Proximity-Liganden-Assay zur Lokalisierung von Proteinen in DNA-Schadensstellen

Zusammenfassung

Hier stellen wir ein einfaches und schnelles Protokoll für den Nachweis von Proteininteraktionen an DNA-Schadensstellen vor.

Zusammenfassung

Die DNA-Schadensantwort ist ein genetischer Informationsschutz, der Zellen davor schützt, beschädigte DNA aufrechtzuerhalten. Die Charakterisierung der Proteine, die in diesem Prozess zusammenarbeiten, ermöglicht die Identifizierung alternativer Ziele für therapeutische Eingriffe bei verschiedenen Krankheiten wie Krebs, altersbedingten Krankheiten und chronischen Entzündungen. Der Proximity Ligand Assay (PLA) hat sich als Werkzeug zur Abschätzung der Wechselwirkung zwischen Proteinen sowie der räumlichen Nähe zwischen Organellen oder zellulären Strukturen herauskristallisiert und ermöglicht die zeitliche Lokalisierung und Co-Lokalisationsanalyse unter Stressbedingungen. Die Methode ist einfach, da sie der herkömmlichen Immunfluoreszenz ähnelt und die gleichzeitige Färbung eines Organellen, einer zellulären Struktur oder eines spezifischen Markers wie Mitochondrien, endoplasmatisches Retikulum, PML-Körper oder DNA-Doppelstrangmarker, yH2AX, ermöglicht. Die Phosphorylierung des S139 an der Histon-2A-Variante, H2AX, damals als yH2AX bezeichnet, wird häufig als sehr empfindlicher und spezifischer Marker für DNA-Doppelstrangbrüche verwendet. Jeder Fokus der yH2AX-Färbung entspricht einem Bruch in der DNA, der einige Minuten nach der Schädigung auftritt. Die Analyse von Veränderungen in yH2AX-Foki ist der gebräuchlichste Assay, um zu untersuchen, ob das Protein von Interesse an der DNA-Schadensantwort (DDR) beteiligt ist. Unabhängig davon, ob eine direkte Rolle an der DNA-Schadensstelle erwartet wird, wird die Fluoreszenzmikroskopie verwendet, um die Kolokalisation des interessierenden Proteins mit yH2AX-Herden zu verifizieren. Abgesehen von den neuen superauflösenden Fluoreszenzmethoden kann die lokale Interaktion mit DNA-Schadensstellen jedoch ein wenig subjektiv sein. Hier zeigen wir einen Assay zur Bewertung der Lokalisierung von Proteinen im DDR-Signalweg unter Verwendung von yH2AX als Marker für die Schädigungsstelle. Dieser Assay kann verwendet werden, um die zeitliche Lokalisation unter verschiedenen Beleidigungen zu charakterisieren, die DNA-Schäden verursachen.

Einleitung

Zelluläre DNA-Schäden treten täglich aufgrund der spontanen chemischen Reaktionen auf und werden auch durch exogene Faktoren wie genotoxische Wirkstoffe (Strahlung und Chemikalien wie Etoposid) und oxidativen Stress verstärkt ^1,2,3. Die Zellen verfügen über eine komplexe Maschinerie, die eine Vielzahl verschiedener Arten von DNA-Schäden korrigiert, von der Entfernung von Basen über die replikative Gabeltorsion bis hin zur Unterbrechung der schädlichsten Läsion: dem DNA-Doppelstrangbruch ^4,5.

Mehrere Proteine, die an der DDR beteiligt sind, wurden bereits charakterisiert, und ausgezeichnete Revisionen untersuchen die Wege der nicht-homologen Endverbindung (NHEJ) und der homologen Rekombination (HR), die Hauptwege, die bei der Reparatur von Doppelstrangbrüchen (DSB) impliziert sind ^5,6. Die Phosphorylierung der Histon-H2A-Variante H2AX an Serin 139 (im Folgenden als y-H2AX bezeichnet) wird seit vielen Jahren als sensitiver und zuverlässiger Marker für den Doppelstrangbruch verwendet. Die Phosphorylierung von H2AX wird in den ersten Minuten nach der Schädigung beobachtet und kann über Stunden anhalten⁷.

Der Vorteil der Immunfluoreszenzdetektion von γ-H2AX-Foki liegt in der Charakterisierung der zeitlichen und räumlichen Verteilung der Foci, sowie deren Co-Färbung mit anderen Proteinen. Darüber hinaus ist bei der Immunfluoreszenz keine Lyse erforderlich, wodurch die zellulären Kontextinformationen erhalten bleiben und sie informativer werden. Da γ-H2AX de novo gebildet wird, ist es außerdem nicht reichlich vorhanden, wenn keine DNA-Schäden vorliegen, was es zu einem spezifischen Marker macht⁷.

