Ensayo de ligando de proximidad para localizar proteínas en sitios de daño en el ADN

Resumen

Aquí, presentamos un protocolo simple y rápido para la detección de la interacción de proteínas en sitios de daño en el ADN.

Resumen

La respuesta al daño del ADN es una salvaguarda de la información genética que protege a las células de perpetuar el ADN dañado. La caracterización de las proteínas que cooperan en este proceso permite la identificación de dianas alternativas para la intervención terapéutica en varias enfermedades, como el cáncer, las enfermedades relacionadas con el envejecimiento y la inflamación crónica. El ensayo de ligando de proximidad (PLA) surgió como una herramienta para estimar la interacción entre proteínas, así como la proximidad espacial entre orgánulos o estructuras celulares, y permite el análisis de localización temporal y colocalización en condiciones de estrés, por ejemplo. El método es sencillo porque es similar a la inmunofluorescencia convencional y permite la tinción de un orgánulo, una estructura celular o un marcador específico como mitocondrias, retículo endoplásmico, cuerpos PML o marcador de doble cadena de ADN, yH2AX simultáneamente. La fosforilación de la S139 en la variante de la histona 2A, H2AX, entonces conocida como yH2AX, se utiliza ampliamente como un marcador muy sensible y específico de las roturas de doble cadena del ADN. Cada foco de tinción de yH2AX corresponde a una rotura en el ADN que se produce unos minutos después del daño. El análisis de cambios en los focos de yH2AX es el ensayo más común para estudiar si la proteína de interés está implicada en la respuesta al daño del ADN (DDR). Ya sea que se espere un papel directo en el sitio de daño del ADN, se utiliza la microscopía de fluorescencia para verificar la colocalización de la proteína de interés con los focos yH2AX. Sin embargo, a excepción de los nuevos métodos de fluorescencia de superresolución, para concluir, la interacción local con los sitios de daño en el ADN puede ser un poco subjetiva. Aquí, mostramos un ensayo para evaluar la localización de proteínas en la vía DDR utilizando yH2AX como marcador del sitio de daño. Este ensayo se puede utilizar para caracterizar la localización temporal bajo diferentes agresiones que causan daño en el ADN.

Introducción

El daño en el ADN celular ocurre diariamente debido a las reacciones químicas espontáneas y también se incrementa por factores exógenos como agentes genotóxicos (radiación y químicos como el etopósido) y estrés oxidativo ^1,2,3. Las células cuentan con una compleja maquinaria que corrige una miríada de diferentes tipos de daño en el ADN, desde la eliminación de bases hasta la torsión o interrupción replicativa de la horquilla y la lesión más deletérea: la rotura de doble cadena de ADN ^4,5.

Ya se han caracterizado varias proteínas que participan en la DDR, y excelentes revisiones exploran las vías de unión final no homóloga (NHEJ) y recombinación homóloga (HR), las principales vías implicadas en la reparación de roturas de doble cadena (DSB) ^5,6. La fosforilación de la variante de la histona H2A, H2AX, en la serina 139 (a partir de entonces denominada y-H2AX) se ha utilizado durante muchos años como un marcador sensible y fiable de la rotura de la doble cadena. La fosforilación de H2AX se observa en los primeros minutos después del daño y puede persistir durante horas⁷.

La ventaja de utilizar la detección por inmunofluorescencia de focos de γ-H2AX es la caracterización de la distribución temporal y espacial de los focos, así como su co-tinción con otras proteínas. Además, la inmunofluorescencia no requiere lisis, lo que preserva la información del contexto celular y la hace más informativa. Además, como γ-H2AX se forma de novo, no está presente en abundancia en ausencia de daño en el ADN, lo que lo convierte en un marcador específico⁷.

El H2AX es fosforilado principalmente por la proteína quinasa ataxia-telangiectasia mutada (ATM) y la proteína quinasa dependiente del ADN (DNA-PK), los sensores de los DSB. Ku70/80 (XRCC6 X-ray repair cross-complimenting 6/ XRCC5 X-ray repair cross-supplementing 5) y la subunidad catalítica ADN-proteína quinasa (DNA-PKcs) son responsables de la identificación de DSB y la protección de los extremos del ADN, mientras que Artemis lleva a cabo el procesamiento final para facilitar la ligadura por el complejo XRCC4-Ligase IV. La fosforilación de H2AX en los sitios que flanquean a los DSB actúa como una señal para el reclutamiento de varias proteínas de reparación y señala la detención, muerte o supervivencia del ciclo celular⁸.

