DNA 손상 부위의 단백질을 국소화하기 위한 Proximity Ligand Assay

요약

여기에서는 DNA 손상 부위에서 단백질 상호 작용을 검출하기 위한 간단하고 신속한 프로토콜을 제시합니다.

초록

DNA 손상 반응은 손상된 DNA가 영속화되지 않도록 세포를 보호하는 유전 정보 보호 장치입니다. 이 과정에서 협력하는 단백질의 특성 분석을 통해 암, 노화 관련 질병 및 만성 염증과 같은 여러 질병에서 치료 개입을 위한 대체 표적을 식별할 수 있습니다. PLA(Proximity Ligand Assay)는 단백질 간의 상호 작용과 세포 기관 또는 세포 구조 간의 공간적 근접성을 추정하기 위한 도구로 부상했으며 예를 들어 스트레스 조건에서 시간적 국소화 및 공동 국소화 분석을 가능하게 합니다. 이 방법은 기존 면역형광과 유사하고 소기관, 세포 구조 또는 미토콘드리아, 소포체, PML 소체 또는 DNA 이중 가닥 마커, yH2AX와 같은 특정 마커를 동시에 염색할 수 있기 때문에 간단합니다. 히스톤 2A 변이체인 H2AX에서 S139의 인산화는 yH2AX라고 하며, DNA 이중 가닥 파손의 매우 민감하고 특이적인 마커로 널리 사용됩니다. yH2AX 염색의 각 초점은 손상 후 몇 분 후에 발생하는 DNA의 한 번의 절단에 해당합니다. yH2AX 병소의 변화 분석은 관심 단백질이 DNA 손상 반응(DDR)과 관련이 있는지 여부를 연구하기 위한 가장 일반적인 분석법입니다. DNA 손상 부위에서 직접적인 역할이 예상되는지 여부에 관계없이 형광 현미경을 사용하여 yH2AX 초점과 함께 관심 단백질의 공동 국소화를 확인합니다. 그러나 새로운 초고해상도 형광 방법을 제외하고, 결론적으로 DNA 손상 부위와의 국부적 상호 작용은 약간 주관적일 수 있습니다. 여기에서는 yH2AX를 손상 부위의 마커로 사용하여 DDR 경로에서 단백질의 국소화를 평가하는 분석을 보여줍니다. 이 분석은 DNA 손상을 일으키는 다양한 모욕 하에서 시간적 국소화를 특성화하는 데 사용할 수 있습니다.

서문

세포 DNA 손상은 자발적인 화학 반응으로 인해 매일 발생하며 유전 독성 물질(방사선 및 에토포사이드와 같은 화학 물질) 및 산화 스트레스 ^1,2,3과 같은 외인성 요인에 의해서도 증가합니다. 세포는 염기 제거에서 복제 포크 비틀림 또는 중단, 가장 해로운 병변 인 DNA 이중 가닥 절단 ^4,5에 이르기까지 무수히 많은 유형의 DNA 손상을 교정하는 복잡한 기계를 가지고 있습니다.

DDR에 참여하는 여러 단백질은 이미 특성화되었으며, 탁월한 수정은 이중 가닥 절단(DSB) 수리 ^5,6에 암시된 주요 경로인 NHEJ(non-homologous end join) 및 HR(homologous recombination)의 경로를 탐색합니다. 세린 139(이후 y-H2AX로 명명됨)에서 히스톤 H2A 변이체인 H2AX의 인산화는 이중 가닥 절단의 민감하고 신뢰할 수 있는 마커로 수년 동안 사용되어 왔습니다. H2AX의 인산화는 손상 후 처음 몇 분 동안 관찰되며 몇 시간 동안 지속될 수 있다⁷.

γ-H2AX 병소의 면역형광 검출을 사용하면 유리의 시간적, 공간적 분포를 특성화하고 다른 단백질과의 동시 염색을 할 수 있다는 장점이 있습니다. 또한, 면역형광은 용해가 필요하지 않아 세포 컨텍스트 정보를 보존하고 더 많은 정보를 제공합니다. 게다가, γ-H2AX는 de novo로 형성되기 때문에 DNA 손상이 없는 경우 풍부하게 존재하지 않아 특이적 마커(specific marker)가 된다⁷.

