Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliği gereklidir. Oturum açın veya ücretsiz deneme sürümünü başlatın.
DNA Hasar Bölgelerindeki Proteinleri Lokalize Etmek için Yakınlık Ligand Testi
Bu Makalede
Özet
Burada, DNA hasar bölgelerinde protein etkileşiminin tespiti için basit ve hızlı bir protokol sunuyoruz.
Özet
DNA hasar tepkisi, hücreleri hasarlı DNA'yı sürdürmekten koruyan bir genetik bilgi korumasıdır. Bu süreçte işbirliği yapan proteinlerin karakterizasyonu, kanser, yaşlanmaya bağlı hastalıklar ve kronik inflamasyon gibi çeşitli hastalıklarda terapötik müdahale için alternatif hedeflerin belirlenmesine olanak tanır. Yakınlık Ligand Testi (PLA), proteinler arasındaki etkileşimin yanı sıra organeller veya hücresel yapılar arasındaki uzamsal yakınlığı tahmin etmek için bir araç olarak ortaya çıktı ve örneğin stres koşulları altında zamansal lokalizasyon ve ko-lokalizasyon analizine izin verdi. Yöntem basittir çünkü geleneksel immünofloresansa benzer ve bir organelin, hücresel yapının veya mitokondri, endoplazmik retikulum, PML cisimcikleri veya DNA çift sarmallı markör, yH2AX gibi spesifik bir markörün aynı anda boyanmasına izin verir. S139'un Histon 2A varyantı H2AX'te fosforilasyonu, daha sonra yH2AX olarak anılır, DNA çift iplikli kırılmalarının çok hassas ve spesifik bir belirteci olarak yaygın olarak kullanılır. yH2AX boyamanın her odağı, hasardan birkaç dakika sonra meydana gelen DNA'daki bir kırılmaya karşılık gelir. yH2AX odaklarındaki değişikliklerin analizi, ilgilenilen proteinin DNA hasar tepkisinde (DDR) rol oynayıp oynamadığını incelemek için en yaygın testtir. DNA hasar bölgesinde doğrudan bir rol beklenip beklenmediği, ilgilenilen proteinin yH2AX odakları ile kolokalizasyonunu doğrulamak için floresan mikroskobu kullanılır. Bununla birlikte, yeni süper çözünürlüklü floresan yöntemleri dışında, sonuç olarak, DNA hasar bölgeleri ile yerel etkileşim biraz öznel olabilir. Burada, hasar bölgesinin bir belirteci olarak yH2AX kullanarak DDR yolundaki proteinlerin lokalizasyonunu değerlendirmek için bir test gösteriyoruz. Bu test, DNA hasarına neden olan farklı hakaretler altında temporal lokalizasyonu karakterize etmek için kullanılabilir.
Giriş
Hücresel DNA hasarı, spontan kimyasal reaksiyonlar nedeniyle günlük olarak ortaya çıkar ve ayrıca genotoksik ajanlar (radyasyon ve etoposit gibi kimyasallar) ve oksidatif stres gibi eksojen faktörler tarafından da artar 1,2,3. Hücreler, bazların çıkarılmasından replikatif çatal burulmasına veya en zararlı lezyonun kesilmesine kadar sayısız farklı DNA hasarını düzelten karmaşık bir makineye sahiptir: DNA çift iplikli kırılma 4,5.
DDR'ye katılan birkaç protei....
Protokol
1. Hücre kaplama
NOT: Hücreler mikroskobik floresan slaytlara, odalara veya plakalara ekilebilir. Birden fazla koşulun ve yedek reaktiflerin test edilmesi için küçük lamellerin veya 96/384 kuyulu plakaların kullanılması önerilir. HEK293 hücreleri gibi kolayca ayrılan hücre hatları için lamellerin kullanılması tavsiye edilir. Lameller, ataşmanı iyileştirmek için önceden bir poli-L-lizin çözeltisi ile kaplanabilir.
