’ADN peut être un peu subjective. Ici, nous montrons un test pour évaluer la localisation des protéines dans la voie DDR en utilisant yH2AX comme marqueur du site de dommage. Ce test peut être utilisé pour caractériser la localisation temporelle sous différentes agressions qui causent des dommages à l’ADN.

Introduction

Les dommages à l’ADN cellulaire se produisent quotidiennement en raison des réactions chimiques spontanées et sont également augmentés par des facteurs exogènes tels que les agents génotoxiques (radiations et produits chimiques tels que l’étoposide) et le stress oxydatif ^1,2,3. Les cellules ont une machinerie complexe qui corrige une myriade de types différents de dommages à l’ADN, de l’ablation des bases à la torsion de la fourche réplicative ou à l’interruption de la lésion la plus délétère : la cassure double brin de l’ADN ^4,5.

Plusieurs protéines qui participent à la DDR ont déjà été caractérisées, et d’excellentes révisions explorent les voies de la jonction finale non homologue (NHEJ) et de la recombinaison homologue (HR), les principales voies impliquées dans la réparation des cassures double brin (DSB) ^5,6. La phosphorylation de la variante de l’histone H2A, H2AX, à la sérine 139 (nommée par la suite y-H2AX) est utilisée depuis de nombreuses années comme un marqueur sensible et fiable de la rupture double brin. La phosphorylation de H2AX est observée dans les premières minutes suivant les dommages et peut persister pendant des heures⁷.

L’avantage d’utiliser la détection par immunofluorescence des foyers γ-H2AX est la caractérisation de la distribution temporelle et spatiale des foyers, ainsi que sa co-coloration avec d’autres protéines. De plus, l’immunofluorescence ne nécessite pas de lyse, ce qui préserve les informations du contexte cellulaire et les rend plus informatives. De plus, comme γ-H2AX se forme de novo, il n’est pas abondamment présent en l’absence de dommages à l’ADN, ce qui en fait un marqueur spécifique⁷.

H2AX est principalement phosphorylé par la protéine kinase ataxie-télangiectasie mutée (ATM) et la protéine kinase dépendante de l’ADN (DNA-PK), les capteurs des DSB. Ku70/80 (XRCC6 X-ray repair cross-complementing 6/ XRCC5 X-ray repair cross-complementing 5) et la sous-unité catalytique ADN-protéine kinase (DNA-PKcs) sont responsables de l’identification des DSB et de la protection des extrémités de l’ADN, tandis qu’Artemis effectue le traitement des extrémités pour faciliter la ligature par le complexe XRCC4-Ligase IV. La phosphorylation de H2AX sur les sites flanquant les DSB agit comme un signal pour le recrutement de plusieurs protéines de réparation et une signalisation pour l’arrêt, la mort ou la survie du cycle cellulaire⁸.

L’analyse des changements dans les foyers y-H2AX est le test le plus courant pour étudier si la protéine d’intérêt est impliquée dans la réponse aux dommages de l’ADN. Qu’un rôle direct dans le site de lésion de l’ADN soit attendu, la microscopie à fluorescence est utilisée pour vérifier la co-localisation de la protéine d’intérêt avec les foyers y-H2AX. Cependant, à l’exception des nouvelles méthodes de fluorescence à super-résolution, il peut être difficile de conclure à l’interaction locale avec les sites endommagés de l’ADN. De plus, la détection par immunofluorescence dépend généralement de nombreuses molécules protéiques sur le site de lésion de l’ADN, ce qui rend difficile l’identification des protéines rares⁹.

Ici, nous montrons un test pour évaluer la localisation des protéines impliquées dans la voie DDR en utilisant y-H2AX comme marqueur du site de dommage. Ce test peut être utilisé pour caractériser la localisation temporelle sous différentes agressions qui causent des dommages à l’ADN.