H2AX는 주로 DSB의 센서인 단백질 키나아제 운동실조-모세혈관 확장증 돌연변이(ATM) 및 DNA 의존성 단백질 키나아제(DNA-PK)에 의해 인산화됩니다. Ku70/80(XRCC6 X선 복구 교차 보완 6/ XRCC5 X선 복구 교차 보완 5) 및 DNA-단백질 키나아제 촉매 소단위(DNA-PKcs)는 DSB 식별 및 DNA 말단 보호를 담당하는 반면, Artemis는 XRCC4-Ligase IV 복합체에 의한 결찰을 용이하게 하기 위해 말단 처리를 수행합니다. DSB에 인접한 부위에서 H2AX의 인산화는 여러 복구 단백질의 모집 및 세포주기 정지, 사멸 또는 생존에 대한 신호로 작용합니다⁸.

y-H2AX 병소의 변화 분석은 관심 단백질이 DNA 손상 반응과 관련이 있는지 여부를 연구하기 위한 가장 일반적인 분석법입니다. DNA 손상 부위에서 직접적인 역할이 예상되는지 여부에 관계없이 형광 현미경을 사용하여 y-H2AX 병소와 관심 단백질의 공동 국소화를 확인합니다. 그러나 새로운 초고해상도 형광 방법을 제외하고는 DNA 손상 부위와의 국부적 상호 작용을 결론짓는 것이 까다로울 수 있습니다. 또한, 면역형광 검출은 일반적으로 DNA 손상 부위의 많은 단백질 분자에 의존하기 때문에 희소한 단백질을 식별하기가 어렵습니다⁹.

여기에서는 y-H2AX를 손상 부위의 마커로 사용하여 DDR 경로에 관여하는 단백질의 국소화를 평가하는 분석을 보여줍니다. 이 분석은 DNA 손상을 일으키는 다양한 모욕 하에서 시간적 국소화를 특성화하는 데 사용할 수 있습니다.

PLA(Proximity Ligand Assay)는 단백질 간의 상호 작용뿐만 아니라 세포 소기관 또는 세포 구조 간의 공간적 근접성을 추정하기 위한 도구로 부상했으며(^10,11) 예를 들어 스트레스 조건에서 시간적 국소화 및 공동 국소화 분석을 가능하게 합니다. 이 방법은 기존의 면역형광과 유사하고 미토콘드리아, 소포체, PML 본체 또는 DNA 이중 가닥 마커(yH2AX)와 같은 세포 기관 또는 세포 구조 특이적 마커를 동시에 염색할 수 있기 때문에 간단합니다. PLA를 사용하면 세포 주기 동안, 다양한 자극에 대한 반응으로, 유전독성 스트레스 후 다른 시간에 상호 작용을 모니터링하는 데 사용할 수 있는 민감하고 특이적이며 신뢰할 수 있는 방식으로 DNA 손상 중 단백질 상호 작용을 식별할 수 있습니다.

여기에서는 에토포시드 유도 DNA 손상 후 Nek4-Ku70 상호 작용을 국소화하기 위해 기존의 γ-H2AX 면역형광과 동시에 PLA를 사용하는 방법을 보여줍니다. Nek4, Nek (NIMA-related kinases) 가족 구성원은 DNA 손상 반응에 명확한 역할을 하지 않습니다. 2012년 응우옌(Nguyen)과 동료들은 Nek4가 Ku70/Ku80 단백질과 상호 작용하며, Nek4가 없을 경우 이러한 단백질이 DNA 손상 부위에 모집되지 않고 H2AX 인산화가 손상된다는 것을 보여주었습니다¹². 이 상호 작용의 세포 국소화는 지금까지 알려져 있지 않습니다. 우리는 Nek4 kinase-dead mutant¹³을 발현하는 세포에서 Ku70 인산화의 감소를 관찰했지만 Nek4가 Ku70을 직접 인산화하는지 여부는 아직 밝혀지지 않았습니다. 면역침전 연구¹²에 따라 에토포시드 처리 후 Ku70과의 Nek4 상호 작용이 증가한다는 점을 고려하여 PLA 및 γ-H2AX 마커를 사용하여 이 상호 작용을 국소화하려고 시도합니다.

일반적으로 상호 작용 연구는 면역침전 분석을 기반으로 하지만 이는 시험관 내에 있으며 상호 작용 위치에 대한 정보를 제공하지 않습니다. 가능한 경우 분획된 세포(핵, 미토콘드리아, 세포막 또는 세포질)의 면역침전을 수행할 수 있지만 상호 작용의 시간 경과를 수행하는 것은 비용이 많이 들고 힘들다. 면역형광은 단백질의 세포 국소화에 대한 정보를 제공할 수 있지만, 상호 작용을 증명하는 것은 어려울 수 있으며 현미경의 해상도에 따라 달라집니다. 여기에서는 Proximity Ligand Assay를 사용하여 DNA 손상 상황에서 두 단백질의 상호 작용을 모니터링하는 이점을 보여줍니다.

