Ensaio de ligante de proximidade para localizar proteínas em locais de dano ao DNA

Resumo

Aqui, apresentamos um protocolo simples e rápido para a detecção de interação proteica em locais de dano ao DNA.

Resumo

A resposta ao dano do DNA é uma proteção de informação genética que protege as células da perpetuação do DNA danificado. A caracterização das proteínas que cooperam nesse processo permite a identificação de alvos alternativos para intervenção terapêutica em diversas doenças, como câncer, doenças relacionadas ao envelhecimento e inflamação crônica. O Proximity Ligand Assay (PLA) surgiu como uma ferramenta para estimar a interação entre proteínas, bem como a proximidade espacial entre organelas ou estruturas celulares e permite a análise de localização temporal e co-localização em condições de estresse, por exemplo. O método é simples porque é semelhante à imunofluorescência convencional e permite a coloração de uma organela, estrutura celular ou um marcador específico, como mitocôndrias, retículo endoplasmático, corpos PML ou marcador de fita dupla de DNA, yH2AX simultaneamente. A fosforilação do S139 na variante da histona 2A, H2AX, então conhecida como yH2AX, é amplamente utilizada como um marcador muito sensível e específico de quebras de fita dupla de DNA. Cada foco da coloração yH2AX corresponde a uma quebra no DNA que ocorre alguns minutos após o dano. A análise de alterações nos focos de yH2AX é o ensaio mais comum para estudar se a proteína de interesse está implicada na resposta a danos no DNA (DDR). Se um papel direto no local de dano ao DNA é esperado, a microscopia de fluorescência é usada para verificar a colocalização da proteína de interesse com os focos de yH2AX. No entanto, exceto pelos novos métodos de fluorescência de super-resolução, para concluir, a interação local com os locais de dano ao DNA pode ser um pouco subjetiva. Aqui, mostramos um ensaio para avaliar a localização de proteínas na via DDR usando yH2AX como marcador do local do dano. Este ensaio pode ser usado para caracterizar a localização temporal sob diferentes insultos que causam danos ao DNA.

Introdução

O dano ao DNA celular ocorre diariamente devido às reações químicas espontâneas e também é aumentado por fatores exógenos, como agentes genotóxicos (radiação e produtos químicos como o etoposídeo) e estresse oxidativo ^1,2,3. As células possuem um maquinário complexo que corrige uma miríade de diferentes tipos de danos ao DNA, desde a remoção de bases até a torção replicativa do garfo ou interrupção até a lesão mais deletéria: a quebra de fita dupla de DNA ^4,5.

Protocolo

1. Revestimento celular

NOTA: As células podem ser semeadas em lâminas, câmaras ou placas de fluorescência microscópica. O uso de pequenas lamínulas ou placas de 96/384 poços é recomendado para testar várias condições e reagentes sobressalentes. O uso de lamínulas é aconselhável para linhagens celulares que se desprendem facilmente, como as células HEK293. As lamínulas podem ser previamente revestidas com uma solução de poli-L-lisina para melhorar a fixação.

1. Células de placa considerando um veículo, controles técnicos e controles biológicos. Use réplicas técnicas em dois ou três p....

Discussão

Os dados mostram que o uso de PLA concomitantemente a um marcador danificado pelo DNA pode fornecer mais informações em um perfil de resposta a danos no DNA, mostrando o comportamento espacial e temporal da interação após o insulto. O PLA é um método versátil que tem sido utilizado para identificação de dimerização, determinação do contato de organelas, interação proteína-ácido nucléico e, principalmente, interação proteína-proteína 10,11,19.......

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Black 384-well plates	Perkin Elmer Cell carrier plates
Donkey  anti- Rabbit Alexa Fluor 488	Invitrogen	A21206	1:300
Duo link Donkey anti Mouse Minus	Sigma	DUO92004
Duolink antibody diluent	Sigma	DUO82008
Duolink blocking solution 1X	Sigma	DUO82007
Duolink Detection reagent Far red	Sigma	DUO92013
Duolink Donkey anti goat plus	Sigma	DUO92003
Duolink Donkey anti rabbit plus	Sigma	DUO92002
Etoposide	Sigma	E1383
Goat anti Nek4	Santa Cruz Biotechnology	SC-5517	goat anti Nek4 was used at 1:50 dilution
Hoechst 33342	Thermo	H1399	0.6 µg/mL
Leica DMI microscope	Leica
Mouse anti Ku70	Thermo	MA5-13110	mouse anti Ku70 was used at 1:100 dilution
Mouse anti TOPIIβ	Santa Cruz Biotechnology	SC-365071	1:25
Rabbit anti Nek5	Santa Cruz Biotechnology	SC-84527	1:25
Rabbit anti Y H2AX	Cell Signalling	9718S	1:100 dilution
U2OS cell line	ATCC	HTB-96