El análisis de cambios en los focos y-H2AX es el ensayo más común para estudiar si la proteína de interés está implicada en la respuesta al daño del ADN. Ya sea que se espere un papel directo en el sitio de daño del ADN, se utiliza la microscopía de fluorescencia para verificar la colocalización de la proteína de interés con los focos y-H2AX. Sin embargo, a excepción de los nuevos métodos de fluorescencia de superresolución, concluir la interacción local con los sitios de daño en el ADN puede ser complicado. Además, la detección de inmunofluorescencia generalmente depende de muchas moléculas de proteínas en el sitio de daño del ADN, lo que dificulta la identificación de proteínas escasas⁹.

Aquí, mostramos un ensayo para evaluar la localización de proteínas involucradas en la vía DDR utilizando y-H2AX como marcador del sitio de daño. Este ensayo se puede utilizar para caracterizar la localización temporal bajo diferentes agresiones que causan daño en el ADN.

El Ensayo de Ligando de Proximidad (PLA) surgió como una herramienta para estimar la interacción entre proteínas, así como la proximidad espacial entre orgánulos o estructuras celulares^10,11 y permite el análisis de localización temporal y colocalización en condiciones de estrés, por ejemplo. El método es sencillo porque es similar a la inmunofluorescencia convencional y permite la tinción simultánea de marcadores específicos de orgánulos o estructuras celulares, como mitocondrias, retículo endoplásmico, cuerpos PML o marcador de doble cadena de ADN, yH2AX. El uso de PLA permite identificar la interacción de proteínas durante el daño en el ADN de una manera sensible, específica y confiable que se puede utilizar para monitorear la interacción durante el ciclo celular, en respuesta a diferentes estímulos y en diferentes momentos después del estrés genotóxico.

Aquí mostramos el uso de PLA concomitantemente con la inmunofluorescencia convencional γ-H2AX para localizar la interacción Nek4-Ku70 después del daño en el ADN inducido por etopósido. Nek4, un miembro de la familia Nek (quinasas relacionadas con NIMA), no tiene un papel claro en la respuesta al daño del ADN. En 2012, Nguyen y sus colegas demostraron que Nek4 interactúa con las proteínas Ku70/Ku80, y en ausencia de Nek4, estas proteínas no se reclutan en el sitio de daño del ADN, y la fosforilación de H2AX^{se ve} afectada. La localización celular de esta interacción es desconocida hasta el momento. Hemos observado una reducción en la fosforilación de Ku70 en células que expresan el mutante¹³muerto de la quinasa Nek4, pero aún no se ha dilucidado si Nek4 fosforila directamente Ku70. Teniendo en cuenta que la interacción de Nek4 con Ku70 se incrementa tras el tratamiento con etopósido según los estudios de inmunoprecipitación¹², intentamos localizar esta interacción utilizando PLA y el marcador γ-H2AX.

Por lo general, los estudios de interacción se basan en ensayos de inmunoprecipitación, pero estos son in vitro y no proporcionan información sobre la ubicación de la interacción. Cuando sea posible, se puede realizar una inmunoprecipitación de células fraccionadas (núcleo, mitocondrial, membrana celular o citosol), pero realizar un curso temporal de la interacción es costoso y laborioso. La inmunofluorescencia puede dar información sobre la localización celular de las proteínas, pero probar la interacción puede ser difícil y depende de la resolución de los microscopios. Aquí, mostramos la ventaja de usar el ensayo de ligando de proximidad para monitorear la interacción de dos proteínas en un contexto de daño en el ADN.

