Ensaio de ligante de proximidade para localizar proteínas em locais de dano ao DNA

Resumo

Aqui, apresentamos um protocolo simples e rápido para a detecção de interação proteica em locais de dano ao DNA.

Resumo

A resposta ao dano do DNA é uma proteção de informação genética que protege as células da perpetuação do DNA danificado. A caracterização das proteínas que cooperam nesse processo permite a identificação de alvos alternativos para intervenção terapêutica em diversas doenças, como câncer, doenças relacionadas ao envelhecimento e inflamação crônica. O Proximity Ligand Assay (PLA) surgiu como uma ferramenta para estimar a interação entre proteínas, bem como a proximidade espacial entre organelas ou estruturas celulares e permite a análise de localização temporal e co-localização em condições de estresse, por exemplo. O método é simples porque é semelhante à imunofluorescência convencional e permite a coloração de uma organela, estrutura celular ou um marcador específico, como mitocôndrias, retículo endoplasmático, corpos PML ou marcador de fita dupla de DNA, yH2AX simultaneamente. A fosforilação do S139 na variante da histona 2A, H2AX, então conhecida como yH2AX, é amplamente utilizada como um marcador muito sensível e específico de quebras de fita dupla de DNA. Cada foco da coloração yH2AX corresponde a uma quebra no DNA que ocorre alguns minutos após o dano. A análise de alterações nos focos de yH2AX é o ensaio mais comum para estudar se a proteína de interesse está implicada na resposta a danos no DNA (DDR). Se um papel direto no local de dano ao DNA é esperado, a microscopia de fluorescência é usada para verificar a colocalização da proteína de interesse com os focos de yH2AX. No entanto, exceto pelos novos métodos de fluorescência de super-resolução, para concluir, a interação local com os locais de dano ao DNA pode ser um pouco subjetiva. Aqui, mostramos um ensaio para avaliar a localização de proteínas na via DDR usando yH2AX como marcador do local do dano. Este ensaio pode ser usado para caracterizar a localização temporal sob diferentes insultos que causam danos ao DNA.

Introdução

O dano ao DNA celular ocorre diariamente devido às reações químicas espontâneas e também é aumentado por fatores exógenos, como agentes genotóxicos (radiação e produtos químicos como o etoposídeo) e estresse oxidativo ^1,2,3. As células possuem um maquinário complexo que corrige uma miríade de diferentes tipos de danos ao DNA, desde a remoção de bases até a torção replicativa do garfo ou interrupção até a lesão mais deletéria: a quebra de fita dupla de DNA ^4,5.

Várias proteínas que participam da DDR já foram caracterizadas, e excelentes revisões exploram as vias de junção final não homóloga (NHEJ) e recombinação homóloga (HR), as principais vias implicadas no reparo de quebras de fita dupla (DSB) ^5,6. A fosforilação da variante da histona H2A, H2AX, na serina 139 (posteriormente denominada y-H2AX) tem sido usada por muitos anos como um marcador sensível e confiável da quebra de fita dupla. A fosforilação do H2AX é observada nos primeiros minutos após o dano e pode persistir por horas⁷.

A vantagem de usar a detecção de imunofluorescência de focos de γ-H2AX é a caracterização da distribuição temporal e espacial dos focos, bem como sua co-coloração com outras proteínas. Além disso, a imunofluorescência não requer lise, o que preserva as informações do contexto celular e as torna mais informativas. Além disso, como o γ-H2AX é formado de novo, não está abundantemente presente na ausência de danos ao DNA, tornando-se um marcador específico⁷.

O H2AX é principalmente fosforilado pela proteína quinase ataxia-telangiectasia mutada (ATM) e proteína quinase dependente de DNA (DNA-PK), os sensores dos DSBs. Ku70/80 (XRCC6 X-ray repair cross-complementing 6/ XRCC5 X-ray repair cross-complementing 5) e DNA-protein quinase catalítica subunit (DNA-PKcs) são responsáveis pela identificação de DSB e pela proteção das extremidades do DNA, enquanto Artemis realiza o processamento final para facilitar a ligação pelo complexo XRCC4-Ligase IV. A fosforilação de H2AX em locais flanqueadores de DSBs atua como um sinal para o recrutamento de várias proteínas de reparo e sinalização para parada, morte ou sobrevivência do ciclo celular⁸.

