DNA Hasar Bölgelerindeki Proteinleri Lokalize Etmek için Yakınlık Ligand Testi

Özet

Burada, DNA hasar bölgelerinde protein etkileşiminin tespiti için basit ve hızlı bir protokol sunuyoruz.

Özet

DNA hasar tepkisi, hücreleri hasarlı DNA'yı sürdürmekten koruyan bir genetik bilgi korumasıdır. Bu süreçte işbirliği yapan proteinlerin karakterizasyonu, kanser, yaşlanmaya bağlı hastalıklar ve kronik inflamasyon gibi çeşitli hastalıklarda terapötik müdahale için alternatif hedeflerin belirlenmesine olanak tanır. Yakınlık Ligand Testi (PLA), proteinler arasındaki etkileşimin yanı sıra organeller veya hücresel yapılar arasındaki uzamsal yakınlığı tahmin etmek için bir araç olarak ortaya çıktı ve örneğin stres koşulları altında zamansal lokalizasyon ve ko-lokalizasyon analizine izin verdi. Yöntem basittir çünkü geleneksel immünofloresansa benzer ve bir organelin, hücresel yapının veya mitokondri, endoplazmik retikulum, PML cisimcikleri veya DNA çift sarmallı markör, yH2AX gibi spesifik bir markörün aynı anda boyanmasına izin verir. S139'un Histon 2A varyantı H2AX'te fosforilasyonu, daha sonra yH2AX olarak anılır, DNA çift iplikli kırılmalarının çok hassas ve spesifik bir belirteci olarak yaygın olarak kullanılır. yH2AX boyamanın her odağı, hasardan birkaç dakika sonra meydana gelen DNA'daki bir kırılmaya karşılık gelir. yH2AX odaklarındaki değişikliklerin analizi, ilgilenilen proteinin DNA hasar tepkisinde (DDR) rol oynayıp oynamadığını incelemek için en yaygın testtir. DNA hasar bölgesinde doğrudan bir rol beklenip beklenmediği, ilgilenilen proteinin yH2AX odakları ile kolokalizasyonunu doğrulamak için floresan mikroskobu kullanılır. Bununla birlikte, yeni süper çözünürlüklü floresan yöntemleri dışında, sonuç olarak, DNA hasar bölgeleri ile yerel etkileşim biraz öznel olabilir. Burada, hasar bölgesinin bir belirteci olarak yH2AX kullanarak DDR yolundaki proteinlerin lokalizasyonunu değerlendirmek için bir test gösteriyoruz. Bu test, DNA hasarına neden olan farklı hakaretler altında temporal lokalizasyonu karakterize etmek için kullanılabilir.

Giriş

Hücresel DNA hasarı, spontan kimyasal reaksiyonlar nedeniyle günlük olarak ortaya çıkar ve ayrıca genotoksik ajanlar (radyasyon ve etoposit gibi kimyasallar) ve oksidatif stres gibi eksojen faktörler tarafından da artar ^1,2,3. Hücreler, bazların çıkarılmasından replikatif çatal burulmasına veya en zararlı lezyonun kesilmesine kadar sayısız farklı DNA hasarını düzelten karmaşık bir makineye sahiptir: DNA çift iplikli kırılma ^4,5.

DDR'ye katılan birkaç protein zaten karakterize edilmiştir ve mükemmel revizyonlar, çift iplikli kopma (DSB)^onarımında ima edilen ana yollar olan homolog olmayan uç birleştirme (NHEJ) ve homolog rekombinasyon (HR) yollarını araştırır ^5,6. Histon H2A varyantı olan H2AX'in serin 139'da (bundan sonra y-H2AX olarak anılacaktır) fosforilasyonu, çift iplikli kopmanın hassas ve güvenilir bir belirteci olarak uzun yıllardır kullanılmaktadır. H2AX'in fosforilasyonu, hasarı takip eden ilk dakikalarda gözlenir ve⁷ saat devam edebilir.

γ-H2AX odaklarının immünofloresan tespitini kullanmanın avantajı, odakların zamansal ve mekansal dağılımının karakterizasyonunun yanı sıra diğer proteinlerle birlikte boyanmasıdır. Ayrıca, immünofloresan, hücresel bağlam bilgisini koruyan ve daha bilgilendirici hale getiren lizis gerektirmez. Ayrıca, γ-H2AX de novo olarak oluştuğu için, DNA hasarının yokluğunda bol miktarda bulunmaz, bu da onu spesifik bir belirteç⁷ yapar.

