DNA 손상 부위의 단백질을 국소화하기 위한 Proximity Ligand Assay

요약

여기에서는 DNA 손상 부위에서 단백질 상호 작용을 검출하기 위한 간단하고 신속한 프로토콜을 제시합니다.

초록

DNA 손상 반응은 손상된 DNA가 영속화되지 않도록 세포를 보호하는 유전 정보 보호 장치입니다. 이 과정에서 협력하는 단백질의 특성 분석을 통해 암, 노화 관련 질병 및 만성 염증과 같은 여러 질병에서 치료 개입을 위한 대체 표적을 식별할 수 있습니다. PLA(Proximity Ligand Assay)는 단백질 간의 상호 작용과 세포 기관 또는 세포 구조 간의 공간적 근접성을 추정하기 위한 도구로 부상했으며 예를 들어 스트레스 조건에서 시간적 국소화 및 공동 국소화 분석을 가능하게 합니다. 이 방법은 기존 면역형광과 유사하고 소기관, 세포 구조 또는 미토콘드리아, 소포체, PML 소체 또는 DNA 이중 가닥 마커, yH2AX와 같은 특정 마커를 동시에 염색할 수 있기 때문에 간단합니다. 히스톤 2A 변이체인 H2AX에서 S139의 인산화는 yH2AX라고 하며, DNA 이중 가닥 파손의 매우 민감하고 특이적인 마커로 널리 사용됩니다. yH2AX 염색의 각 초점은 손상 후 몇 분 후에 발생하는 DNA의 한 번의 절단에 해당합니다. yH2AX 병소의 변화 분석은 관심 단백질이 DNA 손상 반응(DDR)과 관련이 있는지 여부를 연구하기 위한 가장 일반적인 분석법입니다. DNA 손상 부위에서 직접적인 역할이 예상되는지 여부에 관계없이 형광 현미경을 사용하여 yH2AX 초점과 함께 관심 단백질의 공동 국소화를 확인합니다. 그러나 새로운 초고해상도 형광 방법을 제외하고, 결론적으로 DNA 손상 부위와의 국부적 상호 작용은 약간 주관적일 수 있습니다. 여기에서는 yH2AX를 손상 부위의 마커로 사용하여 DDR 경로에서 단백질의 국소화를 평가하는 분석을 보여줍니다. 이 분석은 DNA 손상을 일으키는 다양한 모욕 하에서 시간적 국소화를 특성화하는 데 사용할 수 있습니다.

서문

세포 DNA 손상은 자발적인 화학 반응으로 인해 매일 발생하며 유전 독성 물질(방사선 및 에토포사이드와 같은 화학 물질) 및 산화 스트레스 ^1,2,3과 같은 외인성 요인에 의해서도 증가합니다. 세포는 염기 제거에서 복제 포크 비틀림 또는 중단, 가장 해로운 병변 인 DNA 이중 가닥 절단 ^4,5에 이르기까지 무수히 많은 유형의 DNA 손상을 교정하는 복잡한 기계를 가지고 있습니다.

DDR에 참여하는 여러 단백질은 이미 특성화되었으며, 탁월한 수정은 이중 가닥 절단(DSB) 수리 ^5,6에 암시된 주요 경로인 NHEJ(non-homologous end join) 및 HR(homologous recombination)의 경로를 탐색합니다. 세린 139(이후 y-H2AX로 명명됨)에서 히스톤 H2A 변이체인 H2AX의....

프로토콜

1. 셀 도금

참고: 세포는 미세한 형광 슬라이드, 챔버 또는 플레이트에 파종할 수 있습니다. 여러 조건 및 예비 시약을 테스트하려면 소형 커버슬립 또는 96/384 웰 플레이트를 사용하는 것이 좋습니다. HEK293 세포와 같이 쉽게 분리되는 세포주에는 커버슬립을 사용하는 것이 좋습니다. 커버슬립은 부착을 개선하기 위해 사전에 폴리-L-라이신 용액으로 코팅할 수 있습니다.

1. 차량, 기술적 제어 및 생물학적 제어를 고려한 플레이트 셀. 조건당 2개 또는 3개의 웰에서 기술 반복실험을 사용합니다.
   참고: 기술 제어(보조 및 주 전원 모두)의 사용은 필수입니다. 가능한 경우 생물학적 제어도 포함되어야 합니다(예: 표적 단백질 중 하나의 과발현 또는 녹다운 또는 상호 작용을 변경하는 것으로 알려진 조건).
   1. FBS(Fetal Bovine Serum) 10%, 4.5g/L 포도당 및 4mM의 L-글루타민이 보충된 Dulbecco의 DMEM(Modified Eagle Medium)에서 U2OS 세포를 5% CO₂ 및 90% 공기가 포함된 가습 분위기에서 37°C에서 조직 배양 처리된 플레이트에서 배양합니다. 테....

토론

이 데이터는 DNA 손상 마커와 함께 PLA를 사용하면 DNA 손상 반응 프로파일링에서 가장 많은 정보를 제공할 수 있으며, 모욕 후 상호 작용의 공간적 및 시간적 거동을 보여줄 수 있음을 보여줍니다. PLA는 이합체화 식별, 소기관 접촉 측정, 단백질-핵산 상호 작용 및 주로 단백질-단백질 상호 작용 10,11,19,20<.......

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
Black 384-well plates	Perkin Elmer Cell carrier plates
Donkey  anti- Rabbit Alexa Fluor 488	Invitrogen	A21206	1:300
Duo link Donkey anti Mouse Minus	Sigma	DUO92004
Duolink antibody diluent	Sigma	DUO82008
Duolink blocking solution 1X	Sigma	DUO82007
Duolink Detection reagent Far red	Sigma	DUO92013
Duolink Donkey anti goat plus	Sigma	DUO92003
Duolink Donkey anti rabbit plus	Sigma	DUO92002
Etoposide	Sigma	E1383
Goat anti Nek4	Santa Cruz Biotechnology	SC-5517	goat anti Nek4 was used at 1:50 dilution
Hoechst 33342	Thermo	H1399	0.6 µg/mL
Leica DMI microscope	Leica
Mouse anti Ku70	Thermo	MA5-13110	mouse anti Ku70 was used at 1:100 dilution
Mouse anti TOPIIβ	Santa Cruz Biotechnology	SC-365071	1:25
Rabbit anti Nek5	Santa Cruz Biotechnology	SC-84527	1:25
Rabbit anti Y H2AX	Cell Signalling	9718S	1:100 dilution
U2OS cell line	ATCC	HTB-96