프로토콜

1. 셀 도금

참고: 세포는 미세한 형광 슬라이드, 챔버 또는 플레이트에 파종할 수 있습니다. 여러 조건 및 예비 시약을 테스트하려면 소형 커버슬립 또는 96/384 웰 플레이트를 사용하는 것이 좋습니다. HEK293 세포와 같이 쉽게 분리되는 세포주에는 커버슬립을 사용하는 것이 좋습니다. 커버슬립은 부착을 개선하기 위해 사전에 폴리-L-라이신 용액으로 코팅할 수 있습니다.

1. 차량, 기술적 제어 및 생물학적 제어를 고려한 플레이트 셀. 조건당 2개 또는 3개의 웰에서 기술 반복실험을 사용합니다.
   참고: 기술 제어(보조 및 주 전원 모두)의 사용은 필수입니다. 가능한 경우 생물학적 제어도 포함되어야 합니다(예: 표적 단백질 중 하나의 과발현 또는 녹다운 또는 상호 작용을 변경하는 것으로 알려진 조건).
   1. FBS(Fetal Bovine Serum) 10%, 4.5g/L 포도당 및 4mM의 L-글루타민이 보충된 Dulbecco의 DMEM(Modified Eagle Medium)에서 U2OS 세포를 5% CO₂ 및 90% 공기가 포함된 가습 분위기에서 37°C에서 조직 배양 처리된 플레이트에서 배양합니다. 테스트할 조건의 수에 따라 60mm 플레이트에서 384 또는 커버슬립을 사용하는 경우 각각 60mm 또는 100mm 플레이트에서 시작합니다.
   2. 세포가 60%-70% 밀도에 도달하면 0.25% 트립신-EDTA ¹⁴를 사용하여 세포를 분할합니다. Neubauer 챔버 또는 자동 카운터¹⁴를 사용하여 세포 계수. 여러 개의 13mm 원형 커버슬립이 포함된 60mm 플레이트에 4 x 10⁵ 셀 또는 384웰 플레이트에 웰당 4 x 10⁵ 셀을 플레이트하고 가습된 5% CO₂ 인큐베이터에서 37°C에서 12 - 24시간 동안 배양합니다.

2. 용액 준비

참고: 치료의 농도와 시간은 DNA 손상 복구 경로^15,16의 활성화를 지적하는 문헌 결과를 기반으로 선택되었습니다.

1. DMSO에서 50mM 농도로 Etoposide의 원액을 준비합니다. 원액은 -20 °C에서 몇 달 동안 보관할 수 있습니다. 최종 농도 25μM에서 전체 배양 배지에 사용하기 위해 에토포사이드 용액을 희석합니다. 완전 배양 배지에 0.05% 희석된 DMSO를 차량 제어로 사용합니다.
2. 20x 식염수 구연산나트륨(SSC; 3.0M NaCl, 0.30M 구연산삼나트륨 pH 7.0)을 준비합니다. 이 용액은 4 °C에서 몇 달 동안 보관할 수 있습니다.

3. 세포 처리 및 고정

알림: 세포가 어떤 순간에도 건조되지 않도록 하십시오. 가능한 한 이전 솔루션을 활용하십시오. 세포 고정을 위한 적절한 방법(얼음처럼 차가운 메탄올 또는 4% 파라포름알데히드(PFA))은 기존의 면역형광 실험을 사용하여 항체 희석뿐만 아니라 사전에 결정해야 합니다.

주의: 메탄올은 적절하게 폐기해야 합니다.

1. 웰에서 배양 배지를 제거하고 각각 25μM 또는 0.05%에서 에토포시드 또는 DMSO를 함유하는 배양 배지를 추가합니다. 37 ° C에서 5 % CO₂ 및 etoposide 또는 DMSO를 사용하여 90 % 공기를 포함하는 가습 분위기에서 3 가지 기간 (20 분, 1 시간 및 3 시간) 동안 세포를 배양합니다. 384 플레이트를 사용할 때는 모든 조건을 동시에 고정해야 합니다.
   1. 이를 위해 3시간과 같이 가장 긴 치료 시간으로 상태를 치료하는 것으로 시작하십시오. 2시간 후 1시간 치료 상태를 치료하고 고정 시간이 20분 남았을 때 20분 상태를 치료합니다. 그런 다음 모든 조건을 동시에 수정할 수 있습니다.
2. 웰에서 배지를 제거하고 PBS 3x로 세포를 세척합니다.
3. 우물 표면을 덮을 수 있는 충분한 부피의 얼음처럼 차가운 메탄올을 추가하여 세포를 고정합니다. -20 °C에서 10분 동안 배양합니다. PBS 3x로 우물을 씻으십시오.
   참고: 이 시점에서 프로토콜을 일시 중지할 수 있습니다. 플레이트는 4°C에서 1주일 동안 보관할 수 있습니다.