A análise de alterações nos focos de y-H2AX é o ensaio mais comum para estudar se a proteína de interesse está implicada na resposta a danos no DNA. Se um papel direto no local de dano ao DNA é esperado, a microscopia de fluorescência é usada para verificar a co-localização da proteína de interesse com os focos de y-H2AX. No entanto, exceto pelos novos métodos de fluorescência de super-resolução, concluir a interação local com os locais de dano ao DNA pode ser complicado. Além disso, a detecção de imunofluorescência geralmente depende de muitas moléculas de proteína no local do dano ao DNA, dificultando a identificação de proteínas escassas⁹.

Aqui, mostramos um ensaio para avaliar a localização de proteínas envolvidas na via DDR usando y-H2AX como marcador do local do dano. Este ensaio pode ser usado para caracterizar a localização temporal sob diferentes insultos que causam danos ao DNA.

O Proximity Ligand Assay (PLA) surgiu como uma ferramenta para estimar a interação entre proteínas, bem como a proximidade espacial entre organelas ou estruturas celulares^10,11 e permite a análise de localização temporal e co-localização em condições de estresse, por exemplo. O método é simples porque é como a imunofluorescência convencional e permite a coloração simultânea de marcadores específicos de organelas ou estruturas celulares, como mitocôndrias, retículo endoplasmático, corpos PML ou marcador de fita dupla de DNA, yH2AX. O uso de PLA permite a identificação da interação proteica durante o dano ao DNA de maneira sensível, específica e confiável que pode ser usada para monitorar a interação durante o ciclo celular, em resposta a diferentes estímulos e em diferentes momentos após o estresse genotóxico.

Mostramos aqui o uso de PLA concomitantemente à imunofluorescência convencional de γ-H2AX para localizar a interação Nek4-Ku70 após dano ao DNA induzido por etoposídeo. Nek4, um membro da família Nek (quinases relacionadas ao NIMA), não tem um papel claro na resposta a danos no DNA. Em 2012, Nguyen e colegas mostraram que Nek4 interage com proteínas Ku70 / Ku80 e, na ausência de Nek4, essas proteínas não são recrutadas para o local de dano ao DNA e a fosforilação de H2AX é prejudicada¹². A localização celular dessa interação é desconhecida até o momento. Observamos uma redução na fosforilação de Ku70 em células que expressam o mutante morto por Nek4 quinase¹³, mas ainda não foi elucidado se Nek4 fosforila diretamente Ku70. Considerando que a interação de Nek4 com Ku70 é aumentada após o tratamento com etoposídeo de acordo com estudos de imunoprecipitação¹², tentamos localizar essa interação usando PLA e o marcador γ-H2AX.

Normalmente, os estudos de interação são baseados em ensaios de imunoprecipitação, mas estes são in vitro e não fornecem informações sobre a localização da interação. Quando possível, uma imunoprecipitação de células fracionadas (núcleo, mitocôndria, membrana celular ou citosol) pode ser realizada, mas realizar um curso de tempo da interação é caro e trabalhoso. A imunofluorescência pode fornecer informações sobre a localização celular das proteínas, mas provar a interação pode ser difícil e depende da resolução dos microscópios. Aqui, mostramos a vantagem de usar o Proximity Ligand Assay para monitorar a interação de duas proteínas em um contexto de dano ao DNA.

Protocolo

1. Revestimento celular

NOTA: As células podem ser semeadas em lâminas, câmaras ou placas de fluorescência microscópica. O uso de pequenas lamínulas ou placas de 96/384 poços é recomendado para testar várias condições e reagentes sobressalentes. O uso de lamínulas é aconselhável para linhagens celulares que se desprendem facilmente, como as células HEK293. As lamínulas podem ser previamente revestidas com uma solução de poli-L-lisina para melhorar a fixação.