H2AX çoğunlukla DSB'lerin sensörleri olan protein kinaz ataksi-telenjiektazi mutasyona uğramış (ATM) ve DNA'ya bağımlı protein kinaz (DNA-PK) tarafından fosforile edilir. Ku70/80 (XRCC6 X-ışını onarımı çapraz tamamlayıcı 6/ XRCC5 X-ışını onarımı çapraz tamamlayıcı 5) ve DNA-protein kinaz katalitik alt birimi (DNA-PKcs) DSB'nin tanımlanmasından ve DNA uçlarının korunmasından sorumludur, Artemis ise XRCC4-Ligaz IV kompleksi tarafından ligasyonu kolaylaştırmak için son işlemeyi gerçekleştirir. DSB'leri çevreleyen bölgelerde H2AX'in fosforilasyonu, birkaç onarım proteininin işe alınması için bir sinyal görevi görür ve hücre döngüsünün durması, ölüm veya hayatta kalma için sinyal verir⁸.

Y-H2AX odaklarındaki değişikliklerin analizi, ilgilenilen proteinin DNA hasar tepkisinde rol oynayıp oynamadığını incelemek için en yaygın testtir. DNA hasar bölgesinde doğrudan bir rol beklenip beklenmediği, ilgilenilen proteinin y-H2AX odakları ile birlikte lokalizasyonunu doğrulamak için floresan mikroskobu kullanılır. Bununla birlikte, yeni süper çözünürlüklü floresan yöntemleri dışında, DNA hasar bölgeleri ile yerel etkileşimi sonuçlandırmak zor olabilir. Ayrıca, immünofloresan tespiti genellikle DNA hasar bölgesindeki birçok protein molekülüne bağlıdır ve bu da kıt proteinlerin tanımlanmasını zorlaştırır⁹.

Burada, hasar bölgesinin bir belirteci olarak y-H2AX kullanarak DDR yolunda yer alan proteinlerin lokalizasyonunu değerlendirmek için bir test gösteriyoruz. Bu tahlil, DNA hasarına neden olan farklı hakaretler altında temporal lokalizasyonu karakterize etmek için kullanılabilir.

Yakınlık Ligand Testi (PLA), proteinler arasındaki etkileşimin yanı sıra organeller veya hücresel yapılar arasındaki uzamsal yakınlığı tahmin etmek için bir araç olarak ortaya çıktı^10,11 ve örneğin stres koşulları altında zamansal lokalizasyon ve ko-lokalizasyon analizine izin verir. Yöntem basittir çünkü geleneksel immünofloresan gibidir ve mitokondri, endoplazmik retikulum, PML cisimleri veya DNA çift sarmallı markör, yH2AX gibi organel veya hücresel yapıya özgü belirteçlerin aynı anda boyanmasına izin verir. PLA kullanımı, DNA hasarı sırasında protein etkileşiminin, hücre döngüsü sırasında, farklı uyaranlara yanıt olarak ve genotoksik stresten sonra farklı zamanlarda etkileşimi izlemek için kullanılabilecek hassas, spesifik ve güvenilir bir şekilde tanımlanmasına izin verir.

Burada, etoposid kaynaklı DNA hasarından sonra Nek4-Ku70 etkileşimini lokalize etmek için PLA'nın konvansiyonel γ-H2AX immünofloresan ile eş zamanlı olarak kullanımını gösteriyoruz. Nek (NIMA ile ilişkili kinazlar) ailesinin bir üyesi olan Nek4'ün DNA Hasarı yanıtında net bir rolü yoktur. 2012 yılında Nguyen ve meslektaşları, Nek4'ün Ku70 / Ku80 proteinleri ile etkileşime girdiğini ve Nek4'ün yokluğunda, bu proteinlerin DNA hasar bölgesine alınmadığını ve H2AX fosforilasyonunun bozulduğunu gösterdi¹². Bu etkileşimin hücresel lokalizasyonu şu ana kadar bilinmemektedir. Nek4 kinaz ölü mutant^13'üeksprese eden hücrelerde Ku70 fosforilasyonunda bir azalma gözlemledik, ancak Nek4'ün doğrudan Ku70'i fosforile edip etmediği henüz açıklanmamıştır. İmmünopresipitasyon çalışmalarına¹² göre etoposid tedavisinden sonra Ku70 ile Nek4 etkileşiminin arttığı göz önüne alındığında, bu etkileşimi PLA ve γ-H2AX markörü kullanarak lokalize etmeye çalışıyoruz.