Protocolo

1. Recubrimiento de celdas

NOTA: Las células se pueden sembrar en portaobjetos, cámaras o placas de fluorescencia microscópica. Se recomienda el uso de cubreobjetos pequeños o placas de pocillos de 96/384 para probar múltiples condiciones y reactivos de repuesto. El uso de cubreobjetos es aconsejable para líneas celulares que se desprenden fácilmente, como las células HEK293. Los cubreobjetos se pueden recubrir previamente con una solución de poli-L-lisina para mejorar la fijación.

1. Celdas de placa considerando un vehículo, controles técnicos y controles biológicos. Utilice réplicas técnicas a dos o tres pozos por condición.
   NOTA: El uso de control técnico (tanto secundario como uno primario) es obligatorio. Si es posible, también se debe incluir el control biológico (por ejemplo, sobreexpresión o eliminación de una de las proteínas objetivo o una condición que se sabe que cambia la interacción).
   1. Cultivo de células U2OS en el Medio Eagle Modificado (DMEM) de Dulbecco suplementado con 10% de Suero Fetal Bovino (FBS), 4,5 g/L de glucosa y 4 mM de L-Glutamina en placas tratadas con cultivo de tejidos a 37 °C con 5% de CO₂ y una atmósfera humidificada que contiene un 90% de aire. Dependiendo del número de condiciones a probar y si se utiliza un 384 o cubreobjetos en una placa de 60 mm, comience con una placa de 60 o 100 mm, respectivamente.
   2. Cuando las células alcanzan el 60%-70% de confluencia, divida las células utilizando tripsina-EDTA ¹⁴ al 0,25%. Recuento de células utilizando una cámara de Neubauer o un contador automático¹⁴. Placa de 4 x 10⁵ celdas en placa de 60 mm que contiene múltiples cubreobjetos redondos de 13 mm o 4 x 10⁵ celdas por pocillo en placa (s) de 384 pocillos e incubar durante 12 a 24 horas a 37 °C en una incubadora humidificada con 5% de CO₂ .

2. Preparación de soluciones

NOTA: La concentración y los tiempos del tratamiento fueron elegidos con base en los resultados de la literatura, que señalan la activación de las vías de reparación del daño en el ADN^15,16.

1. Prepare la solución madre de etopósido a una concentración de 50 mM en DMSO. La solución madre puede mantenerse a -20 °C durante varios meses. Diluir la solución de etopósido para su uso en el medio de cultivo completo a una concentración final de 25 μM. Utilice DMSO al 0,05% diluido en el medio de cultivo completo como control del vehículo.
2. Prepare 20 veces citrato de sodio salino (SSC; 3.0 M NaCl, 0.30 M citrato trisódico pH 7.0). Esta solución puede conservarse durante varios meses a 4 °C.

3. Tratamiento y fijación celular

NOTA: No permita que las células se sequen en ningún momento; Trate de aprovechar las soluciones anteriores tanto como sea posible. Previamente se debe determinar el método adecuado para la fijación celular (metanol helado o paraformaldehído (PFA) al 4%, así como la dilución de anticuerpos, mediante un experimento de inmunofluorescencia convencional.

PRECAUCIÓN: El metanol debe desecharse correctamente.

1. Retire el medio de cultivo de los pocillos y agregue un medio de cultivo que contenga etopósido o DMSO a 25 μM o 0,05%, respectivamente. Incubar las células a 37 °C con 5% de CO₂ y una atmósfera humidificada que contenga un 90% de aire con etopósido o DMSO durante 3 períodos de tiempo diferentes: 20 min, 1 h y 3 h. Cuando se utilizan placas 384, todas las condiciones deben fijarse simultáneamente.
   1. Para esto, comience por tratar la afección con el tiempo de tratamiento más largo, como 3 h. Después de 2 h, trate la condición de tratamiento de 1 h, y cuando queden 20 minutos para la fijación, trate la condición de 20 min. Después de esto, todas las condiciones se pueden fijar al mismo tiempo.
2. Retire el medio de los pocillos y lave las celdas con PBS 3x.
3. Fije las celdas agregando metanol helado con suficiente volumen para cubrir la superficie del pocillo. Incubar durante 10 min a -20 °C. Lave los pocillos con PBS 3x.
   NOTA: En este punto, el protocolo se puede pausar. Las placas se pueden almacenar a 4 °C durante 1 semana.