4. 투과성 및 차단

알림: PFA 고정 방법을 사용하는 경우 투과화 전에 글리신으로 차단하는 단계를 수행해야 합니다. 습도 챔버는 인큐베이터 내부에 물통을 넣어 준비할 수 있으며, 그 결과 약 95%의 습도가 됩니다. 384 플레이트 또는 슬라이드는 여과지 또는 적신 스폰지 및 투명 필름 위의 밀폐된 플라스틱 용기에서 배양할 수 있습니다.

1. 샘플에서 PBS를 탭합니다.
2. 30-40 μL의 투과화 완충액(PBS의 0.2% Triton X-100)을 추가하고 실온에서 20분 동안 배양합니다. PBS로 3x 세척
3. 샘플에서 PBS를 탭하고 PLA 키트에 제공된 30-40μL의 1x 차단 용액을 추가합니다(또는 PBS 용액의 3% 및 Triton X-100 0.1% 사용 가능).
4. 37°C에서 1시간 동안 예열된 습도 챔버에서 플레이트를 배양합니다.

5. 1차 항체 배양(PLA)

참고: 커버슬립을 사용하는 경우, 항체 용액이 모든 커버슬립 표면을 덮고 있는지 확인하는 것이 중요합니다. 항체 선택에 특별한 주의를 기울여야 합니다. 항체는 다른 동물 종에서 추출한 것이어야 하며, γ-H2AX에 사용되는 2차 항체는 PLA 프로브 생산의 종 숙주에 대한 것이 아니어야 합니다. 예를 들어, PLA에 사용되는 1차 항체는 생쥐와 염소 동물에서 자랐습니다. PLA 프로브, 안티 마우스 및 안티 염소는 당나귀에서 생산되었습니다. γ-H2AX에 대한 항체는 토끼에서 생산되었으며, 2차 사용된 항체는 당나귀에서 생산된 항토끼입니다. 이러한 방식으로 보조 프로브는 PLA 프로브를 인식하지 못합니다.

1. 키트에 제공된 항체 희석제에 1차 항체(마우스 항-Ku70 1:100 및 염소 항-Nek4 1:50; 토끼 항-Nek5 1:25 및 마우스 항-TOPIIβ 1:25)를 희석합니다(또는 PBS 용액에서 소 혈청 알부민 3% 및 Triton X-100 0.1% 사용 가능). 커버슬립을 사용하는 경우 조건당 30μL의 항체 용액을 준비하거나 384웰 플레이트를 사용하는 경우 웰당 20μL를 준비합니다.
2. 차단 용액을 탭합니다. 각 웰에 1차 항체 용액을 추가합니다. 4 °C의 습도 챔버에서 밤새 배양합니다.

6. PLA 프로브 배양

참고: 1차 항체뿐만 아니라 면역형광 단계에 사용하기 위한 항체도 고려하여 프로브를 선택하십시오. 37°C의 긴 배양을 위해 384웰 플레이트를 사용할 때 항체 용액의 분포를 개선하기 위해 느린 회전을 사용할 수 있습니다.

1. 항체 희석액에 마이너스 프로브와 플러스 프로브를 1:5로 희석합니다. 384웰 플레이트를 사용하는 경우 웰당 10μL를 준비하고, 커버슬립을 사용하는 경우 샘플당 20μL를 준비합니다. 다음 조합을 활용하십시오 : 당나귀 안티 마우스 마이너스와 당나귀 안티 염소 플러스; 당나귀 안티 마우스 마이너스와 당나귀 안티 토끼 플러스.
2. 1차 항체 용액을 탭합니다. TBS-T(50mM Tris pH 7.5, 150mM NaCl, Tween-20의 0.05%)로 1회 세척합니다. 실온에서 TBS-T로 각각 5분씩 3회 세척합니다. TBS-T로 추가 세탁을 수행하십시오.
3. 플레이트용 10μL, 커버슬립용 20μL의 PLA 프로브 용액을 탭하고 추가합니다. 37°C의 예열된 습도 챔버에서 1시간 동안 배양합니다.

