Dosage des ligands de proximité pour localiser les protéines dans les sites de dommages à l’ADN

Résumé

Ici, nous présentons un protocole simple et rapide pour la détection de l’interaction protéique aux sites de dommages à l’ADN.

Résumé

La réponse aux dommages à l’ADN est une sauvegarde de l’information génétique qui protège les cellules contre la perpétuation de l’ADN endommagé. La caractérisation des protéines qui coopèrent dans ce processus permet d’identifier des cibles alternatives pour une intervention thérapeutique dans plusieurs maladies, telles que le cancer, les maladies liées au vieillissement et l’inflammation chronique. Le Proximity Ligand Assay (PLA) est apparu comme un outil pour estimer l’interaction entre les protéines ainsi que la proximité spatiale entre les organites ou les structures cellulaires et permet l’analyse de la localisation temporelle et de la co-localisation dans des conditions de stress, par exemple. La méthode est simple car elle est similaire à l’immunofluorescence conventionnelle et permet la coloration simultanée d’un organite, d’une structure cellulaire ou d’un marqueur spécifique tel que les mitochondries, le réticulum endoplasmique, les corps PML ou le marqueur double brin de l’ADN, yH2AX. La phosphorylation de la S139 au variant de l’histone 2A, H2AX, alors appelée yH2AX, est largement utilisée comme marqueur très sensible et spécifique des cassures double brin de l’ADN. Chaque foyer de coloration yH2AX correspond à une cassure de l’ADN qui se produit quelques minutes après les dommages. L’analyse des changements dans les foyers yH2AX est le test le plus courant pour étudier si la protéine d’intérêt est impliquée dans la réponse aux dommages de l’ADN (DDR). Qu’un rôle direct dans le site de lésion de l’ADN soit attendu, la microscopie à fluorescence est utilisée pour vérifier la colocalisation de la protéine d’intérêt avec les foyers yH2AX. Cependant, à l’exception des nouvelles méthodes de fluorescence à super-résolution, pour conclure, l’interaction locale avec les sites de dommages à l’ADN peut être un peu subjective. Ici, nous montrons un test pour évaluer la localisation des protéines dans la voie DDR en utilisant yH2AX comme marqueur du site de dommage. Ce test peut être utilisé pour caractériser la localisation temporelle sous différentes agressions qui causent des dommages à l’ADN.

Introduction

Les dommages à l’ADN cellulaire se produisent quotidiennement en raison des réactions chimiques spontanées et sont également augmentés par des facteurs exogènes tels que les agents génotoxiques (radiations et produits chimiques tels que l’étoposide) et le stress oxydatif ^1,2,3. Les cellules ont une machinerie complexe qui corrige une myriade de types différents de dommages à l’ADN, de l’ablation des bases à la torsion de la fourche réplicative ou à l’interruption de la lésion la plus délétère : la cassure double brin d....

Protocole

1. Placage cellulaire

REMARQUE : Les cellules peuvent être ensemencées dans des lames, des chambres ou des plaques de fluorescence microscopiques. L’utilisation de petites lamelles ou de plaques de puits 96/384 est recommandée pour tester plusieurs conditions et des réactifs de rechange. L’utilisation de lamelles est recommandée pour les lignées cellulaires qui se détachent facilement, comme les cellules HEK293. Les lamelles peuvent être préalablement recouvertes d’une solution de poly-L-lysine pour améliorer la fixation.

1. Cellules sur plaque considérant un véhicule, contrôles tech....

Discussion

Les données montrent que l’utilisation concomitante de PLA à un marqueur endommagé par l’ADN peut fournir le plus d’informations dans un profilage de réponse aux dommages à l’ADN, montrant le comportement spatial et temporel de l’interaction après l’agression. Le PLA est une méthode polyvalente qui a été utilisée pour l’identification de la dimérisation, la détermination du contact des organites, l’interaction protéine-acide nucléique et principalement l’i.......

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Black 384-well plates	Perkin Elmer Cell carrier plates
Donkey  anti- Rabbit Alexa Fluor 488	Invitrogen	A21206	1:300
Duo link Donkey anti Mouse Minus	Sigma	DUO92004
Duolink antibody diluent	Sigma	DUO82008
Duolink blocking solution 1X	Sigma	DUO82007
Duolink Detection reagent Far red	Sigma	DUO92013
Duolink Donkey anti goat plus	Sigma	DUO92003
Duolink Donkey anti rabbit plus	Sigma	DUO92002
Etoposide	Sigma	E1383
Goat anti Nek4	Santa Cruz Biotechnology	SC-5517	goat anti Nek4 was used at 1:50 dilution
Hoechst 33342	Thermo	H1399	0.6 µg/mL
Leica DMI microscope	Leica
Mouse anti Ku70	Thermo	MA5-13110	mouse anti Ku70 was used at 1:100 dilution
Mouse anti TOPIIβ	Santa Cruz Biotechnology	SC-365071	1:25
Rabbit anti Nek5	Santa Cruz Biotechnology	SC-84527	1:25
Rabbit anti Y H2AX	Cell Signalling	9718S	1:100 dilution
U2OS cell line	ATCC	HTB-96