Le Proximity Ligand Assay (PLA) est apparu comme un outil pour estimer l’interaction entre les protéines ainsi que la proximité spatiale entre les organites ou les structures cellulaires^10,11 et permet l’analyse de la localisation temporelle et de la co-localisation dans des conditions de stress, par exemple. La méthode est simple car elle s’apparente à l’immunofluorescence conventionnelle et permet la coloration simultanée de marqueurs spécifiques à l’organite ou à la structure cellulaire, tels que les mitochondries, le réticulum endoplasmique, les corps PML ou le marqueur double brin de l’ADN, yH2AX. L’utilisation du PLA permet d’identifier l’interaction des protéines lors des dommages à l’ADN d’une manière sensible, spécifique et fiable qui peut être utilisée pour surveiller l’interaction pendant le cycle cellulaire, en réponse à différents stimuli, et à différents moments après un stress génotoxique.

Nous montrons ici l’utilisation du PLA en concomitance avec l’immunofluorescence conventionnelle γ-H2AX pour localiser l’interaction Nek4-Ku70 après des dommages à l’ADN induits par l’étoposide. Nek4, un membre de la famille des Nek (kinases liées à NIMA), n’a pas de rôle clair dans la réponse aux dommages de l’ADN. En 2012, Nguyen et ses collègues ont montré que Nek4 interagit avec les protéines Ku70/Ku80, et en l’absence de Nek4, ces protéines ne sont pas recrutées sur le site de lésion de l’ADN, et la phosphorylation de H2AX est altérée¹². La localisation cellulaire de cette interaction est inconnue à ce jour. Nous avons observé une réduction de la phosphorylation de Ku70 dans les cellules exprimant le mutant¹³mort de la kinase Nek4, mais il reste à déterminer si Nek4 phosphoryle directement Ku70. Étant donné que l’interaction de Nek4 avec Ku70 est augmentée après un traitement à l’étoposide selon les études d’immunoprécipitation¹², nous tentons de localiser cette interaction à l’aide du PLA et du marqueur γ-H2AX.

Habituellement, les études d’interaction sont basées sur des tests d’immunoprécipitation, mais ceux-ci sont in vitro et ne fournissent pas d’informations sur l’emplacement de l’interaction. Lorsque cela est possible, une immunoprécipitation de cellules fractionnées (noyau, mitochondriale, membrane cellulaire ou cytosol) peut être effectuée, mais la réalisation d’un déroulement temporel de l’interaction est coûteuse et laborieuse. L’immunofluorescence peut donner des informations sur la localisation cellulaire des protéines, mais prouver l’interaction peut être difficile et dépend de la résolution des microscopes. Ici, nous montrons l’avantage d’utiliser le Proximity Ligand Assay pour surveiller l’interaction de deux protéines dans un contexte de dommages à l’ADN.

Protocole

1. Placage cellulaire

REMARQUE : Les cellules peuvent être ensemencées dans des lames, des chambres ou des plaques de fluorescence microscopiques. L’utilisation de petites lamelles ou de plaques de puits 96/384 est recommandée pour tester plusieurs conditions et des réactifs de rechange. L’utilisation de lamelles est recommandée pour les lignées cellulaires qui se détachent facilement, comme les cellules HEK293. Les lamelles peuvent être préalablement recouvertes d’une solution de poly-L-lysine pour améliorer la fixation.

1. Cellules sur plaque considérant un véhicule, contrôles techniques et contrôles biologiques. Utilisez des répétitions techniques à deux ou trois puits par condition.
   REMARQUE : L’utilisation d’un contrôle technique (secondaire et un seul principal) est obligatoire. Si possible, la lutte biologique devrait également être incluse (p. ex., surexpression ou inactivation de l’une des protéines cibles ou une condition connue pour modifier l’interaction, par exemple).
   1. Cultivez des cellules U2OS dans le milieu Modified Eagle de Dulbecco (DMEM) complété par 10 % de sérum de veau fœtal (FBS), 4,5 g/L de glucose et 4 mM de L-glutamine sur des plaques traitées par culture tissulaire à 37 °C dans 5 % de CO₂ et une atmosphère humidifiée contenant 90 % d’air. En fonction du nombre de conditions à tester et si vous utilisez un 384 ou des lamelles sur une plaque de 60 mm, commencez à partir d’une plaque de 60 ou 100 mm, respectivement.
   2. Lorsque les cellules atteignent une confluence de 60 à 70 %, divisez les cellules en utilisant 0,25 % de trypsine-EDTA ¹⁴. Comptez les cellules à l’aide d’une chambre Neubauer ou d’un compteur automatique¹⁴. Plaque 4 x 10⁵ cellules dans une plaque de 60 mm contenant plusieurs lamelles rondes de 13 mm ou 4 x 10⁵ cellules par puits dans une ou plusieurs plaques de 384 puits et incubation pendant 12 à 24 heures à 37 °C dans un incubateur humidifié à 5 % de CO₂ .