- Bir araç düşünülen plaka hücreleri, teknik kontroller ve biyolojik kontroller. Koşul başına iki veya üç kuyuda teknik kopyalar kullanın.
NOT: Teknik kontrolün kullanıl....
Temsili Sonuçlar
Etoposid tedavisinin yokluğunda Nek4-Ku70 etkileşimini gözlemledik. Bununla birlikte, bu etkileşim çekirdeğin dışında gerçekleşebilir (Şekil 1A). Nek4-Ku70 etkileşimi, DNA hasarından sonra artar ve çekirdekte yoğunlaşır (Şekil 1A). Nek5-Topoizomeraz II β (TOPIIβ) etkileşimi durumunda, bu testte literatür sonuçlarına18 dayalı pozitif bir kontrol olarak kullanılır, etkileşim eto.......
Tartışmalar
Veriler, PLA'nın DNA hasarlı bir işaretleyici ile eşzamanlı olarak kullanılmasının, hakaretten sonraki etkileşimin uzamsal ve zamansal davranışını gösteren bir DNA hasar yanıtı profillemesinde en fazla bilgiyi sağlayabileceğini göstermektedir. PLA, dimerizasyon tanımlaması, organel temas tayini, protein-nükleik asit etkileşimi ve esas olarak protein-protein etkileşimi için kullanılan çok yönlü bir yöntemdir 10,11,19,20.
Açıklamalar
Yazarlar, rekabet eden herhangi bir mali çıkarları olmadığını beyan ederler.
Teşekkürler
Fundação de Amparo a Pesquisa do Estado de São Paulo'ya (FAPESP, Grant Temático 2022/15126-9'dan JK'ya ve 21/09439-1 bursundan LARM'a) ve Conselho Nacional de Desenvolvimento Cientifico e Tecnológico'ya (CNPq) bu araştırmayı finanse ettikleri için teşekkür ederiz.
....Malzemeler
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Black 384-well plates | Perkin Elmer Cell carrier plates | ||
| Donkey anti- Rabbit Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A21206 | 1:300 |
| Duo link Donkey anti Mouse Minus | Sigma | DUO92004 | |
| Duolink antibody diluent | Sigma | DUO82008 | |
| Duolink blocking solution 1X | Sigma | DUO82007 | |
| Duolink Detection reagent Far red | Sigma | DUO92013 | |
| Duolink Donkey anti goat plus | Sigma | DUO92003 | |
| Duolink Donkey anti rabbit plus | Sigma | DUO92002 | |
| Etoposide | Sigma | E1383 | |
| Goat anti Nek4 | Santa Cruz Biotechnology | SC-5517 | goat anti Nek4 was used at 1:50 dilution |
| Hoechst 33342 | Thermo | H1399 | 0.6 µg/mL |
| Leica DMI microscope | Leica | ||
| Mouse anti Ku70 | Thermo | MA5-13110 | mouse anti Ku70 was used at 1:100 dilution |
| Mouse anti TOPIIβ | Santa Cruz Biotechnology | SC-365071 | 1:25 |
| Rabbit anti Nek5 | Santa Cruz Biotechnology | SC-84527 | 1:25 |
| Rabbit anti Y H2AX | Cell Signalling | 9718S | 1:100 dilution |
| U2OS cell line | ATCC | HTB-96 |
Referanslar
- Xiao, W., Samson, L. In vivo evidence for endogenous DNA alkylation damage as a source of spontaneous mutation in eukaryotic cells. Proc Nat Acad Sci U S A. 90 (6), 2117-2121 (1993).
- Lindahl, T., Barnes, D. E. R....
Yeniden Basımlar ve İzinler
Bu JoVE makalesinin metnini veya resimlerini yeniden kullanma izni talebi
Izin talebiThis article has been published
Video Coming Soon
JoVE Hakkında
Telif Hakkı © 2020 MyJove Corporation. Tüm hakları saklıdır