1. Células de placa considerando um veículo, controles técnicos e controles biológicos. Use réplicas técnicas em dois ou três poços por condição.
   NOTA: O uso de controle técnico (secundário e apenas um primário) é obrigatório. Se possível, o controle biológico também deve ser incluído (por exemplo, superexpressão ou knockdown de uma das proteínas-alvo ou uma condição que é conhecida por alterar a interação, por exemplo).
   1. Cultura de células U2OS em meio de Eagle modificado (DMEM) de Dulbecco suplementado com 10% de soro fetal bovino (FBS), 4,5 g/L de glicose e 4 mM de L-glutamina em placas tratadas com cultura de tecidos a 37 °C em 5% de CO₂ e uma atmosfera umidificada contendo 90% de ar. Dependendo do número de condições a serem testadas e se estiver usando um 384 ou lamínulas em uma placa de 60 mm, comece com uma placa de 60 ou 100 mm, respectivamente.
   2. Quando as células atingirem 60%-70% de confluência, dividir as células usando 0,25% de tripsina-EDTA ¹⁴. Conte as células usando uma câmara de Neubauer ou um contador automático¹⁴. Placa 4 x 10,5 células em placa de 60 mm contendo várias lamínulas redondas de 13 mm ou 4 x 10,5 células por alvéolo em placa(s) de 384 poços e incubar durante 12 a 24 horas a 37 °C numa incubadora humidificada de CO 5%₂.

2. Preparação de soluções

NOTA: A concentração e os tempos de tratamento foram escolhidos com base em resultados da literatura, que apontam a ativação das vias de reparo do dano ao DNA^15,16.

1. Preparar a solução-mãe de Etoposídeo na concentração de 50 mM em DMSO. A solução de reserva pode ser mantida a -20 °C durante vários meses. Diluir a solução de etoposídeo para utilização no meio de cultura completo à concentração final de 25 μM. Use DMSO a 0,05% diluído no meio de cultura completo como controle do veículo.
2. Prepare 20x Citrato de Sódio Salino (SSC; 3,0 M NaCl, 0,30 M citrato trissódico pH 7,0). Esta solução pode ser conservada durante vários meses a 4 °C.

3. Tratamento e fixação celular

NOTA: Não deixe as células secarem em nenhum momento; Tente explorar as soluções anteriores o máximo possível. Deve determinar-se previamente o método adequado de fixação celular (metanol gelado ou paraformaldeído a 4% (PFA)), bem como a diluição do anticorpo, utilizando uma experiência de imunofluorescência convencional.

CUIDADO: O metanol deve ser descartado adequadamente.

1. Remova o meio de cultura dos alvéolos e adicione um meio de cultura contendo etoposídeo ou DMSO a 25 μM ou 0,05%, respectivamente. Incubar células a 37 °C em 5% de CO₂ e uma atmosfera umidificada contendo 90% de ar com etoposídeo ou DMSO por 3 períodos de tempo diferentes: 20 min, 1 h e 3 h. Ao usar placas 384, todas as condições devem ser fixadas simultaneamente.
   1. Para isso, comece tratando a condição com o maior tempo de tratamento, como 3 h. Após 2 h, trate a condição de tratamento de 1 h e, quando faltarem 20 min para fixação, trate a condição de 20 min. Depois disso, todas as condições podem ser corrigidas ao mesmo tempo.
2. Remova o meio dos poços e lave as células com PBS 3x.
3. Fixe as células adicionando metanol gelado com volume suficiente para cobrir a superfície do poço. Incubar durante 10 min a -20 °C. Lave os poços com PBS 3x.
   NOTA: Neste ponto, o protocolo pode ser pausado. As placas podem ser armazenadas a 4 °C por 1 semana.