H2AX wird hauptsächlich durch die Proteinkinase Ataxie-Teleangiektasie mutierte (ATM) und DNA-abhängige Proteinkinase (DNA-PK) phosphoryliert, die Sensoren der DSBs. Ku70/80 (XRCC6 Röntgenreparatur kreuzkomplementär 6/ XRCC5 Röntgenreparatur kreuzkomplementär 5) und DNA-Proteinkinase katalytische Untereinheit (DNA-PKcs) sind für die DSB-Identifizierung und den Schutz der DNA-Enden verantwortlich, während Artemis die Endverarbeitung durchführt, um die Ligation durch den XRCC4-Ligase IV-Komplex zu erleichtern. Die Phosphorylierung von H2AX an Stellen, die DSBs flankieren, fungiert als Signal für die Rekrutierung mehrerer Reparaturproteine und als Signalsignal für den Zellzyklusarrest, den Tod oder das Überleben⁸.

Die Analyse von Veränderungen in y-H2AX-Foki ist der gebräuchlichste Assay, um zu untersuchen, ob das interessierende Protein an der DNA-Schadensantwort beteiligt ist. Unabhängig davon, ob eine direkte Rolle an der DNA-Schädigungsstelle erwartet wird, wird die Fluoreszenzmikroskopie verwendet, um die Kolokalisation des interessierenden Proteins mit y-H2AX-Herden zu verifizieren. Abgesehen von den neuen superauflösenden Fluoreszenzmethoden kann es jedoch schwierig sein, auf die lokale Wechselwirkung mit DNA-Schadensstellen zu schließen. Darüber hinaus hängt der Immunfluoreszenznachweis in der Regel von vielen Proteinmolekülen an der DNA-Schadensstelle ab, was die Identifizierung knapper Proteine erschwert⁹.

Hier zeigen wir einen Assay zur Bewertung der Lokalisierung von Proteinen, die am DDR-Signalweg beteiligt sind, unter Verwendung von y-H2AX als Marker für die Schadensstelle. Dieser Assay kann verwendet werden, um die zeitliche Lokalisation unter verschiedenen Beleidigungen zu charakterisieren, die DNA-Schäden verursachen.

Der Proximity Ligand Assay (PLA) hat sich als Werkzeug zur Abschätzung der Wechselwirkung zwischen Proteinen sowie der räumlichen Nähe zwischen Organellen oder zellulären Strukturen erwiesen^10,11 und ermöglicht die zeitliche Lokalisierung und Co-Lokalisationsanalyse unter Stressbedingungen. Die Methode ist einfach, da sie wie die herkömmliche Immunfluoreszenz ist und die gleichzeitige Färbung von organellen- oder zellstrukturspezifischen Markern wie Mitochondrien, endoplasmatischem Retikulum, PML-Körpern oder dem DNA-Doppelstrangmarker yH2AX ermöglicht. Die Verwendung von PLA ermöglicht die Identifizierung der Proteininteraktion während der DNA-Schädigung auf empfindliche, spezifische und zuverlässige Weise, die zur Überwachung der Interaktion während des Zellzyklus, als Reaktion auf verschiedene Reize und zu verschiedenen Zeiten nach genotoxischem Stress verwendet werden kann.

Wir zeigen hier die Verwendung von PLA parallel zur konventionellen γ-H2AX-Immunfluoreszenz zur Lokalisierung der Nek4-Ku70-Interaktion nach Etoposid-induzierter DNA-Schädigung. Nek4, ein Familienmitglied der Nek (NIMA-verwandte Kinasen), spielt keine klare Rolle bei der Reaktion auf DNA-Schäden. Im Jahr 2012 zeigten Nguyen und Kollegen, dass Nek4 mit Ku70/Ku80-Proteinen interagiert, und in Abwesenheit von Nek4 werden diese Proteine nicht an die DNA-Schadensstelle rekrutiert, und die H2AX-Phosphorylierung ist beeinträchtigt¹². Die zelluläre Lokalisation dieser Interaktion ist bisher nicht bekannt. Wir haben eine Verringerung der Ku70-Phosphorylierung in Zellen beobachtet, die die Nek4-Kinase-tote Mutante¹³exprimieren, aber ob Nek4 direkt Ku70 phosphoryliert, muss noch geklärt werden. In Anbetracht der Tatsache, dass die Interaktion von Nek4 mit Ku70 nach einer Etoposidbehandlung gemäß Immunpräzipitationsstudien¹² erhöht ist, versuchen wir, diese Interaktion mit PLA und dem γ-H2AX-Marker zu lokalisieren.