7. 결찰

참고: 샘플에 추가하기 직전까지 Ligase를 추가하도록 기다립니다. 인대는 냉동 블록(-20 °C)에 보관해야 합니다. 리가아제 용액을 추가하기 전에 모든 세척 용액을 완전히 제거하십시오. 세포를 용액 없이 장기간 방치하지 마십시오. 37°C 배양에 384웰 플레이트를 사용할 때 항체 용액의 분포를 개선하기 위해 느린 회전을 사용할 수 있습니다.

1. 5x ligation buffer를 고순도 물에 희석합니다. 384웰 플레이트를 사용하는 경우 웰당 10μL를 준비하거나 커버슬립을 사용하는 경우 20μL를 준비합니다.
2. PLA 프로브 용액을 탭합니다. TBS-T로 1회 세탁합니다. 그런 다음 TBS-T를 사용하여 5분 동안 3회 더 세척합니다. 마지막으로 세척하고 다음 단계 전에 TBS-T를 두드립니다.
3. 샘플에 적용하기 직전에 1:40에 1x Ligation 용액에 Ligase를 추가합니다. 37°C로 예열된 습도 챔버에서 30분에서 1시간 동안 배양합니다.

8. 증폭 및 세척

참고: 샘플에 첨가하기 직전까지 중합효소를 첨가하기 위해 기다립니다. 증폭 버퍼는 빛에 민감합니다. 완충액을 함유한 모든 용액을 빛으로부터 보호하십시오. 중합효소는 냉동 블록(-20 °C)에 보관해야 합니다. 세포를 용액 없이 장기간 방치하지 마십시오. 37°C 배양에 384웰 플레이트를 사용할 때 느린 회전으로 항체 용액의 분포를 개선할 수 있습니다.

1. 중합효소 용액을 추가하기 전에 모든 세척 용액을 완전히 제거하십시오. 세포를 용액 없이 장기간 방치하지 마십시오. 5x 증폭 버퍼를 고순도 물에 희석합니다. 384웰 플레이트를 사용하는 경우 웰당 10μL를 준비하거나 커버슬립을 사용하는 경우 20μL를 준비합니다.
2. 결찰액을 탭합니다. TBS-T로 1회 세탁합니다. 그런 다음 TBS-T를 사용하여 5분 동안 3회 더 세척합니다. 마지막으로 세척하고 다음 단계 전에 TBS-T를 두드립니다.
3. 1:80 희석으로 1x 증폭 용액에 중합효소를 첨가하고 샘플에 적용하기 직전에 첨가합니다. 37°C로 예열된 습도 챔버에서 100분 동안 배양합니다.
   알림: 이 단계부터는 직사광선 노출을 피하십시오
4. 증폭 버퍼를 탭합니다. 1x SSC 버퍼로 각각 10분 동안 2번 세척합니다. 0.01x SSC 버퍼로 각각 2분 동안 2번 세척합니다.

9. γ-H2AX 염색(면역형광 - IF)

알림: γ-H2AX의 라벨링은 PLA가 완료된 후 수행됩니다.

1. 1차 항체 배양(IF)
   1. 차단 용액에 1차 항체(Rabbit anti yH2AX at 1:100)를 희석합니다(또는 PBS 용액에서 소 혈청 알부민 3% 및 Triton X-100 0.1% 사용 가능). 커버슬립을 사용하는 경우 웰당 30μL의 항체 용액을 준비하거나 384웰 플레이트를 사용하는 경우 20μL를 준비합니다.
   2. 0.01x SSC 솔루션을 탭합니다. PBS로 2번 씻으십시오.
   3. 각 웰에 1차 항체 용액을 추가합니다. 실온에서 1시간 동안 배양합니다.
2. 2차 항체 배양(IF)
   참고: 선택한 2차 항체가 PLA 항체 또는 프로브를 인식하지 않는지 확인하십시오. 또한 2차 항체의 파장은 PLA 검출 시약의 파장과 달라야 합니다. 예를 들어, PLA 검출 시약에는 형광단 647이 포함되어 있고 γ-H2AX 검출에 사용한 2차 시약은 488입니다.
   1. 2차 항체(Donkey anti-Rabbit Alexa Fluor 488)를 차단 용액에 희석합니다(또는 PBS 용액의 3% 및 Triton X - 100 0.1% 사용 가능)에 1:300 희석합니다. 커버슬립을 사용하는 경우 조건당 30μL의 항체 용액을 준비하거나 384웰 플레이트를 사용하는 경우 웰당 20μL를 준비합니다. 최종 농도 0.6μg/mL에서 Hoechst 33342 염료를 추가합니다.
   2. 1차 항체 용액을 탭합니다. TBS-T로 3번 세탁합니다.
   3. 각 웰에 2차 항체 용액을 추가합니다. 실온에서 20분 동안 배양합니다.
   4. TBS-T로 5번 씻으십시오. 1x SSC 버퍼로 2x 세척합니다. 0.01x SSC 버퍼로 2x 세척합니다.
      참고: 이 시점에서 플레이트는 빛으로부터 보호되는 4°C(SSC 0.01X)에서 몇 주 동안 보관할 수 있습니다. 커버슬립을 사용하는 경우 슬라이드를 장착할 수 있으며 1일 후에는 슬라이드를 -20°C에서 보관할 수 있습니다.