Genellikle, etkileşim çalışmaları immünopresipitasyon testlerine dayanır, ancak bunlar in vitro ve etkileşimin yeri hakkında bilgi sağlamaz. Mümkün olduğunda, fraksiyonlanmış hücrelerin (çekirdek, mitokondriyal, hücresel zar veya sitozol) immünopresipitasyonu gerçekleştirilebilir, ancak etkileşimin bir zaman seyrini gerçekleştirmek maliyetli ve zahmetlidir. İmmünofloresan, proteinlerin hücresel lokalizasyonu hakkında bilgi verebilir, ancak etkileşimi kanıtlamak zor olabilir ve mikroskopların çözünürlüğüne bağlı olabilir. Burada, bir DNA hasarı bağlamında iki proteinin etkileşimini izlemek için Yakınlık Ligand Testini kullanmanın avantajını gösteriyoruz.

Protokol

1. Hücre kaplama

NOT: Hücreler mikroskobik floresan slaytlara, odalara veya plakalara ekilebilir. Birden fazla koşulun ve yedek reaktiflerin test edilmesi için küçük lamellerin veya 96/384 kuyulu plakaların kullanılması önerilir. HEK293 hücreleri gibi kolayca ayrılan hücre hatları için lamellerin kullanılması tavsiye edilir. Lameller, ataşmanı iyileştirmek için önceden bir poli-L-lizin çözeltisi ile kaplanabilir.

1. Bir araç düşünülen plaka hücreleri, teknik kontroller ve biyolojik kontroller. Koşul başına iki veya üç kuyuda teknik kopyalar kullanın.
   NOT: Teknik kontrolün kullanılması (hem ikincil hem de yalnızca bir birincil) zorunludur. Mümkünse, biyolojik kontrol de dahil edilmelidir (örneğin, hedef proteinlerden birinin aşırı ekspresyonu veya yıkılması veya etkileşimi değiştirdiği bilinen bir durum).
   1. Dulbecco'nun Modifiye Eagle Medium'undaki (DMEM) kültür U2OS hücreleri, %10 Fetal Sığır Serumu (FBS), 4.5 g/L Glikoz ve 4 mM L-Glutamin ile desteklenmiştir ve doku kültürü ile tedavi edilmiş plakalarda 37 ° C'de% 5 CO₂ ve% 90 hava içeren nemlendirilmiş bir atmosfer. Test edilecek koşulların sayısına bağlı olarak ve 60 mm'lik bir plakada 384 veya lamel kullanılıyorsa, sırasıyla 60 veya 100 mm'lik bir plakadan başlayın.
   2. Hücreler% 60 -% 70 birleşmeye ulaştığında,% 0.25 tripsin-EDTA ¹⁴ kullanarak hücreleri ayırın. Bir Neubauer odası veya otomatik bir sayaç¹⁴ kullanarak hücreleri sayın. Plaka 4 x 10⁶⁰ mm'lik plakada 5 hücre, birden fazla 13 mm yuvarlak lamel veya 384 oyuklu plaka(lar)da oyuk başına 4 x 10⁵ hücre içeren ve nemlendirilmiş,% 5 CO₂ inkübatörde 37 ° C'de 12 - 24 saat inkübe edin.

2. Çözeltilerin hazırlanması

NOT: Tedavinin konsantrasyonu ve süreleri, DNA hasar onarım yollarının^15,16 aktivasyonuna işaret eden literatür sonuçlarına göre seçilmiştir.

1. Etoposit'in stok çözeltisini DMSO'da 50 mM konsantrasyonda hazırlayın. Stok çözeltisi birkaç ay boyunca -20 °C'de tutulabilir. Etoposid çözeltisini, 25 μM nihai konsantrasyonda tam kültür ortamında kullanım için seyreltin. Araç kontrolü olarak tam kültür ortamında seyreltilmiş %0.05'te DMSO kullanın.
2. 20x Tuzlu Sodyum Sitrat (SSC; 3.0 M NaCl, 0.30 M trisodyum sitrat pH 7.0) hazırlayın. Bu çözelti 4 °C'de birkaç ay saklanabilir.