In der Regel basieren die Interaktionsstudien auf Immunpräzipitationsassays, diese sind jedoch in vitro und geben keine Auskunft über den Ort der Interaktion. Wenn möglich, kann eine Immunpräzipitation von fraktionierten Zellen (Zellkern, Mitochondrien, Zellmembran oder Zytosol) durchgeführt werden, aber die Durchführung eines zeitlichen Verlaufs der Interaktion ist kostspielig und mühsam. Immunfluoreszenz kann Aufschluss über die zelluläre Lokalisation der Proteine geben, aber der Nachweis der Wechselwirkung kann schwierig sein und hängt von der Auflösung der Mikroskope ab. Hier zeigen wir den Vorteil der Verwendung des Proximity-Liganden-Assays, um die Interaktion zweier Proteine im Zusammenhang mit DNA-Schäden zu überwachen.

Protokoll

1. Beschichtung der Zelle

HINWEIS: Zellen können in mikroskopisch kleinen Fluoreszenz-Objektträgern, -Kammern oder -Platten ausgesät werden. Die Verwendung von kleinen Deckgläsern oder 96/384-Well-Platten wird empfohlen, um mehrere Bedingungen und Ersatzreagenzien zu testen. Die Verwendung von Deckgläsern ist bei Zelllinien ratsam, die sich leicht ablösen, wie z.B. HEK293-Zellen. Die Deckgläser können zuvor mit einer Poly-L-Lysin-Lösung beschichtet werden, um die Befestigung zu verbessern.

1. Plattenzellen, die ein Fahrzeug, technische Kontrollen und biologische Kontrollen berücksichtigen. Verwenden Sie technische Replikate bei zwei oder drei Wells pro Zustand.
   HINWEIS: Die Verwendung einer technischen Kontrolle (sowohl sekundäre als auch nur eine primäre) ist obligatorisch. Wenn möglich, sollte auch eine biologische Kontrolle einbezogen werden (z. B. Überexpression oder Knockdown eines der Zielproteine oder eine Erkrankung, von der bekannt ist, dass sie die Interaktion verändert, z. B.
   1. Kultivieren Sie U2OS-Zellen in Dulbeccos modifiziertem Eagle-Medium (DMEM), ergänzt mit 10 % fötalem Kälberserum (FBS), 4,5 g/l Glukose und 4 mM L-Glutamin auf gewebekulturbehandelten Platten bei 37 °C in 5 % CO₂ und einer befeuchteten Atmosphäre, die 90 % Luft enthält. Abhängig von der Anzahl der zu prüfenden Bedingungen und bei Verwendung einer 384 oder Deckgläser auf einer 60-mm-Platte ist von einer 60- bzw. 100-mm-Platte auszugehen.
   2. Wenn die Zellen eine Konfluenz von 60 % bis 70 % erreichen, teilen Sie die Zellen mit 0,25 % Trypsin-EDTA ¹⁴. Zählen Sie die Zellen mit einer Neubauer-Kammer oder einem automatischen Zähler¹⁴. Platte 4 x 10⁵ Zellen in 60 mm Platte mit mehreren runden Deckgläsern 13 mm oder 4 x 10⁵ Zellen pro Vertiefung in 384-Well-Platte(n) und 12 - 24 Stunden bei 37 °C in einem befeuchteten Inkubator mit 5 % CO₂ inkubieren.

2. Vorbereitung der Lösungen

HINWEIS: Die Konzentration und der Zeitpunkt der Behandlung wurden auf der Grundlage von Literaturergebnissen ausgewählt, die auf die Aktivierung von DNA-Schadensreparaturwegen hinweisen^15,16.

1. Bereiten Sie die Stammlösung von Etoposid in einer Konzentration von 50 mM in DMSO vor. Die Stammlösung kann mehrere Monate bei -20 °C aufbewahrt werden. Verdünnen Sie die Etoposidlösung zur Verwendung im gesamten Kulturmedium bei einer Endkonzentration von 25 μM. Verwenden Sie DMSO in einer Menge von 0,05 % verdünnt im gesamten Kulturmedium als Vehikelkontrolle.
2. Bereiten Sie 20x Kochsalzlösung Natriumcitrat (SSC; 3,0 M NaCl, 0,30 M Trinatriumcitrat pH 7,0) vor. Diese Lösung kann mehrere Monate bei 4 °C aufbewahrt werden.