4. Permeabilização e bloqueio

NOTA: Se estiver usando o método de fixação PFA, uma etapa de bloqueio com glicina deve ser realizada antes da permeabilização. A câmara de umidade pode ser preparada colocando uma bandeja de água dentro da incubadora, resultando em uma umidade de cerca de 95%. A placa ou lâminas 384 podem ser incubadas em um recipiente de plástico fechado acima do papel de filtro ou esponja umedecida e filme transparente.

1. Toque no PBS das amostras.
2. Adicione 30-40 μL de tampão de permeabilização (0,2% Triton X-100 em PBS) e incube por 20 min em temperatura ambiente. Lave 3x com PBS
3. Retire o PBS das amostras e adicione 30-40 μL de solução de bloqueio 1x fornecida no kit PLA (alternativamente, 3% de albumina de soro bovino e Triton X-100 0,1% em solução de PBS podem ser usados) a cada poço/lamínula.
4. Incubar a placa numa câmara de humidade pré-aquecida a 37 °C durante 1 h.

5. Incubação primária de anticorpos (PLA)

NOTA: Se estiver usando lamínulas, é importante garantir que a solução de anticorpos cubra todas as superfícies da lamínula. Atenção especial deve ser dada à seleção de anticorpos. Os anticorpos devem ser de diferentes espécies animais, e o anticorpo secundário usado para γ-H2AX não deve ser contra a espécie hospedeira da produção de sondas PLA. Por exemplo, os anticorpos primários usados para o PLA foram criados em camundongos e cabras. As sondas PLA, anti-rato e anti-cabra foram produzidas no burro. O anticorpo contra γ-H2AX foi produzido em coelhos, e o secundário utilizado é o anti-coelho produzido em burros. Desta forma, o secundário não reconhecerá as sondas PLA.

1. Diluir os anticorpos primários (o anti-Ku70 de camundongo 1:100 e anti-Nek4 de cabra 1:50; anti-Nek5 de coelho 1:25 e anti-TOPIIβ de camundongo 1:25) em diluente de anticorpos fornecido no kit (alternativamente, 3% de albumina de soro bovino e Triton X-100 0,1% em solução de PBS podem ser usados). Prepare 30 μL de solução de anticorpos por condição se estiver usando lamínulas ou 20 μL por poço se estiver usando uma placa de 384 poços.
2. Toque na solução de bloqueio. Adicione a solução de anticorpo primário a cada poço. Incubar a 4 °C durante a noite numa câmara de humidade.

6. Incubação da sonda PLA

NOTA: Escolha as sondas, levando em consideração não apenas os anticorpos primários, mas também aqueles destinados ao uso nas etapas de imunofluorescência. Ao usar placas de 384 poços para incubação longa de 37 °C, a rotação lenta pode ser usada para melhorar a distribuição da solução de anticorpos.

1. Diluir as sondas de menos e mais 1:5 no diluente de anticorpos. Prepare 10 μL por poço se estiver usando placas de 384 poços ou 20 μL por amostra se estiver usando lamínulas. Utilize as seguintes combinações: Burro anti-rato menos com Burro anti-cabra mais; Burro anti-rato menos com burro anti-coelho mais.
2. Retire a solução primária de anticorpos. Lave 1x com TBS-T (50 mM Tris pH 7,5, 150 mM NaCl, 0,05% de Tween-20). Lave 3x por 5 min cada com TBS-T em temperatura ambiente. Realize uma lavagem adicional com TBS-T.
3. Retire e adicione a solução de sonda PLA com 10 μL para as placas e 20 μL para as lamínulas. Incubar na câmara de humidade pré-aquecida a 37 °C durante 1 h.

7. Ligadura

NOTA: Aguarde para adicionar Ligase até imediatamente antes de adicioná-lo às amostras. A ligase deve ser mantida num congelador (-20 °C). Remova completamente toda a solução de lavagem antes de adicionar a solução de ligase. Evite deixar as células sem solução por longos períodos de tempo. Ao usar placas de 384 poços para a incubação de 37 °C, a rotação lenta pode ser usada para melhorar a distribuição da solução de anticorpos.