2. Préparation des solutions

REMARQUE : La concentration et la durée du traitement ont été choisies sur la base des résultats de la littérature, qui mettent en évidence l’activation des voies de réparation des dommages à l’ADN^15,16.

1. Préparer la solution mère d’étoposide à une concentration de 50 mM dans du DMSO. La solution mère peut être conservée à -20 °C pendant plusieurs mois. Diluer la solution d’étoposide pour l’utiliser dans le milieu de culture complet à une concentration finale de 25 μM. Utiliser du DMSO à 0,05 % dilué dans le milieu de culture complet comme contrôle du véhicule.
2. Préparez 20 citrates de sodium salins (SSC ; 3,0 M NaCl, 0,30 M de citrate trisodique pH 7,0). Cette solution peut être conservée plusieurs mois à 4 °C.

3. Traitement et fixation cellulaires

REMARQUE : Ne laissez pas les cellules sécher à tout moment ; Essayez de taper sur les solutions précédentes autant que possible. La méthode appropriée de fixation cellulaire (méthanol glacé ou paraformaldéhyde à 4 % (PFA)) doit être déterminée au préalable, ainsi que la dilution des anticorps, à l’aide d’une expérience d’immunofluorescence conventionnelle.

ATTENTION : Le méthanol doit être éliminé correctement.

1. Retirer le milieu de culture des puits et ajouter un milieu de culture contenant de l’étoposide ou du DMSO à 25 μM ou 0,05 %, respectivement. Incuber des cellules à 37 °C dans 5% de CO₂ et une atmosphère humidifiée contenant 90% d’air avec de l’étoposide ou du DMSO pendant 3 durées différentes : 20 min, 1 h et 3 h. Lors de l’utilisation de plaques 384, toutes les conditions doivent être fixées simultanément.
   1. Pour cela, commencez par traiter la condition avec la durée de traitement la plus longue, par exemple 3 h. Après 2 h, traitez la condition de traitement de 1 h, et lorsqu’il reste 20 minutes pour la fixation, traitez la condition de 20 minutes. Ensuite, toutes les conditions peuvent être corrigées en même temps.
2. Retirez le milieu des puits et lavez les cellules avec du PBS 3x.
3. Fixez les cellules en ajoutant du méthanol glacé avec suffisamment de volume pour couvrir la surface du puits. Incuber pendant 10 min à -20 °C. Lavez les puits avec du PBS 3x.
   REMARQUE : À ce stade, le protocole peut être mis en pause. Les plaques peuvent être conservées à 4 °C pendant 1 semaine.

4. Perméabilisation et blocage

REMARQUE : Si vous utilisez la méthode de fixation PFA, une étape de blocage avec de la glycine doit être effectuée avant la perméabilisation. La chambre d’humidité peut être préparée en plaçant un bac à eau à l’intérieur de l’incubateur, ce qui permet d’obtenir une humidité d’environ 95 %. La plaque ou les lames 384 peuvent être incubées dans un récipient en plastique fermé au-dessus d’un papier filtre ou d’une éponge humidifiée et d’un film transparent.

1. Tapotez le PBS des échantillons.
2. Ajouter 30 à 40 μL de tampon de perméabilisation (0,2 % de Triton X-100 dans du PBS) et incuber pendant 20 min à température ambiante. Laver 3 fois avec du PBS
3. Prélever le PBS des échantillons et ajouter 30 à 40 μL de la solution de blocage 1x fournie dans le kit PLA (alternativement, 3 % d’albumine sérique bovine et Triton X-100 0,1 % dans la solution PBS peuvent être utilisés) dans chaque puits/lamelle.
4. Incuber la plaque dans une chambre d’humidité préchauffée à 37 °C pendant 1 h.