3. Zellbehandlung und -fixierung

HINWEIS: Lassen Sie die Zellen zu keinem Zeitpunkt trocknen. Versuchen Sie, die vorherigen Lösungen so weit wie möglich zu nutzen. Zuvor muss die geeignete Methode zur Zellfixierung (eiskaltes Methanol oder 4%iger Paraformaldehyd (PFA)) sowie die Antikörperverdünnung mit einem herkömmlichen Immunfluoreszenzexperiment bestimmt werden.

ACHTUNG: Methanol muss ordnungsgemäß entsorgt werden.

1. Nehmen Sie das Kulturmedium aus den Vertiefungen und fügen Sie ein Kulturmedium hinzu, das Etoposid oder DMSO in einer Konzentration von 25 μM bzw. 0,05 % enthält. Inkubieren Sie die Zellen bei 37 °C in 5 % CO₂ und einer befeuchteten Atmosphäre mit 90 % Luft mit Etoposid oder DMSO für 3 verschiedene Zeiträume: 20 min, 1 h und 3 h. Bei der Verwendung von 384-Platten müssen alle Bedingungen gleichzeitig festgelegt werden.
   1. Beginnen Sie dazu mit der Behandlung der Erkrankung mit der längsten Behandlungszeit, z. B. 3 Stunden. Behandeln Sie nach 2 Stunden den 1-stündigen Behandlungszustand, und wenn noch 20 Minuten für die Fixierung übrig sind, behandeln Sie den 20-minütigen Zustand. Anschließend können alle Bedingungen gleichzeitig festgelegt werden.
2. Entfernen Sie das Medium aus den Vertiefungen und waschen Sie die Zellen mit PBS 3x.
3. Fixieren Sie die Zellen, indem Sie eiskaltes Methanol mit genügend Volumen hinzufügen, um die Well-Oberfläche zu bedecken. 10 min bei -20 °C inkubieren. Waschen Sie die Vertiefungen mit PBS 3x.
   HINWEIS: An dieser Stelle kann das Protokoll pausiert werden. Die Platten können bei 4 °C 1 Woche gelagert werden.

4. Permeabilisierung und Blockierung

HINWEIS: Wenn Sie die PFA-Fixierungsmethode verwenden, muss vor der Permeabilisierung ein Schritt der Blockierung mit Glycin durchgeführt werden. Die Feuchtigkeitskammer kann vorbereitet werden, indem eine Wasserschale in den Inkubator gestellt wird, was zu einer Luftfeuchtigkeit von etwa 95 % führt. Die 384 Platte oder Objektträger können in einem geschlossenen Kunststoffbehälter über Filterpapier oder angefeuchtetem Schwamm und transparenter Folie inkubiert werden.

1. Klopfen Sie die PBS aus den Samples ab.
2. 30-40 μl Permeabilisierungspuffer (0,2 % Triton X-100 in PBS) zugeben und 20 Minuten bei Raumtemperatur inkubieren. 3x mit PBS waschen
3. Klopfen Sie das PBS aus den Proben ab und geben Sie 30-40 μl 1x Blockierungslösung, die im PLA-Kit enthalten ist (alternativ können 3 % Rinderserumalbumin und Triton X-100 0,1 % in PBS-Lösung verwendet werden) in jede Vertiefung/Deckglas.
4. Die Platte in einer vorgeheizten Feuchtigkeitskammer bei 37 °C 1 h inkubieren.

5. Primäre Antikörper-Inkubation (PLA)

HINWEIS: Bei der Verwendung von Deckgläsern ist darauf zu achten, dass die Antikörperlösung alle Deckglasoberflächen bedeckt. Besonderes Augenmerk muss auf die Auswahl der Antikörper gelegt werden. Die Antikörper müssen von verschiedenen Tierarten stammen, und der für γ-H2AX verwendete Sekundärantikörper darf nicht gegen den Spezieswirt der PLA-Sondenproduktion gerichtet sein. Zum Beispiel wurden die primären Antikörper, die für PLA verwendet werden, in Mäusen und Ziegen gezüchtet. Die PLA-Sonden, Anti-Maus und Anti-Ziege, wurden im Esel hergestellt. Der Antikörper gegen γ-H2AX wurde in Kaninchen hergestellt, und der sekundär verwendete Antikörper ist Anti-Kaninchen, der in Eseln produziert wird. Auf diese Weise erkennt die Sekundärsonde die PLA-Sonden nicht.