4. Permeabilización y bloqueo

NOTA: Si se utiliza el método de fijación de PFA, se debe realizar un paso de bloqueo con glicina antes de la permeabilización. La cámara de humedad se puede preparar colocando una bandeja de agua dentro de la incubadora, lo que da como resultado una humedad de alrededor del 95%. La placa o portaobjetos 384 se puede incubar en un recipiente de plástico cerrado sobre papel de filtro o esponja humedecida y película transparente.

1. Toque el PBS de las muestras.
2. Añadir 30-40 μL de tampón de permeabilización (0,2% Triton X-100 en PBS) e incubar durante 20 min a temperatura ambiente. Lavar 3 veces con PBS
3. Extraiga el PBS de las muestras y agregue 30-40 μL de la solución de bloqueo 1x provista en el kit de PLA (alternativamente, se puede usar 3% de albúmina sérica bovina y Triton X-100 0.1% en solución de PBS) a cada pocillo/cubreobjetos.
4. Incubar la placa en una cámara de humedad precalentada a 37 °C durante 1 h.

5. Incubación primaria de anticuerpos (PLA)

NOTA: Si usa cubreobjetos, es importante asegurarse de que la solución de anticuerpos cubra todas las superficies de cubreobjetos. Se debe prestar especial atención a la selección de anticuerpos. Los anticuerpos deben ser de diferentes especies animales, y el anticuerpo secundario utilizado para el γ-H2AX no debe ser contra la especie huésped de la producción de las sondas de PLA. Por ejemplo, los anticuerpos primarios utilizados para el PLA se criaron en ratones y animales caprinos. Las sondas PLA, anti-ratón, y anti-cabra se fabricaron en el burro. El anticuerpo contra el γ-H2AX se produjo en conejos, y el secundario utilizado es el anti-conejo producido en burros. De esta manera, el secundario no reconocerá las sondas PLA.

1. Diluir los anticuerpos primarios (anti-Ku70 1:100 de ratón y anti-Nek4 de cabra 1:50; anti-Nek5 de conejo 1:25 y anti-TOPIIβ 1:25 de ratón) en el diluyente de anticuerpos suministrado en el kit (alternativamente, se puede utilizar albúmina sérica bovina al 3% y Triton X-100 al 0,1% en solución de PBS). Prepare 30 μL de solución de anticuerpos por afección si se usan cubreobjetos o 20 μL por pocillo si se usa una placa de 384 pocillos.
2. Toca la solución de bloqueo. Agregue la solución de anticuerpos primarios a cada pocillo. Incubar a 4 °C durante la noche en una cámara de humedad.

6. Incubación de sondas de PLA

NOTA: Elija las sondas, teniendo en cuenta no solo los anticuerpos primarios, sino también los destinados a su uso en las etapas de inmunofluorescencia. Cuando se utilizan placas de 384 pocillos para una incubación prolongada de 37 °C, se puede utilizar una rotación lenta para mejorar la distribución de la solución de anticuerpos.

1. Diluya las sondas menos y más 1:5 en el diluyente de anticuerpos. Prepare 10 μL por pocillo si se utilizan placas de 384 pocillos o 20 μL por muestra si se utilizan cubreobjetos. Utilice las siguientes combinaciones: Burro anti-ratón menos con Burro anti-cabra plus; Burro anti-ratón minus con Burro anti-conejo plus.
2. Retira la solución de anticuerpos primarios. Lavar 1 vez con TBS-T (50 mM Tris pH 7,5, 150 mM de NaCl, 0,05% de Tween-20). Lavar 3 veces durante 5 minutos cada una con TBS-T a temperatura ambiente. Realice un lavado adicional con TBS-T.
3. Golpee y agregue la solución de sonda de PLA con 10 μL para las placas y 20 μL para los cubreobjetos. Incubar en la cámara de humedad precalentada a 37 °C durante 1 h.

7. Ligadura

NOTA: Espere para agregar Ligase hasta inmediatamente antes de agregarlo a las muestras. La ligasa debe conservarse en un bloque de congelación (-20 °C). Retire completamente toda la solución de lavado antes de agregar la solución de ligasa. Evite dejar las células sin solución durante largos períodos de tiempo. Cuando se utilizan placas de 384 pocillos para la incubación a 37 °C, se puede utilizar una rotación lenta para mejorar la distribución de la solución de anticuerpos.