3. Hücre tedavisi ve fiksasyonu

NOT: Hücrelerin hiçbir zaman kurumasına izin vermeyin; Önceki çözümlerden mümkün olduğunca yararlanmaya çalışın. Hücre fiksasyonu için uygun yöntem (buz gibi soğuk metanol veya% 4 paraformaldehit (PFA)), geleneksel bir immünofloresan deneyi kullanılarak antikor seyreltmesinin yanı sıra daha önce belirlenmelidir.

DİKKAT: Metanol uygun şekilde imha edilmelidir.

1. Kültür ortamını oyuklardan çıkarın ve sırasıyla 25 μM veya% 0.05'te etoposid veya DMSO içeren bir kültür ortamı ekleyin. Hücreleri 37 ° C'de% 5 CO₂ ve% 90 hava içeren nemlendirilmiş bir atmosferde etoposid veya DMSO ile 3 farklı süre boyunca inkübe edin: 20 dakika, 1 saat ve 3 saat. 384 plaka kullanılırken, tüm koşullar aynı anda sabitlenmelidir.
   1. Bunun için, durumu 3 saat gibi en uzun tedavi süresiyle tedavi ederek başlayın. 2 saat sonra, 1 saatlik tedavi koşulunu tedavi edin ve sabitleme için 20 dakika kaldığında, 20 dakikalık durumu tedavi edin. Bunu takiben, tüm koşullar aynı anda sabitlenebilir.
2. Ortamı kuyulardan çıkarın ve hücreleri PBS 3x ile yıkayın.
3. Kuyu yüzeyini kaplamak için yeterli hacme sahip buz gibi soğuk metanol ekleyerek hücreleri sabitleyin. -20 °C'de 10 dakika inkübe edin. Kuyuları PBS 3x ile yıkayın.
   NOT: Bu noktada protokol duraklatılabilir. Plakalar 4 °C'de 1 hafta saklanabilir.

4. Geçirgenlik ve engelleme

NOT: PFA fiksasyon yöntemi kullanılıyorsa, geçirgenlikten önce glisin ile bir blokaj adımı gerçekleştirilmelidir. Nem odası, inkübatörün içine bir su tavası konularak hazırlanabilir, bu da yaklaşık% 95'lik bir nem sağlar. 384 plaka veya slaytlar, filtre kağıdı veya nemli sünger ve şeffaf film üzerinde kapalı bir plastik kapta inkübe edilebilir.

1. Örneklerden PBS'ye dokunun.
2. 30-40 μL geçirgenleştirme tamponu (PBS'de% 0.2 Triton X-100) ekleyin ve oda sıcaklığında 20 dakika inkübe edin. PBS ile 3 kez yıkayın
3. Numunelerden PBS'ye dokunun ve PLA kitinde sağlanan 30-40 μL 1x blokaj solüsyonu ekleyin (alternatif olarak, PBS solüsyonunda% 3 Sığır Serum Albümini ve Triton X-100 % 0.1 kullanılabilir) her bir kuyucuğa/lamellere.
4. Plakayı önceden ısıtılmış bir nem odasında 37 °C'de 1 saat inkübe edin.

5. Birincil antikor inkübasyonu (PLA)

NOT: Lamel kullanılıyorsa, antikor solüsyonunun tüm lamel yüzeylerini kapladığından emin olmak önemlidir. Antikor seçimine özel dikkat gösterilmelidir. Antikorlar farklı hayvan türlerinden olmalı ve γ-H2AX için kullanılan ikincil antikor, PLA probları üretiminin tür konakçısına karşı olmamalıdır. Örneğin, PLA için kullanılan birincil antikorlar farelerde ve keçi hayvanlarında yetiştirildi. Eşekte PLA probları, anti-fare ve anti-keçi üretildi. γ-H2AX'e karşı antikor tavşanlarda üretildi ve ikincil olarak kullanılan anti-tavşan eşeklerde üretildi. Bu şekilde, ikincil PLA problarını tanımayacaktır.