1. Verdünnen Sie die Primärantikörper (das Maus-Anti-Ku70 1:100 und das Ziegen-Anti-Nek4 1:50; Kaninchen-Anti-Nek5 1:25 und das Maus-Anti-TOPIIβ 1:25) in dem im Kit enthaltenen Antikörperverdünnungsmittel (alternativ können 3 % Rinderserumalbumin und Triton X-100 0,1 % in PBS-Lösung verwendet werden). Bereiten Sie 30 μl Antikörperlösung pro Bedingung vor, wenn Sie Deckgläser verwenden, oder 20 μl pro Well, wenn Sie eine 384-Well-Platte verwenden.
2. Tippen Sie auf die Blockierungslösung. Geben Sie die primäre Antikörperlösung in jede Vertiefung. Inkubieren Sie bei 4 °C über Nacht in einer Feuchtigkeitskammer.

6. Inkubation der PLA-Sonde

HINWEIS: Bei der Auswahl der Sonden berücksichtigen Sie nicht nur die primären Antikörper, sondern auch die Antikörper, die für die Verwendung in den Immunfluoreszenzschritten vorgesehen sind. Bei der Verwendung von 384-Well-Platten für eine lange Inkubation von 37 °C kann eine langsame Rotation verwendet werden, um die Verteilung der Antikörperlösung zu verbessern.

1. Verdünnen Sie die Minus- und Plussonden 1:5 im Antikörperverdünnungsmittel. Bereiten Sie 10 μl pro Vertiefung vor, wenn Sie 384-Well-Platten verwenden, oder 20 μl pro Probe bei Verwendung von Deckgläsern. Verwenden Sie die folgenden Kombinationen: Esel Anti-Maus minus mit Esel Anti-Ziege plus; Esel Anti-Maus minus mit Esel Anti-Kaninchen plus.
2. Klopfen Sie die primäre Antikörperlösung ab. 1x mit TBS-T (50 mM Tris pH 7,5, 150 mM NaCl, 0,05% Tween-20) waschen. 3x für je 5 min mit TBS-T bei Raumtemperatur waschen. Führen Sie eine zusätzliche Wäsche mit TBS-T durch.
3. Abklopfen Sie ab und fügen Sie die PLA-Sondenlösung mit 10 μl für die Platten und 20 μl für die Deckgläser hinzu. In der vorgeheizten Feuchtigkeitskammer bei 37 °C 1 h inkubieren.

7. Ligatur

HINWEIS: Warten Sie mit der Zugabe von Ligase bis unmittelbar, bevor Sie es zu den Proben hinzufügen. Die Ligase muss in einem Gefrierblock (-20 °C) aufbewahrt werden. Entfernen Sie die gesamte Waschlösung, bevor Sie die Ligaselösung hinzufügen. Vermeiden Sie es, die Zellen über einen längeren Zeitraum ohne Lösung zu lassen. Bei der Verwendung von 384-Well-Platten für die 37 °C-Inkubation kann eine langsame Rotation verwendet werden, um die Verteilung der Antikörperlösung zu verbessern.

1. Verdünnen Sie den 5x Ligationspuffer in hochreinem Wasser. Bereiten Sie 10 μl pro Vertiefung vor, wenn Sie 384-Well-Platten verwenden, oder 20 μl, wenn Sie Deckgläser verwenden.
2. Klopfen Sie die PLA-Sondenlösung ab. 1x mit TBS-T waschen. Anschließend drei weitere Wäschen von jeweils 5 Minuten Dauer mit TBS-T. Waschen Sie ein letztes Mal und klopfen Sie das TBS-T ab, bevor Sie zum nächsten Schritt übergehen.
3. Geben Sie Ligase bei 1:40 zur 1x Ligationslösung, unmittelbar bevor Sie sie auf die Proben auftragen. In der vorgeheizten Feuchtigkeitskammer bei 37 °C 30 min bis 1 h inkubieren.

8. Amplifikation und Waschen

HINWEIS: Warten Sie mit der Zugabe der Polymerase bis unmittelbar vor der Zugabe zur Probe. Der Verstärkungspuffer ist lichtempfindlich; Schützen Sie alle Lösungen, die den Puffer enthalten, vor Licht. Die Polymerase muss in einem Gefrierblock (-20 °C) aufbewahrt werden. Vermeiden Sie es, die Zellen über einen längeren Zeitraum ohne Lösung zu lassen. Bei der Verwendung von 384-Well-Platten für eine Inkubation bei 37 °C kann eine langsame Rotation die Verteilung der Antikörperlösung verbessern.