1. Diluya el tampón de ligadura 5x en agua de alta pureza. Prepare 10 μL por pocillo si usa placas de 384 pocillos o 20 μL si usa cubreobjetos.
2. Golpee la solución de sonda de PLA. Lavar 1 vez con TBS-T. Siga con tres lavados adicionales, cada uno de 5 minutos, usando TBS-T. Lávese por última vez y retire el TBS-T antes del siguiente paso.
3. Añada ligasa a la solución de ligadura 1x a 1:40, inmediatamente antes de aplicarla a las muestras. Incubar en la cámara de humedad precalentada a 37 °C durante 30 min a 1 h.

8. Amplificación y lavado

NOTA: Espere para agregar la polimerasa hasta inmediatamente antes de la adición a la muestra. El tampón de amplificación es sensible a la luz; Proteja de la luz todas las soluciones que contengan el tampón. La polimerasa debe conservarse en un bloque de congelación (-20 °C). Evite dejar las células sin solución durante un largo período de tiempo. Cuando se utilizan placas de 384 pocillos para una incubación a 37 °C, la rotación lenta puede mejorar la distribución de la solución de anticuerpos.

1. Retire completamente toda la solución de lavado antes de agregar la solución de polimerasa. Evite dejar las células sin solución durante un largo período de tiempo. Diluya el tampón de amplificación 5x en agua de alta pureza. Prepare 10 μL por pocillo si usa placas de 384 pocillos o 20 μL si usa cubreobjetos.
2. Retira la solución de ligadura. Lavar 1 vez con TBS-T. Siga con tres lavados adicionales, cada uno de 5 minutos, usando TBS-T. Lávese por última vez y retire el TBS-T antes del siguiente paso.
3. Añadir la polimerasa a la solución de amplificación 1x con una dilución de 1:80, inmediatamente antes de aplicarla a las muestras. Incubar en la cámara de humedad precalentada a 37 °C durante 100 min.
   NOTA: A partir de este paso, evite la exposición directa a la luz
4. Toque el búfer de amplificación. Lavar 2 veces con 1 tampón SSC durante 10 minutos cada una. Lavar 2 veces con tampón SSC 0.01x durante 2 minutos cada una.

9. Tinción de γ-H2AX (inmunofluorescencia - IF)

NOTA: El etiquetado de γ-H2AX se realiza una vez finalizado el PLA.

1. Incubación primaria de anticuerpos (IF)
   1. Diluir los anticuerpos primarios (Rabbit anti yH2AX a 1:100) en solución bloqueante (alternativamente, se puede utilizar albúmina sérica bovina al 3% y Triton X-100 al 0,1% en solución de PBS). Prepare 30 μL de solución de anticuerpos por pocillo si usa cubreobjetos o 20 μL si usa una placa de 384 pocillos.
   2. Toque la solución SSC 0.01x. Lavar 2 veces con PBS.
   3. Agregue la solución de anticuerpos primarios a cada pocillo. Incubar a temperatura ambiente durante 1 h.
2. Incubación secundaria de anticuerpos (IF)
   NOTA: Asegúrese de que los anticuerpos secundarios elegidos no reconozcan los anticuerpos o las sondas de PLA. Además, la longitud de onda del anticuerpo secundario debe ser diferente de la longitud de onda del reactivo de detección PLA. Por ejemplo: nuestro reactivo de detección de PLA contiene el fluoróforo 647, y el secundario que utilizamos para la detección de γ-H2AX es el 488.
   1. Diluir los anticuerpos secundarios (Donkey anti-Rabbit Alexa Fluor 488) en solución bloqueante (alternativamente, se puede usar 3% de albúmina sérica bovina y Triton X - 100 0,1% en solución PBS) a una dilución de 1:300. Prepare 30 μL de solución de anticuerpos por afección si se usan cubreobjetos o 20 μL por pocillo si se usa una placa de 384 pocillos. Añadir el colorante Hoechst 33342 a una concentración final de 0,6 μg/mL.
   2. Retira la solución de anticuerpos primarios. Lavar 3 veces con TBS-T.
   3. Agregue la solución de anticuerpos secundarios a cada pocillo. Incubar a temperatura ambiente durante 20 min.
   4. Lavar 5 veces con TBS-T. Lavar 2 veces con 1 tampón SSC. Lavar 2 veces con tampón SSC 0.01x.
      NOTA: En este punto, las placas pueden almacenarse durante varias semanas a 4 °C (en SSC 0,01X) protegidas de la luz. Si se utilizan cubreobjetos, los portaobjetos se pueden montar y, después de 1 día, los portaobjetos se pueden almacenar a -20 °C.