1. Dilua o tampão de ligação 5x em água de alta pureza. Prepare 10 μL por poço se estiver usando placas de 384 poços ou 20 μL se estiver usando lamínulas.
2. Toque na solução de sonda PLA. Lave 1x com TBS-T. Siga com três lavagens adicionais, cada uma com duração de 5 min, usando TBS-T. Lave uma última vez e retire o TBS-T antes da próxima etapa.
3. Adicione Ligase à solução de ligadura 1x a 1:40, imediatamente antes de aplicá-la às amostras. Incubar na câmara de humidade pré-aquecida a 37 °C durante 30 min a 1 h.

8. Amplificação e lavagem

NOTA: Aguarde para adicionar a polimerase até imediatamente antes da adição à amostra. O tampão de amplificação é sensível à luz; Proteja todas as soluções que contêm o tampão da luz. A polimerase deve ser mantida num congelador (-20 °C). Evite deixar as células sem solução por um longo período de tempo. Ao usar placas de 384 poços para incubação a 37 °C, a rotação lenta pode melhorar a distribuição da solução de anticorpos.

1. Remova completamente toda a solução de lavagem antes de adicionar a solução de polimerase. Evite deixar as células sem solução por um longo período de tempo. Dilua o tampão de amplificação 5x em água de alta pureza. Prepare 10 μL por poço se estiver usando placas de 384 poços ou 20 μL se estiver usando lamínulas.
2. Toque na solução de ligação. Lave 1x com TBS-T. Siga com três lavagens adicionais, cada uma com duração de 5 min, usando TBS-T. Lave uma última vez e retire o TBS-T antes da próxima etapa.
3. Adicionar a polimerase à solução de amplificação 1x na diluição de 1:80, imediatamente antes de a aplicar às amostras. Incubar na câmara de humidade pré-aquecida a 37 °C durante 100 min.
   NOTA: A partir desta etapa, evite a exposição direta à luz
4. Toque no buffer de amplificação. Lave 2x com 1x tampão SSC por 10 min cada. Lave 2x com 0,01x SSC buffer por 2 min cada.

9. Coloração γ-H2AX (Imunofluorescência - IF)

NOTA: A rotulagem do γ-H2AX é realizada após o término do PLA.

1. Incubação primária de anticorpos (IF)
   1. Dilua os anticorpos primários (Rabbit anti yH2AX a 1:100) em solução de bloqueio (alternativamente, 3% de albumina de soro bovino e Triton X-100 0,1% em solução de PBS podem ser usados). Prepare 30 μL de solução de anticorpos por poço se estiver usando lamínulas ou 20 μL se estiver usando uma placa de 384 poços.
   2. Toque na solução SSC 0.01x. Lave 2x com PBS.
   3. Adicione a solução de anticorpo primário a cada poço. Incubar à temperatura ambiente durante 1 h.
2. Incubação secundária de anticorpos (IF)
   NOTA: Certifique-se de que os anticorpos secundários escolhidos não reconheçam os anticorpos ou sondas PLA. Além disso, o comprimento de onda do anticorpo secundário deve ser diferente do comprimento de onda do reagente de detecção de PLA. Por exemplo: nosso reagente de detecção de PLA contém o fluoróforo 647 e o secundário que usamos para detecção de γ-H2AX é 488.
   1. Diluir os anticorpos secundários (Donkey anti-Rabbit Alexa Fluor 488) em solução de bloqueio (alternativamente, 3% de albumina de soro bovino e Triton X - 100 0,1% em solução de PBS) na diluição de 1:300. Prepare 30 μL de solução de anticorpos por condição se estiver usando lamínulas ou 20 μL por poço se estiver usando uma placa de 384 poços. Adicione o corante Hoechst 33342 na concentração final de 0,6 μg/ml.
   2. Retire a solução primária de anticorpos. Lave 3x com TBS-T.
   3. Adicione a solução de anticorpos secundários a cada poço. Incubar à temperatura ambiente durante 20 min.
   4. Lave 5x com TBS-T. Lave 2x com 1x tampão SSC. Lave 2x com 0,01x tampão SSC.
      NOTA: Neste ponto, as placas podem ser armazenadas por várias semanas a 4 ° C (em SSC 0.01X) protegidas da luz. Se estiver usando lamínulas, as lâminas podem ser montadas e, após 1 dia, as lâminas podem ser armazenadas a -20 °C.