1. Entfernen Sie die gesamte Waschlösung vollständig, bevor Sie die Polymeraselösung hinzufügen. Vermeiden Sie es, die Zellen über einen längeren Zeitraum ohne Lösung zu lassen. Verdünnen Sie den 5x Amplifikationspuffer in hochreinem Wasser. Bereiten Sie 10 μl pro Vertiefung vor, wenn Sie 384-Well-Platten verwenden, oder 20 μl, wenn Sie Deckgläser verwenden.
2. Klopfen Sie die Ligaturlösung ab. 1x mit TBS-T waschen. Anschließend drei weitere Wäschen von jeweils 5 Minuten Dauer mit TBS-T. Waschen Sie ein letztes Mal und klopfen Sie das TBS-T ab, bevor Sie zum nächsten Schritt übergehen.
3. Geben Sie die Polymerase in die 1x-Amplifikationslösung in einer Verdünnung von 1:80, unmittelbar bevor Sie sie auf die Proben auftragen. In der vorgeheizten Feuchtigkeitskammer bei 37 °C 100 min inkubieren.
   HINWEIS: Vermeiden Sie ab diesem Schritt direkte Lichteinwirkung
4. Tippen Sie auf den Verstärkungspuffer. 2x mit 1x SSC-Puffer für je 10 min waschen. 2x mit 0,01x SSC-Puffer für je 2 min waschen.

9. γ-H2AX-Färbung (Immunfluoreszenz - IF)

HINWEIS: Die Beschriftung von γ-H2AX erfolgt nach Fertigstellung des PLA.

1. Primäre Antikörper-Inkubation (IF)
   1. Verdünnen Sie die Primärantikörper (Kaninchen anti yH2AX bei 1:100) in Blockierungslösung (alternativ können 3% Rinderserumalbumin und Triton X-100 0,1% in PBS-Lösung verwendet werden). Bereiten Sie 30 μl Antikörperlösung pro Vertiefung vor, wenn Sie Deckgläser verwenden, oder 20 μl, wenn Sie eine 384-Well-Platte verwenden.
   2. Klopfen Sie die 0,01x SSC-Lösung ab. 2x mit PBS waschen.
   3. Geben Sie die primäre Antikörperlösung in jede Vertiefung. 1 h bei Raumtemperatur inkubieren.
2. Sekundäre Antikörper-Inkubation (IF)
   HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass die ausgewählten Sekundärantikörper die PLA-Antikörper oder -Sonden nicht erkennen. Darüber hinaus muss sich die Wellenlänge des Sekundärantikörpers von der Wellenlänge des PLA-Nachweisreagenzes unterscheiden. Zum Beispiel: Unser PLA-Nachweisreagenz enthält das Fluorophor 647, und die Sekundärreagenz, die wir für den γ-H2AX-Nachweis verwendet haben, ist 488.
   1. Verdünnen Sie die Sekundärantikörper (Esel, Anti-Kaninchen, Alexa, Fluor 488) in Blockierungslösung (alternativ können 3 % Rinderserumalbumin und Triton X - 100 0,1 % in PBS-Lösung verwendet werden) bei einer Verdünnung von 1:300. Bereiten Sie 30 μl Antikörperlösung pro Bedingung vor, wenn Sie Deckgläser verwenden, oder 20 μl pro Well, wenn Sie eine 384-Well-Platte verwenden. Zugabe des Farbstoffs Hoechst 33342 in einer Endkonzentration von 0,6 μg/ml.
   2. Klopfen Sie die primäre Antikörperlösung ab. 3x mit TBS-T waschen.
   3. Geben Sie die sekundäre Antikörperlösung in jede Vertiefung. 20 min bei Raumtemperatur inkubieren.
   4. 5x mit TBS-T waschen. 2x mit 1x SSC-Puffer waschen. 2x mit 0,01x SSC-Puffer waschen.
      HINWEIS: Zu diesem Zeitpunkt können die Platten mehrere Wochen bei 4 °C (in SSC 0,01X) lichtgeschützt gelagert werden. Bei Verwendung von Deckgläsern können die Dias montiert werden, und nach 1 Tag können die Dias bei -20 °C gelagert werden.