5. Incubation primaire d’anticorps (PLA)

REMARQUE : Si vous utilisez des lamelles, il est important de s’assurer que la solution d’anticorps couvre toutes les surfaces des lamelles. Une attention particulière doit être portée à la sélection des anticorps. Les anticorps doivent provenir d’espèces animales différentes, et l’anticorps secondaire utilisé pour l’γ-H2AX ne doit pas être contre l’espèce hôte de la production des sondes PLA. Par exemple, les anticorps primaires utilisés pour le PLA ont été élevés chez des souris et des chèvres. Les sondes PLA, anti-souris et anti-chèvre ont été produites chez l’âne. L’anticorps contre γ-H2AX a été produit chez les lapins, et le deuxième anticorps utilisé est l’anti-lapin produit chez les ânes. De cette façon, le secondaire ne reconnaîtra pas les sondes PLA.

1. Diluer les anticorps primaires (l’anti-Ku70 de souris 1:100 et l’anti-Nek4 de chèvre 1:50 ; l’anti-Nek5 de lapin 1:25 et l’anti-TOPIIβ de souris 1:25) dans le diluant d’anticorps fourni dans le kit (alternativement, 3 % d’albumine sérique bovine et Triton X-100 0,1 % dans une solution de PBS peuvent être utilisés). Préparez 30 μL de solution d’anticorps par condition si vous utilisez des lamelles de recouvrement ou 20 μL par puits si vous utilisez une plaque à 384 puits.
2. Tapotez la solution de blocage. Ajouter la solution d’anticorps primaire dans chaque puits. Incuber à 4 °C pendant la nuit dans une chambre humide.

6. Incubation de la sonde PLA

REMARQUE : Choisissez les sondes, en tenant compte non seulement des anticorps primaires, mais aussi de ceux destinés à être utilisés dans les étapes d’immunofluorescence. Lors de l’utilisation de plaques à 384 puits pour une longue incubation à 37 °C, une rotation lente peut être utilisée pour améliorer la distribution de la solution d’anticorps.

1. Diluez les sondes moins et plus 1:5 dans le diluant d’anticorps. Préparez 10 μL par puits si vous utilisez des plaques de 384 puits ou 20 μL par échantillon si vous utilisez des lamelles. Utilisez les combinaisons suivantes : Âne anti-souris moins avec Âne anti-chèvre plus ; Donkey anti-souris minus avec Donkey anti-rabbit plus.
2. Tapotez la solution d’anticorps primaire. Laver 1 fois avec du TBS-T (50 mM Tris pH 7,5, 150 mM NaCl, 0,05 % de Tween-20). Lavez 3 fois pendant 5 minutes chacun avec du TBS-T à température ambiante. Effectuez un lavage supplémentaire avec du TBS-T.
3. Tapotez et ajoutez la solution de sonde PLA avec 10 μL pour les plaques et 20 μL pour les lamelles. Incuber dans la chambre d’humidité préchauffée à 37 °C pendant 1 h.

7. Ligature

REMARQUE : Attendez d’ajouter Ligase avant de l’ajouter immédiatement avant de l’ajouter aux échantillons. La ligase doit être conservée dans un bloc congélateur (-20 °C). Retirez complètement toute la solution de lavage avant d’ajouter la solution de ligase. Évitez de laisser les cellules sans solution pendant de longues périodes. Lors de l’utilisation de plaques à 384 puits pour l’incubation à 37 °C, une rotation lente peut être utilisée pour améliorer la distribution de la solution d’anticorps.

1. Diluez le tampon de ligature 5x dans de l’eau de haute pureté. Préparez 10 μL par puits si vous utilisez des plaques à 384 puits ou 20 μL si vous utilisez des lamelles.
2. Arrêtez la solution de sonde PLA. Laver 1x avec TBS-T. Poursuivez avec trois lavages supplémentaires, d’une durée de 5 minutes chacun, à l’aide de TBS-T. Lavez une dernière fois et tapotez le TBS-T avant l’étape suivante.
3. Ajouter la ligase à la solution 1x Ligation à 1:40, immédiatement avant de l’appliquer sur les échantillons. Incuber dans la chambre d’humidité préchauffée à 37 °C pendant 30 min à 1 h.