10. Aquisição de imagem

1. Use um microscópio de fluorescência convencional e a objetiva 63x. Determine o tempo de exposição comparando controles negativos e positivos para evitar saturação e colapso de pontos.
   NOTA: O uso de microscópios confocais aumenta a detecção de pontos PLA. A objetiva 20x também pode ser usada para aumentar o número de núcleos detectados.
2. Uma vez ajustado o tempo de exposição, execute todas as aquisições de pontos PLA com os mesmos parâmetros. Tente adquirir imagens de diferentes poços ou regiões de lamínulas para evitar artefatos devido à incubação não homogênea.
3. Salve todos os canais com o mesmo padrão de nome. Se o microscópio tirar fotos nos canais separadamente, salve as imagens correspondentes com o mesmo nome, adicionando apenas PLA ou Nucleus no início do nome do arquivo para diferenciar o canal.

11. Análise de imagem

NOTA: Uma macro foi criada para análise de pontos por núcleo na Imagem J/FIJI¹⁷ e para ser usada com microscópios onde as informações da escala devem ser adicionadas manualmente. O tamanho do pixel para a lente objetiva usada deve ser conhecido. Coloque as imagens de cada canal em pastas diferentes (Arquivo de codificação suplementar 1, Figura suplementar 1).
NOTA: A macro considera os canais de fluorescência obtidos separadamente. Nesse caso, é importante salvar todas as imagens com o mesmo nome.

1. A macro permite a seleção de uma região específica no campo. Use a opção Selecionar um ROI quando uma região na imagem mostrar artefatos que podem ser prejudiciais à análise. Escolha ROI no início da análise e use-o para todas as imagens.
   NOTA: Este é um recurso opcional. Se não for selecionada, a imagem inteira será considerada na análise (Figura Suplementar 2).
2. O arquivo ROI deve ser criado antes do uso da macro, conforme descrito abaixo. Para a seleção de ROI, use uma ferramenta de retângulo, selecione a região para análise e adicione-a ao gerenciador de ROI clicando em Editar > Seleção> Adicionar ao Gerente. Salve o ROI clicando em Mais> Salvar.
3. Na ImageJ ¹⁷, abra imagens de diferentes condições para ajustar os parâmetros para análise. Esses parâmetros devem ser determinados pelo usuário e especificados, juntamente com os dados, no programa de macro (Arquivo de Codificação Suplementar 1)
   1. Correção do plano de fundo: para remover o plano de fundo, clique em Processar> Subtrair plano de fundo. Teste diferentes raios de bola rolante usando a função de visualização). Usamos 10 rolantes para pontos PLA e 100 rolantes para núcleo.
   2. Remova o ruído clicando em Processar > ruído > Remover manchas. Para núcleo, use a função suave para melhorar o preenchimento do núcleo clicando em Process>Smooth.
   3. Ajustando o limite: Converta em imagem de 8 bits e ajuste o limite clicando em Imagem > Tipo > 8 bits e Imagem > Ajustar >Limiar. Ajuste o limite de acordo para visualizar todos os núcleos ou pontos presentes na imagem, mas evitando saturação excessiva e colapso de estruturas. Anote os valores e teste em imagens diferentes para verificar se o limite funciona para imagens diferentes.
   4. Converta em máscara clicando em Processar > binário > Converter em máscara. No caso do núcleo, clique em Processar > Binário > Preencher buracos seguido de Processar > Binário > Bacia Hidrográfica. No caso dos pontos PLA, clique em Processar > Binário > Bacia Hidrográfica.
   5. Para contar núcleos, meça a área ou o comprimento dos diferentes núcleos para estimar o tamanho médio. Use um valor aproximado para analisar partículas. Clique em Analisar > Analisar partículas e selecione Definir tamanho: 15-infinito (esses valores dependem do tamanho dos núcleos). Marque as seguintes opções: Mostrar: Máscara; Exibir resultados; Resultados claros; Resumir; Adicionar ao gerente; Excluir nas bordas.
   6. Para contar pontos PLA, meça a área ou o raio dos pontos para estimar o tamanho médio. Selecione Aplicar máscara de núcleo (aplicar máscara é uma função no plugin GDSC, verifique se está instalado) seguido de Analisar > Analisar partículas e defina. 0,02-3 (esses valores dependem do tamanho dos núcleos). Marque as seguintes opções: Mostrar: Máscara; Exibir resultados; Resultados claros; Resumir; Adicionar ao gerente; Excluir nas bordas.
4. Os resultados mostram o número de pontos por núcleo em cada núcleo presente na imagem. Salve esses dados.