10. Bilderfassung

1. Verwenden Sie ein herkömmliches Fluoreszenzmikroskop und das 63x Objektiv. Bestimmen Sie die Expositionszeit, indem Sie Negativ- und Positivkontrollen vergleichen, um Sättigung und Punktkollabieren zu vermeiden.
   HINWEIS: Die Verwendung von konfokalen Mikroskopen verbessert die Erkennung von PLA-Punkten. Das 20x-Objektiv kann auch verwendet werden, um die Anzahl der detektierten Kerne zu erhöhen.
2. Sobald die Belichtungszeit eingestellt ist, führen Sie alle Erfassungen von PLA-Punkten mit denselben Parametern durch. Versuchen Sie, Bilder aus verschiedenen Vertiefungs- oder Deckglasregionen aufzunehmen, um Artefakte aufgrund inhomogener Inkubation zu vermeiden.
3. Speichern Sie alle Kanäle mit demselben Namensmuster. Wenn das Mikroskop Fotos in den Kanälen separat aufnimmt, speichern Sie die entsprechenden Bilder mit demselben Namen, und fügen Sie nur PLA oder Nucleus am Anfang des Dateinamens hinzu, um den Kanal zu unterscheiden.

11. Bildanalyse

HINWEIS: Für die Analyse von Punkten pro Zellkern in Bild J/FIJI¹⁷ wurde ein Makro erstellt, das mit Mikroskopen verwendet werden kann, bei denen die Skaleninformationen manuell hinzugefügt werden müssen. Die Pixelgröße für das verwendete Objektiv muss bekannt sein. Legen Sie die Bilder für jeden Kanal in verschiedenen Ordnern ab (Ergänzende Codierungsdatei 1, Ergänzende Abbildung 1).
HINWEIS: Das Makro berücksichtigt separat erhaltene Fluoreszenzkanäle. In diesem Fall ist es wichtig, alle Bilder mit demselben Namen zu speichern.

1. Das Makro ermöglicht die Auswahl eines bestimmten Bereichs im Feld. Verwenden Sie die Option ROI auswählen , wenn ein Bereich im Bild Artefakte aufweist, die sich nachteilig auf die Analyse auswirken können. Wählen Sie zu Beginn der Analyse ROI und verwenden Sie es für alle Bilder.
   HINWEIS: Dies ist eine optionale Funktion. Wenn diese Option nicht ausgewählt ist, wird das gesamte Bild in die Analyse einbezogen (Ergänzende Abbildung 2).
2. Die ROI-Datei sollte vor der Verwendung des Makros erstellt werden, wie unten beschrieben. Verwenden Sie für die ROI-Auswahl ein Rechteck-Tool, wählen Sie den Bereich für die Analyse aus und fügen Sie ihn dem ROI-Manager hinzu, indem Sie auf > Auswahl bearbeiten> Zum Manager hinzufügen klicken. Speichern Sie den ROI, indem Sie auf Mehr> Speichern klicken.
3. Öffnen Sie in ImageJ ¹⁷ Bilder aus verschiedenen Bedingungen, um die Parameter für die Analyse anzupassen. Diese Parameter müssen vom Benutzer ermittelt und zusammen mit den Daten im Makroprogramm (Supplementary Coding File 1) angegeben werden
   1. Hintergrundkorrektur: Um den Hintergrund zu entfernen, klicken Sie auf Verarbeiten> Hintergrund subtrahieren. Testen Sie unterschiedliche Rollkugelradien mit der Vorschaufunktion). Wir haben das Walzen von 10 für PLA-Punkte und das Walzen von 100 für den Kern verwendet.
   2. Entfernen Sie Rauschen, indem Sie auf Prozess > Rauschen > Flecken entfernen klicken. Verwenden Sie für den Kern die Funktion Glätten, um die Füllung des Kerns zu verbessern, indem Sie auf Prozess>Glätten klicken.
   3. Schwellenwert anpassen: Konvertieren Sie in ein 8-Bit-Bild und passen Sie den Schwellenwert an, indem Sie auf Bild > Typ > 8 Bit und Bild > >Schwellenwert anpassen) klicken. Passen Sie den Schwellenwert entsprechend an, um alle im Bild vorhandenen Kerne oder Punkte zu visualisieren, aber eine Übersättigung und das Zusammenbrechen von Strukturen zu vermeiden. Notieren Sie sich die Werte und testen Sie in verschiedenen Bildern, um zu überprüfen, ob der Schwellenwert für verschiedene Bilder funktioniert.
   4. In Maske konvertieren, indem Sie auf Verarbeiten > Binär > In Maske konvertieren klicken. Klicken Sie im Fall des Kerns auf Prozess > Binär > Löcher füllen und dann auf Prozess > Binär > Wassereinzugsgebiet. Klicken Sie bei den PLA-Punkten auf Process > Binary > Watershed.
   5. Um Kerne zu zählen, messen Sie die Fläche oder Länge der verschiedenen Kerne, um die durchschnittliche Größe zu schätzen. Verwenden Sie einen ungefähren Wert, um Partikel zu analysieren. Klicken Sie auf "Analysieren" > "Partikel analysieren" und wählen Sie dann "Größe einstellen: 15-unendlich" (diese Werte hängen von der Größe der Kerne ab). Aktivieren Sie die folgenden Optionen: Anzeigen: Maske; Ergebnisse anzeigen; Klare Ergebnisse; Zusammenfassen; Zum Manager hinzufügen; An Kanten ausschließen.
   6. Um PLA-Punkte zu zählen, messen Sie die Fläche oder den Radius der Punkte, um die durchschnittliche Größe zu schätzen. Wählen Sie Apply Nucleus Mask (Apply Mask ist eine Funktion des GDSC-Plugins, prüfen Sie, ob sie installiert ist), gefolgt von Analyze > Analyze Particles und Set. 0,02-3 (diese Werte hängen von der Größe der Kerne ab). Aktivieren Sie die folgenden Optionen: Anzeigen: Maske; Ergebnisse anzeigen; Klare Ergebnisse; Zusammenfassen; Zum Manager hinzufügen; An Kanten ausschließen.
4. Die Ergebnisse zeigen die Anzahl der Punkte pro Kern in jedem im Bild vorhandenen Kern. Speichern Sie diese Daten.