8. Amplification et lavage

REMARQUE : Attendez d’ajouter la polymérase jusqu’à ce qu’il soit immédiatement avant l’ajout à l’échantillon. Le tampon d’amplification est sensible à la lumière ; Protégez toutes les solutions contenant le tampon de la lumière. La polymérase doit être conservée dans un bloc congélateur (-20 °C). Évitez de laisser les cellules sans solution pendant une longue période. Lors de l’utilisation de plaques à 384 puits pour une incubation à 37 °C, une rotation lente peut améliorer la distribution de la solution d’anticorps.

1. Retirez complètement toute la solution de lavage avant d’ajouter la solution de polymérase. Évitez de laisser les cellules sans solution pendant une longue période. Diluez le tampon d’amplification 5x dans de l’eau de haute pureté. Préparez 10 μL par puits si vous utilisez des plaques à 384 puits ou 20 μL si vous utilisez des lamelles.
2. Tapotez la solution de ligature. Laver 1x avec TBS-T. Poursuivez avec trois lavages supplémentaires, d’une durée de 5 minutes chacun, à l’aide de TBS-T. Lavez une dernière fois et tapotez le TBS-T avant l’étape suivante.
3. Ajouter la polymérase à la solution d’amplification 1x à une dilution de 1:80, immédiatement avant de l’appliquer sur les échantillons. Incuber dans la chambre d’humidité préchauffée à 37 °C pendant 100 min.
   REMARQUE : À partir de cette étape, évitez l’exposition directe à la lumière
4. Éteignez le tampon d’amplification. Lavez 2 fois avec 1 tampon SSC pendant 10 minutes chacun. Lavez 2 fois avec un tampon SSC 0,01x pendant 2 minutes chacun.

9. Coloration γ-H2AX (immunofluorescence - FI)

REMARQUE : L’étiquetage de γ-H2AX est effectué après la fin du PLA.

1. Incubation primaire d’anticorps (FI)
   1. Diluer les anticorps primaires (Rabbit anti yH2AX à 1:100) dans une solution bloquante (alternativement, 3% d’albumine sérique bovine et Triton X-100 0,1% dans une solution PBS peuvent être utilisés). Préparez 30 μL de solution d’anticorps par puits si vous utilisez des lamelles ou 20 μL si vous utilisez une plaque à 384 puits.
   2. Désactivez la solution SSC 0,01x. Laver 2x avec du PBS.
   3. Ajouter la solution d’anticorps primaire dans chaque puits. Incuber à température ambiante pendant 1 h.
2. Incubation secondaire d’anticorps (FI)
   REMARQUE : Assurez-vous que les anticorps secondaires choisis ne reconnaissent pas les anticorps ou les sondes PLA. De plus, la longueur d’onde de l’anticorps secondaire doit être différente de la longueur d’onde du réactif de détection PLA. Par exemple : notre réactif de détection PLA contient le fluorophore 647, et le secondaire que nous avons utilisé pour la détection γ-H2AX est le 488.
   1. Diluer les anticorps secondaires (âne anti-lapin Alexa Fluor 488) dans une solution bloquante (alternativement, 3% d’albumine sérique bovine et Triton X - 100 0,1% dans une solution PBS peuvent être utilisés) à une dilution de 1:300. Préparez 30 μL de solution d’anticorps par condition si vous utilisez des lamelles de recouvrement ou 20 μL par puits si vous utilisez une plaque à 384 puits. Ajouter le colorant Hoechst 33342 à la concentration finale de 0,6 μg/mL.
   2. Tapotez la solution d’anticorps primaire. Laver 3 fois avec TBS-T.
   3. Ajouter la solution d’anticorps secondaire dans chaque puits. Incuber à température ambiante pendant 20 min.
   4. Laver 5 fois avec TBS-T. Laver 2x avec 1x tampon SSC. Laver 2x avec un tampon SSC 0,01x.
      REMARQUE : À ce stade, les plaques peuvent être stockées pendant plusieurs semaines à 4 °C (en SSC 0.01X) à l’abri de la lumière. Si vous utilisez des lamelles, les lames peuvent être montées et, après 1 jour, les lames peuvent être stockées à -20 °C.