12. Visualizando as imagens mescladas

1. Abra os canais correspondentes ao PLA, núcleo e γ-H2AX. Subtraia o fundo e remova o ruído, conforme mencionado nas etapas 11.4.1 e 11.4.2 para todas as imagens.
2. Ajuste o brilho e o contraste automática ou manualmente usando o mesmo valor para todas as condições do mesmo canal. Selecione Imagem > Ajustar > Brilho/contraste.
3. Combine imagens (mesclagem) selecionando Imagem > Cor > Mesclar canais. Adicione a barra de escala selecionando Analisar > Ferramentas > Barra de escala. Salvar como. Arquivo TIFF.

Resultados

Observamos interação Nek4-Ku70 na ausência de tratamento com etoposídeo. No entanto, essa interação pode ocorrer fora do núcleo (Figura 1A). A interação Nek4-Ku70 aumenta após o dano ao DNA e está concentrada no núcleo (Figura 1A). No caso da interação Nek5-Topoisomerase II β (TOPIIβ), utilizada neste ensaio como controle positivo com base nos resultados da literatura¹⁸, a interação é m...

Discussão

Os dados mostram que o uso de PLA concomitantemente a um marcador danificado pelo DNA pode fornecer mais informações em um perfil de resposta a danos no DNA, mostrando o comportamento espacial e temporal da interação após o insulto. O PLA é um método versátil que tem sido utilizado para identificação de dimerização, determinação do contato de organelas, interação proteína-ácido nucléico e, principalmente, interação proteína-proteína 10,11,19...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Black 384-well plates	Perkin Elmer Cell carrier plates
Donkey  anti- Rabbit Alexa Fluor 488	Invitrogen	A21206	1:300
Duo link Donkey anti Mouse Minus	Sigma	DUO92004
Duolink antibody diluent	Sigma	DUO82008
Duolink blocking solution 1X	Sigma	DUO82007
Duolink Detection reagent Far red	Sigma	DUO92013
Duolink Donkey anti goat plus	Sigma	DUO92003
Duolink Donkey anti rabbit plus	Sigma	DUO92002
Etoposide	Sigma	E1383
Goat anti Nek4	Santa Cruz Biotechnology	SC-5517	goat anti Nek4 was used at 1:50 dilution
Hoechst 33342	Thermo	H1399	0.6 µg/mL
Leica DMI microscope	Leica
Mouse anti Ku70	Thermo	MA5-13110	mouse anti Ku70 was used at 1:100 dilution
Mouse anti TOPIIβ	Santa Cruz Biotechnology	SC-365071	1:25
Rabbit anti Nek5	Santa Cruz Biotechnology	SC-84527	1:25
Rabbit anti Y H2AX	Cell Signalling	9718S	1:100 dilution
U2OS cell line	ATCC	HTB-96