1. Birincil antikorları (fare anti-Ku70 1:100 ve keçi anti-Nek4 1:50; tavşan anti-Nek5 1:25 ve fare anti-TOPIIβ 1:25) kitte sağlanan antikor seyrelticide seyreltin (alternatif olarak, PBS çözeltisinde Sığır Serum Albümininin %3'ü ve Triton X-100 %0.1'i kullanılabilir). Lamel kullanılıyorsa koşul başına 30 μL antikor çözeltisi veya 384 oyuklu bir plaka kullanılıyorsa kuyu başına 20 μL hazırlayın.
2. Engelleme çözümüne dokunun. Her oyuğa birincil antikor çözeltisini ekleyin. Gece boyunca 4 °C'de bir nem odasında inkübe edin.

6. PLA prob inkübasyonu

NOT: Sadece birincil antikorları değil, aynı zamanda immünofloresan adımlarında kullanılması amaçlananları da dikkate alarak probları seçin. 37 ° C'lik uzun inkübasyon için 384 oyuklu plakalar kullanıldığında, antikor çözeltisinin dağılımını iyileştirmek için yavaş rotasyon kullanılabilir.

1. Antikor seyrelticisindeki eksi ve artı probları 1: 5 oranında seyreltin. 384 oyuklu plakalar kullanılıyorsa oyuk başına 10 μL veya lamel kullanılıyorsa numune başına 20 μL hazırlayın. Aşağıdaki kombinasyonları kullanın: Eşek anti-fare eksi ile Eşek anti-keçi artı; Eşek anti-fare eksi Eşek anti-tavşan artı ile.
2. Birincil antikor solüsyonunu kapatın. 1x'i TBS-T (50 mM Tris pH 7.5, 150 mM NaCl, Tween-20'nin %0.05'i) ile yıkayın. Oda sıcaklığında TBS-T ile her birini 5 dakika boyunca 3 kez yıkayın. TBS-T ile ek bir yıkama yapın.
3. Hafifçe vurun ve plakalar için 10 μL ve lameller için 20 μL olan PLA prob çözeltisini ekleyin. Önceden ısıtılmış nem odasında 37 °C'de 1 saat inkübe edin.

7. Ligasyon

NOT: Numunelere eklemeden hemen öncesine kadar Ligase eklemek için bekleyin. Ligaz bir dondurucu blokta (-20 °C) saklanmalıdır. Ligaz solüsyonunu eklemeden önce tüm yıkama solüsyonunu tamamen çıkarın. Hücreleri uzun süre çözümsüz bırakmaktan kaçının. 37 °C inkübasyon için 384 oyuklu plakalar kullanıldığında, antikor çözeltisinin dağılımını iyileştirmek için yavaş rotasyon kullanılabilir.

1. 5x ligasyon tamponunu yüksek saflıkta suyla seyreltin. 384 oyuklu plakalar kullanılıyorsa oyuk başına 10 μL veya lamel kullanılıyorsa 20 μL hazırlayın.
2. PLA prob çözümüne dokunun. 1x'i TBS-T ile yıkayın. TBS-T kullanarak her biri 5 dakika süren üç ek yıkama ile devam edin. Son bir kez yıkayın ve bir sonraki adımdan önce TBS-T'ye hafifçe vurun.
3. Numunelere uygulamadan hemen önce 1:40'ta 1x Ligasyon çözeltisine Ligase ekleyin. Önceden ısıtılmış nem odasında 37 °C'de 30 dakika ila 1 saat arasında inkübe edin.

8. Amplifikasyon ve yıkama

NOT: Numuneye eklemeden hemen öncesine kadar polimerazı eklemek için bekleyin. Amplifikasyon tamponu ışığa duyarlıdır; Tampon içeren tüm çözeltileri ışıktan koruyun. Polimeraz bir dondurucu blokta (-20 °C) saklanmalıdır. Hücreleri uzun süre çözeltisiz bırakmaktan kaçının. 37 ° C inkübasyon için 384 oyuklu plakalar kullanıldığında, yavaş rotasyon antikor çözeltisinin dağılımını iyileştirebilir.

