Proximity-Liganden-Assay zur Lokalisierung von Proteinen in DNA-Schadensstellen

Zusammenfassung

Hier stellen wir ein einfaches und schnelles Protokoll für den Nachweis von Proteininteraktionen an DNA-Schadensstellen vor.

Zusammenfassung

Die DNA-Schadensantwort ist ein genetischer Informationsschutz, der Zellen davor schützt, beschädigte DNA aufrechtzuerhalten. Die Charakterisierung der Proteine, die in diesem Prozess zusammenarbeiten, ermöglicht die Identifizierung alternativer Ziele für therapeutische Eingriffe bei verschiedenen Krankheiten wie Krebs, altersbedingten Krankheiten und chronischen Entzündungen. Der Proximity Ligand Assay (PLA) hat sich als Werkzeug zur Abschätzung der Wechselwirkung zwischen Proteinen sowie der räumlichen Nähe zwischen Organellen oder zellulären Strukturen herauskristallisiert und ermöglicht die zeitliche Lokalisierung und Co-Lokalisationsanalyse unter Stressbedingungen. Die Methode ist einfach, da sie der herkömmlichen Immunfluoreszenz ähnelt und die gleichzeitige Färbung eines Organellen, einer zellulären Struktur oder eines spezifischen Markers wie Mitochondrien, endoplasmatisches Retikulum, PML-Körper oder DNA-Doppelstrangmarker, yH2AX, ermöglicht. Die Phosphorylierung des S139 an der Histon-2A-Variante, H2AX, damals als yH2AX bezeichnet, wird häufig als sehr empfindlicher und spezifischer Marker für DNA-Doppelstrangbrüche verwendet. Jeder Fokus der yH2AX-Färbung entspricht einem Bruch in der DNA, der einige Minuten nach der Schädigung auftritt. Die Analyse von Veränderungen in yH2AX-Foki ist der gebräuchlichste Assay, um zu untersuchen, ob das Protein von Interesse an der DNA-Schadensantwort (DDR) beteiligt ist. Unabhängig davon, ob eine direkte Rolle an der DNA-Schadensstelle erwartet wird, wird die Fluoreszenzmikroskopie verwendet, um die Kolokalisation des interessierenden Proteins mit yH2AX-Herden zu verifizieren. Abgesehen von den neuen superauflösenden Fluoreszenzmethoden kann die lokale Interaktion mit DNA-Schadensstellen jedoch ein wenig subjektiv sein. Hier zeigen wir einen Assay zur Bewertung der Lokalisierung von Proteinen im DDR-Signalweg unter Verwendung von yH2AX als Marker für die Schädigungsstelle. Dieser Assay kann verwendet werden, um die zeitliche Lokalisation unter verschiedenen Beleidigungen zu charakterisieren, die DNA-Schäden verursachen.

Einleitung

Zelluläre DNA-Schäden treten täglich aufgrund der spontanen chemischen Reaktionen auf und werden auch durch exogene Faktoren wie genotoxische Wirkstoffe (Strahlung und Chemikalien wie Etoposid) und oxidativen Stress verstärkt ^1,2,3. Die Zellen verfügen über eine komplexe Maschinerie, die eine Vielzahl verschiedener Arten von DNA-Schäden korrigiert, von der Entfernung von Basen über die replikative Gabeltorsion bis hin zur Unterbrechung der schädlichsten Läsion: dem DNA-Doppelstrangbruch ^4,5....

Protokoll

1. Beschichtung der Zelle

HINWEIS: Zellen können in mikroskopisch kleinen Fluoreszenz-Objektträgern, -Kammern oder -Platten ausgesät werden. Die Verwendung von kleinen Deckgläsern oder 96/384-Well-Platten wird empfohlen, um mehrere Bedingungen und Ersatzreagenzien zu testen. Die Verwendung von Deckgläsern ist bei Zelllinien ratsam, die sich leicht ablösen, wie z.B. HEK293-Zellen. Die Deckgläser können zuvor mit einer Poly-L-Lysin-Lösung beschichtet werden, um die Befestigung zu verbessern.

1. Plattenzellen, die ein Fahrzeug, technische Kontrollen und biologische Kontrollen berücksich....

Diskussion

Die Daten zeigen, dass die gleichzeitige Verwendung von PLA mit einem DNA-geschädigten Marker die meisten Informationen in einem DNA-Schadensantwort-Profiling liefern kann, das das räumliche und zeitliche Verhalten der Interaktion nach der Beleidigung zeigt. PLA ist eine vielseitige Methode, die zur Identifizierung der Dimerisierung, zur Bestimmung des Kontakts von Organellen, zur Protein-Nukleinsäure-Interaktion und hauptsächlich zur Protein-Protein-Interaktion verwendet wurde 10,11.......

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Black 384-well plates	Perkin Elmer Cell carrier plates
Donkey  anti- Rabbit Alexa Fluor 488	Invitrogen	A21206	1:300
Duo link Donkey anti Mouse Minus	Sigma	DUO92004
Duolink antibody diluent	Sigma	DUO82008
Duolink blocking solution 1X	Sigma	DUO82007
Duolink Detection reagent Far red	Sigma	DUO92013
Duolink Donkey anti goat plus	Sigma	DUO92003
Duolink Donkey anti rabbit plus	Sigma	DUO92002
Etoposide	Sigma	E1383
Goat anti Nek4	Santa Cruz Biotechnology	SC-5517	goat anti Nek4 was used at 1:50 dilution
Hoechst 33342	Thermo	H1399	0.6 µg/mL
Leica DMI microscope	Leica
Mouse anti Ku70	Thermo	MA5-13110	mouse anti Ku70 was used at 1:100 dilution
Mouse anti TOPIIβ	Santa Cruz Biotechnology	SC-365071	1:25
Rabbit anti Nek5	Santa Cruz Biotechnology	SC-84527	1:25
Rabbit anti Y H2AX	Cell Signalling	9718S	1:100 dilution
U2OS cell line	ATCC	HTB-96