10. Adquisición de imágenes

1. Utilice un microscopio de fluorescencia convencional y el objetivo de 63x. Determine el tiempo de exposición comparando los controles negativos y positivos para evitar la saturación y el colapso de los puntos.
   NOTA: El uso de microscopios confocales mejora la detección de puntos PLA. El objetivo 20x también se puede utilizar para aumentar el número de núcleos detectados.
2. Una vez ajustado el tiempo de exposición, se realizan todas las adquisiciones de puntos PLA con los mismos parámetros. Trate de adquirir imágenes de diferentes pocillos o regiones de cubreobjetos para evitar artefactos debido a la incubación no homogénea.
3. Guarde todos los canales con el mismo patrón de nombre. Si el microscopio toma fotos en los canales por separado, guarde las imágenes correspondientes con el mismo nombre, agregando solo PLA o Nucleus al principio del nombre del archivo para diferenciar el canal.

11. Análisis de imágenes

NOTA: Se creó una macro para el análisis de puntos por núcleo en la Imagen J/FIJI¹⁷ y para ser utilizada con microscopios donde la información de la escala debe agregarse manualmente. Se debe conocer el tamaño de píxel de la lente del objetivo utilizado. Coloque las imágenes de cada canal en diferentes carpetas (Archivo de codificación suplementario 1, Figura suplementaria 1).
NOTA: La macro considera los canales de fluorescencia obtenidos por separado. En este caso, es importante guardar todas las imágenes con el mismo nombre.

1. La macro permite la selección de una región específica en el campo. Utilice la opción Seleccionar un retorno de la inversión cuando una región de la imagen muestre artefactos que puedan ser perjudiciales para el análisis. Elija el ROI al principio del análisis y utilícelo para todas las imágenes.
   NOTA: Esta es una característica opcional. Si no se selecciona, la imagen completa se considerará en el análisis (Figura complementaria 2).
2. El archivo ROI debe crearse antes del uso de la macro, como se describe a continuación. Para la selección de ROI, use una herramienta de rectángulo, seleccione la región para el análisis y agréguela al administrador de ROI haciendo clic en Editar > selección> Agregar al administrador. Guarde el ROI haciendo clic en Más> Guardar.
3. En la ImageJ ¹⁷, abra imágenes de diferentes condiciones para ajustar los parámetros para el análisis. Estos parámetros deben ser determinados por el usuario y especificados, junto con los datos, en el programa de macros (Archivo de codificación suplementario 1)
   1. Corrección de fondo: Para eliminar el fondo, haga clic en Procesar> Restar fondo. Pruebe diferentes radios de bola rodante usando la función de vista previa). Hemos utilizado el rollo 10 para los puntos PLA y el rollo 100 para el núcleo.
   2. Elimine el ruido haciendo clic en Procesar > ruido > Eliminar manchas. Para el núcleo, utilice la función suave para mejorar el llenado del núcleo haciendo clic en Proceso>Suavizar.
   3. Ajuste del umbral: Convierta en una imagen de 8 bits y ajuste el umbral haciendo clic en Imagen > Escriba > 8 bits y Ajuste de > imagen >Umbral. Ajuste el umbral en consecuencia para visualizar todo el núcleo o puntos presentes en la imagen, pero evitando la sobresaturación y el colapso de estructuras. Tome nota de los valores y pruebe en diferentes imágenes para comprobar si el umbral funciona para diferentes imágenes.
   4. Convertir a máscara haciendo clic en Procesar > binario > Convertir en máscara. En el caso del núcleo, haga clic en Procesar > Binario > Rellenar huecos seguido de Procesar > Binario > Cuenca hidrográfica. En el caso de los puntos PLA, haga clic en Procesar > binario > cuenca hidrográfica.
   5. Para contar los núcleos, mida el área o la longitud de los diferentes núcleos para estimar el tamaño promedio. Utilice un valor aproximado para analizar las partículas. Haga clic en Analizar > Analizar partículas y, a continuación, seleccione Establecer tamaño: 15-infinito (estos valores dependen del tamaño de los núcleos). Marque las siguientes opciones: Mostrar: Máscara; Mostrar resultados; Resultados claros; Resumir; Agregar al Administrador; Excluir en los bordes.
   6. Para contar puntos PLA, mida el área o el radio de los puntos para estimar el tamaño promedio. Seleccione Aplicar máscara de núcleo (aplicar máscara es una función en el complemento GDSC, verifique si está instalado) seguido de Analizar > Analizar partículas y establecer. 0,02-3 (estos valores dependen del tamaño de los núcleos). Marque las siguientes opciones: Mostrar: Máscara; Mostrar resultados; Resultados claros; Resumir; Agregar al Administrador; Excluir en los bordes.
4. Los resultados muestran el número de puntos por núcleo en cada núcleo presente en la imagen. Guarde estos datos.