1. Polimeraz çözeltisini eklemeden önce tüm yıkama solüsyonunu tamamen çıkarın. Hücreleri uzun süre çözeltisiz bırakmaktan kaçının. 5x amplifikasyon tamponunu yüksek saflıkta suyla seyreltin. 384 oyuklu plakalar kullanılıyorsa oyuk başına 10 μL veya lamel kullanılıyorsa 20 μL hazırlayın.
2. Ligasyon çözümüne dokunun. 1x'i TBS-T ile yıkayın. TBS-T kullanarak her biri 5 dakika süren üç ek yıkama ile devam edin. Son bir kez yıkayın ve bir sonraki adımdan önce TBS-T'ye hafifçe vurun.
3. Polimerazı, numunelere uygulamadan hemen önce 1:80 seyreltmede 1x amplifikasyon çözeltisine ekleyin. Önceden ısıtılmış nem odasında 37 °C'de 100 dakika inkübe edin.
   NOT: Bu adımdan itibaren doğrudan ışığa maruz kalmaktan kaçının
4. Amplifikasyon arabelleğini kapatın. Her biri 10 dakika boyunca 1x SSC tamponu ile 2x yıkayın. Her biri 2 dakika boyunca 0.01x SSC tamponu ile 2x yıkayın.

9. γ-H2AX boyama (İmmünofloresan - IF)

NOT: γ-H2AX'in etiketlenmesi, PLA bittikten sonra gerçekleştirilir.

1. Primer antikor inkübasyonu (IF)
   1. Birincil antikorları (1:100'de tavşan anti yH2AX) bloke edici çözelti içinde seyreltin (alternatif olarak, PBS çözeltisinde% 3 Sığır Serum Albümini ve Triton X-100% 0.1 kullanılabilir). Lamel kullanılıyorsa oyuk başına 30 μL antikor çözeltisi veya 384 oyuklu bir plaka kullanılıyorsa 20 μL antikor çözeltisi hazırlayın.
   2. 0,01x SSC çözümünden yararlanın. PBS ile 2 kez yıkayın.
   3. Her oyuğa birincil antikor çözeltisini ekleyin. Oda sıcaklığında 1 saat inkübe edin.
2. İkincil antikor inkübasyonu (IF)
   NOT: Seçilen ikincil antikorların PLA antikorlarını veya problarını tanımadığından emin olun. Ek olarak, ikincil antikorun dalga boyu, PLA algılama reaktifi dalga boyundan farklı olmalıdır. Örneğin: PLA algılama reaktifimiz florofor 647 içerir ve γ-H2AX tespiti için kullandığımız ikincil reaktifimiz 488'dir.
   1. İkincil antikorları (Eşek anti-Tavşan Alexa Fluor 488) bloke edici çözelti içinde seyreltin (alternatif olarak, PBS çözeltisinde% 3 Sığır Serum Albümini ve Triton X - 100% 0.1 kullanılabilir) 1: 300 seyreltmede. Lamel kullanılıyorsa koşul başına 30 μL antikor çözeltisi veya 384 oyuklu bir plaka kullanılıyorsa kuyu başına 20 μL hazırlayın. 0.6 μg/mL nihai konsantrasyonda Hoechst 33342 boyası ekleyin.
   2. Birincil antikor solüsyonunu kapatın. 3x'i TBS-T ile yıkayın.
   3. İkincil antikor çözeltisini her bir oyuğa ekleyin. Oda sıcaklığında 20 dakika inkübe edin.
   4. TBS-T ile 5x yıkayın. 2x'i 1x SSC tamponu ile yıkayın. 2x'i 0.01x SSC tamponu ile yıkayın.
      NOT: Bu noktada, plakalar ışıktan korunarak 4 °C'de (SSC 0.01X'te) birkaç hafta saklanabilir. Lamel kullanılıyorsa, slaytlar monte edilebilir ve 1 gün sonra slaytlar -20 °C'de saklanabilir.