10. Acquisition d’images

1. Utilisez un microscope à fluorescence conventionnel et l’objectif 63x. Déterminez le temps d’exposition en comparant les commandes négatives et positives pour éviter la saturation et l’effondrement des points.
   REMARQUE : L’utilisation de microscopes confocaux améliore la détection des points PLA. L’objectif 20x peut également être utilisé pour augmenter le nombre de noyaux détectés.
2. Une fois le temps d’exposition ajusté, effectuez toutes les acquisitions de points PLA avec les mêmes paramètres. Essayez d’acquérir des images de différentes régions de puits ou de lamelles pour éviter les artefacts dus à une incubation non homogène.
3. Enregistrez toutes les chaînes avec le même modèle de nom. Si le microscope prend des photos dans les canaux séparément, enregistrez les images correspondantes avec le même nom, en ajoutant uniquement PLA ou Nucleus au début du nom de fichier pour différencier le canal.

11. Analyse d’images

REMARQUE : Une macro a été créée pour l’analyse des points par noyau dans l’image J/FIJI¹⁷ et pour être utilisée avec des microscopes où les informations d’échelle doivent être ajoutées manuellement. La taille des pixels de l’objectif utilisé doit être connue. Placez les images de chaque canal dans des dossiers différents (Fichier de codage supplémentaire 1, Figure supplémentaire 1).
REMARQUE : La macro prend en compte les canaux de fluorescence obtenus séparément. Dans ce cas, il est important d’enregistrer toutes les images portant le même nom.

1. La macro permet de sélectionner une région spécifique dans le champ. Utilisez l’option Sélectionner une zone d’intérêt lorsqu’une région de l’image présente des artefacts qui peuvent nuire à l’analyse. Choisissez le ROI au début de l’analyse et utilisez-le pour toutes les images.
   REMARQUE : Il s’agit d’une fonctionnalité facultative. Si cette option n’est pas sélectionnée, l’image entière sera prise en compte dans l’analyse (figure supplémentaire 2).
2. Le fichier ROI doit être créé avant l’utilisation de la macro, comme décrit ci-dessous. Pour sélectionner la ROI, utilisez un outil rectangulaire, sélectionnez la région à analyser et ajoutez-la au gestionnaire de ROI en cliquant sur Modifier > sélection> Ajouter au gestionnaire. Enregistrez le retour sur investissement en cliquant sur Plus> Enregistrer.
3. Dans l’ImageJ ¹⁷, ouvrez des images de différentes conditions pour ajuster les paramètres d’analyse. Ces paramètres doivent être déterminés par l’utilisateur et spécifiés, avec les données, dans le programme de macros (Fichier de codage supplémentaire 1)
   1. Correction de l’arrière-plan : Pour supprimer l’arrière-plan, cliquez sur Traiter> Soustraire l’arrière-plan. Testez différents rayons de balle roulante à l’aide de la fonction de prévisualisation). Nous avons utilisé le roulement 10 pour les points PLA et le roulement 100 pour le noyau.
   2. Supprimez le bruit en cliquant sur Traiter > Bruit > Supprimer le bruit. Pour le noyau, utilisez la fonction lisse pour améliorer le remplissage du noyau en cliquant sur Traiter>Lisser.
   3. Réglage du seuil : convertissez en image 8 bits et ajustez le seuil en cliquant sur > > d’image Type 8 bits et sur Image > Ajuster > Seuil. Ajustez le seuil en conséquence pour visualiser tous les noyaux ou points présents dans l’image mais en évitant la sursaturation et l’effondrement des structures. Prenez note des valeurs et testez-les dans différentes images pour vérifier si le seuil fonctionne pour différentes images.
   4. Convertissez en masque en cliquant sur Traiter > binaire > Convertir en masque. Dans le cas du noyau, cliquez sur Traiter > Trous de > de remplissage binaires, puis sur Traiter > Binaire > bassin versant. Dans le cas des points PLA, cliquez sur Traiter > ligne de partage des eaux > binaire.
   5. Pour compter les noyaux, mesurez l’aire ou la longueur des différents noyaux afin d’estimer la taille moyenne. Utilisez une valeur approximative pour analyser les particules. Cliquez sur Analyser > Analyser les particules, puis sélectionnez Définir la taille : 15-infini (ces valeurs dépendent de la taille des noyaux). Cochez les options suivantes : Afficher : Masque ; Afficher les résultats ; Des résultats clairs ; Résumer; Ajouter au gestionnaire ; Exclure sur les bords.
   6. Pour compter les points PLA, mesurez l’aire ou le rayon des points pour estimer la taille moyenne. Sélectionnez Appliquer le masque Nucleus (appliquer le masque est une fonction sur le plugin GDSC, vérifiez s’il est installé) suivi de Analyser > Analyser les particules et régler. 0,02-3 (ces valeurs dépendent de la taille des noyaux). Cochez les options suivantes : Afficher : Masque ; Afficher les résultats ; Des résultats clairs ; Résumer; Ajouter au gestionnaire ; Exclure sur les bords.
4. Les résultats montrent le nombre de points par noyau dans chaque noyau présent sur l’image. Enregistrez ces données.