12. Visualisieren der zusammengefügten Bilder

1. Öffnen Sie die Kanäle für PLA, Nucleus und γ-H2AX. Subtrahieren Sie den Hintergrund und entfernen Sie das Rauschen, wie in den Schritten 11.4.1 und 11.4.2 für alle Bilder beschrieben.
2. Passen Sie Helligkeit und Kontrast automatisch oder manuell an, indem Sie denselben Wert für alle Bedingungen desselben Kanals verwenden. Wählen Sie Bild > Passen Sie > Helligkeit/Kontrast an.
3. Kombinieren Sie Bilder (Zusammenführen), indem Sie Bild > Farbe > Kanäle zusammenführen auswählen. Fügen Sie eine Maßstabsleiste hinzu, indem Sie > Tools analysieren > Maßstabsleiste auswählen. Speichern unter. TIFF-Datei.

Ergebnisse

Wir haben eine Nek4-Ku70-Wechselwirkung in Abwesenheit einer Etoposidbehandlung beobachtet. Diese Wechselwirkung kann jedoch auch außerhalb des Zellkerns stattfinden (Abbildung 1A). Die Nek4-Ku70-Wechselwirkung nimmt nach DNA-Schäden zu und konzentriert sich im Zellkern (Abbildung 1A). Im Fall der Nek5-Topoisomerase II β (TOPIIβ)-Interaktion, die in diesem Assay als Positivkontrolle auf der Grundlage von Literaturergebnissen...

Diskussion

Die Daten zeigen, dass die gleichzeitige Verwendung von PLA mit einem DNA-geschädigten Marker die meisten Informationen in einem DNA-Schadensantwort-Profiling liefern kann, das das räumliche und zeitliche Verhalten der Interaktion nach der Beleidigung zeigt. PLA ist eine vielseitige Methode, die zur Identifizierung der Dimerisierung, zur Bestimmung des Kontakts von Organellen, zur Protein-Nukleinsäure-Interaktion und hauptsächlich zur Protein-Protein-Interaktion verwendet wurde 10,11...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Black 384-well plates	Perkin Elmer Cell carrier plates
Donkey  anti- Rabbit Alexa Fluor 488	Invitrogen	A21206	1:300
Duo link Donkey anti Mouse Minus	Sigma	DUO92004
Duolink antibody diluent	Sigma	DUO82008
Duolink blocking solution 1X	Sigma	DUO82007
Duolink Detection reagent Far red	Sigma	DUO92013
Duolink Donkey anti goat plus	Sigma	DUO92003
Duolink Donkey anti rabbit plus	Sigma	DUO92002
Etoposide	Sigma	E1383
Goat anti Nek4	Santa Cruz Biotechnology	SC-5517	goat anti Nek4 was used at 1:50 dilution
Hoechst 33342	Thermo	H1399	0.6 µg/mL
Leica DMI microscope	Leica
Mouse anti Ku70	Thermo	MA5-13110	mouse anti Ku70 was used at 1:100 dilution
Mouse anti TOPIIβ	Santa Cruz Biotechnology	SC-365071	1:25
Rabbit anti Nek5	Santa Cruz Biotechnology	SC-84527	1:25
Rabbit anti Y H2AX	Cell Signalling	9718S	1:100 dilution
U2OS cell line	ATCC	HTB-96