10. Görüntü edinme

1. Geleneksel bir floresan mikroskobu ve 63x objektif kullanın. Doygunluk ve noktaların çökmesini önlemek için negatif ve pozitif kontrolleri karşılaştırarak pozlama süresini belirleyin.
   NOT: Konfokal mikroskopların kullanılması, PLA nokta algılamasını geliştirir. 20x hedefi, tespit edilen çekirdek sayısını artırmak için de kullanılabilir.
2. Sergileme süresi ayarlandıktan sonra, PLA noktalarının tüm alımlarını aynı parametrelerle gerçekleştirin. Homojen olmayan inkübasyon nedeniyle artefaktları önlemek için farklı kuyucuklardan veya lamel bölgelerinden görüntüler elde etmeye çalışın.
3. Tüm kanalları aynı ad deseniyle kaydedin. Mikroskop kanallarda ayrı ayrı fotoğraf çekiyorsa, kanalı ayırt etmek için dosya adının başına yalnızca PLA veya Nucleus ekleyerek karşılık gelen görüntüleri aynı adla kaydedin.

11. Görüntü analizi

NOT: Resim J/FIJI^17'de çekirdek başına nokta sayısı analizi için ve ölçek bilgilerinin manuel olarak eklenmesi gereken mikroskoplarla kullanılmak üzere bir makro oluşturulmuştur. Kullanılan objektif lensin piksel boyutu bilinmelidir. Her kanal için görüntüleri farklı klasörlere yerleştirin (Ek Kodlama Dosyası 1, Ek Şekil 1).
NOT: Makro, ayrı olarak elde edilen floresan kanallarını dikkate alır. Bu durumda, tüm görüntüleri aynı adla kaydetmek önemlidir.

1. Makro, alanda belirli bir bölgenin seçilmesine izin verir. Görüntüdeki bir bölge analiz için zararlı olabilecek yapıtlar gösterdiğinde bir ROI seçin seçeneğini kullanın. Analizin başında ROI'yi seçin ve tüm görüntüler için kullanın.
   NOT: Bu isteğe bağlı bir özelliktir. Seçilmezse, görüntünün tamamı analizde dikkate alınacaktır (Ek Şekil 2).
2. ROI dosyası, aşağıda açıklandığı gibi makro kullanımından önce oluşturulmalıdır. ROI seçimi için dikdörtgen bir araç kullanın, analiz için bölgeyi seçin ve Düzenle > Seçimi> Yöneticiye Ekle'ye tıklayarak ROI yöneticisine ekleyin. Diğer> Kaydet'e tıklayarak ROI'yi kaydedin.
3. ImageJ ^17'de, analiz için parametreleri ayarlamak üzere farklı koşullardan görüntüleri açın. Bu parametreler kullanıcı tarafından belirlenmeli ve verilerle birlikte makro programında belirtilmelidir (Ek Kodlama Dosyası 1)
   1. Arka plan düzeltme: Arka planı kaldırmak için İşlem> Arka Planı Çıkar'ı tıklayın. Önizleme işlevini kullanarak farklı yuvarlanan top yarıçapını test edin). PLA noktaları için 10 haddeleme ve çekirdek için 100 haddeleme kullandık.
   2. Paraziti Kaldır'> Gürültü > Kaldır'a tıklayarak gürültüyü kaldırın. Çekirdek için, Process>Smooth'a tıklayarak çekirdeğin dolumunu iyileştirmek için smooth işlevini kullanın.
   3. Eşiği ayarlama: 8 bitlik görüntüye dönüştürün ve Görüntü > Türü > 8 bit ve Görüntü > Ayarla >Eşik'e tıklayarak eşiği ayarlayın. Görüntüde bulunan tüm çekirdeği veya noktaları görselleştirmek, ancak aşırı doygunluktan ve yapıların çökmesini önlemek için eşiği buna göre ayarlayın. Değerlerin notlarını alın ve eşiğin farklı görüntüler için çalışıp çalışmadığını kontrol etmek için farklı görüntülerde test edin.
   4. Maskeye dönüştür seçeneğini tıklatarak İkili > > Maskeye dönüştür'ü tıklatın. Çekirdek söz konusu olduğunda, İşlem > İkili > Boşlukları Doldur'a ve ardından İşlem > İkili > Havzası'na tıklayın. PLA noktaları söz konusu olduğunda, İşlem'i > İkili > Havzası'nı tıklayın.
   5. Çekirdekleri saymak için, ortalama boyutu tahmin etmek için farklı çekirdeklerin alanını veya uzunluğunu ölçün. Parçacıkları analiz etmek için yaklaşık bir değer kullanın. Analiz Et > Parçacıkları Analiz Et'e tıklayın, ardından Boyutu ayarla: 15 sonsuz'u seçin (bu değerler çekirdeğin boyutuna bağlıdır). Aşağıdaki seçenekleri kontrol edin: Göster: Maske; Sonuçları görüntüle; Net sonuçlar; Özetle; Yöneticiye Ekle; Kenarları hariç tutun.
   6. PLA noktalarını saymak için, ortalama boyutu tahmin etmek için noktaların alanını veya yarıçapını ölçün.  Çekirdek Maskesini Uygula'yı seçin (maske uygula GDSC eklentisinde bir işlevdir, kurulu olup olmadığını kontrol edin) ve ardından Analiz Et > Parçacıkları Analiz Et ve ayarlayın. 0.02-3 (bu değerler çekirdeğin boyutuna bağlıdır). Aşağıdaki seçenekleri kontrol edin: Göster: Maske; Sonuçları görüntüle; Net sonuçlar; Özetle; Yöneticiye Ekle; Kenarları hariç tutun.
4. Sonuçlar, görüntüde bulunan her çekirdekteki çekirdek başına nokta sayısını gösterir. Bu verileri kaydedin.