12. Visualisation des images fusionnées

1. Ouvrez les canaux correspondant à PLA, nucleus et γ-H2AX. Soustrayez l’arrière-plan et supprimez le bruit, comme mentionné aux étapes 11.4.1 et 11.4.2 pour toutes les images.
2. Ajustez la luminosité et le contraste automatiquement ou manuellement en utilisant la même valeur pour toutes les conditions à partir du même canal. Sélectionnez Image > Ajuster > Luminosité/contraste.
3. Combinez les images (fusion) en sélectionnant Image > Couleur > Fusionner les canaux. Ajoutez une barre d’échelle en sélectionnant Outils d’analyse > > Barre d’échelle. Enregistrer sous. TIFF fichier.

Résultats

Nous avons observé l’interaction Nek4-Ku70 en l’absence de traitement à l’étoposide. Cependant, cette interaction peut se produire à l’extérieur du noyau (Figure 1A). L’interaction Nek4-Ku70 augmente après une lésion de l’ADN et est concentrée dans le noyau (Figure 1A). Dans le cas de l’interaction Nek5-Topoisomerase II β (TOPIIβ), utilisée dans ce test comme contrôle positif basé sur les résultats de...

Discussion

Les données montrent que l’utilisation concomitante de PLA à un marqueur endommagé par l’ADN peut fournir le plus d’informations dans un profilage de réponse aux dommages à l’ADN, montrant le comportement spatial et temporel de l’interaction après l’agression. Le PLA est une méthode polyvalente qui a été utilisée pour l’identification de la dimérisation, la détermination du contact des organites, l’interaction protéine-acide nucléique et principalement l’i...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Black 384-well plates	Perkin Elmer Cell carrier plates
Donkey  anti- Rabbit Alexa Fluor 488	Invitrogen	A21206	1:300
Duo link Donkey anti Mouse Minus	Sigma	DUO92004
Duolink antibody diluent	Sigma	DUO82008
Duolink blocking solution 1X	Sigma	DUO82007
Duolink Detection reagent Far red	Sigma	DUO92013
Duolink Donkey anti goat plus	Sigma	DUO92003
Duolink Donkey anti rabbit plus	Sigma	DUO92002
Etoposide	Sigma	E1383
Goat anti Nek4	Santa Cruz Biotechnology	SC-5517	goat anti Nek4 was used at 1:50 dilution
Hoechst 33342	Thermo	H1399	0.6 µg/mL
Leica DMI microscope	Leica
Mouse anti Ku70	Thermo	MA5-13110	mouse anti Ku70 was used at 1:100 dilution
Mouse anti TOPIIβ	Santa Cruz Biotechnology	SC-365071	1:25
Rabbit anti Nek5	Santa Cruz Biotechnology	SC-84527	1:25
Rabbit anti Y H2AX	Cell Signalling	9718S	1:100 dilution
U2OS cell line	ATCC	HTB-96