12. Visualización de las imágenes combinadas

1. Abra los canales correspondientes a PLA, núcleo y γ-H2AX. Reste el fondo y elimine el ruido, como se mencionó en los pasos 11.4.1 y 11.4.2 para todas las imágenes.
2. Ajuste el brillo y el contraste de forma automática o manual utilizando el mismo valor para todas las condiciones desde el mismo canal.  Seleccione Imagen > Ajuste > Brillo/contraste.
3. Combine imágenes (fusionando) seleccionando Imagen > Color > Fusionar canales. Agregue la barra de escala seleccionando Analizar > Herramientas > barra de escala. Guardar como. Archivo TIFF.

Resultados

Hemos observado la interacción Nek4-Ku70 en ausencia de tratamiento con etopósido. Sin embargo, esta interacción puede ocurrir fuera del núcleo (Figura 1A). La interacción Nek4-Ku70 aumenta después del daño en el ADN y se concentra en el núcleo (Figura 1A). En el caso de la interacción Nek5-Topoisomerasa II β (TOPIIβ), utilizada en este ensayo como control positivo con base en los resultados de la literatura

Discusión

Los datos muestran que el uso de PLA concomitantemente a un marcador dañado por el ADN puede proporcionar la mayor cantidad de información en un perfil de respuesta al daño del ADN, mostrando el comportamiento espacial y temporal de la interacción después del insulto. El PLA es un método versátil que se ha utilizado para la identificación de la dimerización, la determinación del contacto de orgánulos, la interacción proteína-ácido nucleico y, princip...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Black 384-well plates	Perkin Elmer Cell carrier plates
Donkey  anti- Rabbit Alexa Fluor 488	Invitrogen	A21206	1:300
Duo link Donkey anti Mouse Minus	Sigma	DUO92004
Duolink antibody diluent	Sigma	DUO82008
Duolink blocking solution 1X	Sigma	DUO82007
Duolink Detection reagent Far red	Sigma	DUO92013
Duolink Donkey anti goat plus	Sigma	DUO92003
Duolink Donkey anti rabbit plus	Sigma	DUO92002
Etoposide	Sigma	E1383
Goat anti Nek4	Santa Cruz Biotechnology	SC-5517	goat anti Nek4 was used at 1:50 dilution
Hoechst 33342	Thermo	H1399	0.6 µg/mL
Leica DMI microscope	Leica
Mouse anti Ku70	Thermo	MA5-13110	mouse anti Ku70 was used at 1:100 dilution
Mouse anti TOPIIβ	Santa Cruz Biotechnology	SC-365071	1:25
Rabbit anti Nek5	Santa Cruz Biotechnology	SC-84527	1:25
Rabbit anti Y H2AX	Cell Signalling	9718S	1:100 dilution
U2OS cell line	ATCC	HTB-96