12. Birleştirilen görüntüleri görselleştirme

1. PLA, çekirdek ve γ-H2AX'e karşılık gelen kanalları açın. Tüm görüntüler için 11.4.1 ve 11.4.2 adımlarında belirtildiği gibi arka planı çıkarın ve gürültüyü kaldırın.
2. Parlaklığı ve kontrastı otomatik olarak veya aynı kanaldaki tüm koşullar için aynı değeri kullanarak manuel olarak ayarlayın.  Görüntü > Parlak/kontrast > Ayarla'yı seçin.
3. Görüntü > Renk > Kanalları birleştir'i seçerek görüntüleri birleştirin (birleştirme). Ölçek çubuğunu Çözümle > Araçları'> seçerek ölçek çubuğu ekleyin. Farklı kaydet'i tıklayın. TIFF dosyası.

Sonuçlar

Etoposid tedavisinin yokluğunda Nek4-Ku70 etkileşimini gözlemledik. Bununla birlikte, bu etkileşim çekirdeğin dışında gerçekleşebilir (Şekil 1A). Nek4-Ku70 etkileşimi, DNA hasarından sonra artar ve çekirdekte yoğunlaşır (Şekil 1A). Nek5-Topoizomeraz II β (TOPIIβ) etkileşimi durumunda, bu testte literatür sonuçlarına¹⁸ dayalı pozitif bir kontrol olarak kullanılır, etkileşim eto...

Tartışmalar

Veriler, PLA'nın DNA hasarlı bir işaretleyici ile eşzamanlı olarak kullanılmasının, hakaretten sonraki etkileşimin uzamsal ve zamansal davranışını gösteren bir DNA hasar yanıtı profillemesinde en fazla bilgiyi sağlayabileceğini göstermektedir. PLA, dimerizasyon tanımlaması, organel temas tayini, protein-nükleik asit etkileşimi ve esas olarak protein-protein etkileşimi için kullanılan çok yönlü bir yöntemdir 10,11,19,20.

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Black 384-well plates	Perkin Elmer Cell carrier plates
Donkey  anti- Rabbit Alexa Fluor 488	Invitrogen	A21206	1:300
Duo link Donkey anti Mouse Minus	Sigma	DUO92004
Duolink antibody diluent	Sigma	DUO82008
Duolink blocking solution 1X	Sigma	DUO82007
Duolink Detection reagent Far red	Sigma	DUO92013
Duolink Donkey anti goat plus	Sigma	DUO92003
Duolink Donkey anti rabbit plus	Sigma	DUO92002
Etoposide	Sigma	E1383
Goat anti Nek4	Santa Cruz Biotechnology	SC-5517	goat anti Nek4 was used at 1:50 dilution
Hoechst 33342	Thermo	H1399	0.6 µg/mL
Leica DMI microscope	Leica
Mouse anti Ku70	Thermo	MA5-13110	mouse anti Ku70 was used at 1:100 dilution
Mouse anti TOPIIβ	Santa Cruz Biotechnology	SC-365071	1:25
Rabbit anti Nek5	Santa Cruz Biotechnology	SC-84527	1:25
Rabbit anti Y H2AX	Cell Signalling	9718S	1:100 dilution
U2OS cell line	ATCC	HTB-96