10. 이미지 취득

1. 기존 형광 현미경과 63x 대물렌즈를 사용하십시오. 포화와 도트 붕괴를 피하기 위해 네거티브 컨트롤과 포지티브 컨트롤을 비교하여 노출 시간을 결정합니다.
   알림: 컨포칼 현미경을 사용하면 PLA 점 감지가 향상됩니다. 20x 대물렌즈는 검출되는 핵의 수를 늘리는 데에도 사용할 수 있습니다.
2. 노출 시간이 조정되면 동일한 매개변수로 PLA 도트의 모든 획득을 수행합니다. 비균질한 배양으로 인한 아티팩트를 방지하기 위해 다른 웰 또는 커버슬립 영역에서 이미지를 획득해 보십시오.
3. 모든 채널을 동일한 이름 패턴으로 저장합니다. 현미경이 채널에서 개별적으로 사진을 찍는 경우 해당 이미지를 동일한 이름으로 저장하고 파일 이름 시작 부분에 PLA 또는 Nucleus만 추가하여 채널을 구분합니다.

11. 이미지 분석

참고: 이미지 J/FIJI¹⁷ 에서 핵당 점을 분석하고 스케일 정보를 수동으로 추가해야 하는 현미경과 함께 사용하기 위해 매크로가 생성되었습니다. 사용되는 대물 렌즈의 픽셀 크기를 알고 있어야 합니다. 각 채널의 이미지를 다른 폴더에 배치합니다(보충 코딩 File 1, 보충 그림 1).
참고: 매크로는 별도로 얻은 형광 채널을 고려합니다. 이 경우 모든 이미지를 동일한 이름으로 저장하는 것이 중요합니다.

1. 매크로를 사용하면 필드의 특정 영역을 선택할 수 있습니다. 이미지의 영역이 분석에 해로울 수 있는 아티팩트를 표시하는 경우 ROI 선택 옵션을 사용합니다. 분석을 시작할 때 ROI를 선택하고 모든 이미지에 사용합니다.
   참고: 이 기능은 선택적 기능입니다. 선택하지 않으면 전체 이미지가 분석에서 고려됩니다(보충 그림 2).
2. ROI 파일은 아래 설명된 대로 매크로를 사용하기 전에 만들어야 합니다. ROI 선택의 경우 사각형 도구를 사용하여 분석할 영역을 선택하고 Edit > Selection(선택 영역) > Add to Manager(관리자에 추가)를 클릭하여 ROI Manager에 추가합니다. More> Save를 클릭하여 ROI를 저장합니다.
3. ImageJ ¹⁷에서 다양한 조건의 이미지를 열어 분석을 위한 매개변수를 조정합니다. 이러한 매개변수는 사용자에 의해 결정되어야 하며 매크로 프로그램(보충 코딩 파일 1)에서 데이터와 함께 지정되어야 합니다
   1. 배경 보정: 배경을 제거하려면 프로세스> 배경 빼기를 클릭합니다. preview 함수를 사용하여 다양한 롤링 볼 반경을 테스트합니다. PLA 도트에는 롤링 10을, 핵에는 롤링 100을 사용했습니다.
   2. Process > Noise > Despeckle을 클릭하여 노이즈를 제거합니다. 핵의 경우 smooth 기능을 사용하여 Process>Smooth를 클릭하여 핵 충전을 개선합니다.
   3. 임계값 조정: 8비트 이미지로 변환하고 이미지 > 유형 > 8비트 및 이미지 > 조정(임계값 조정)을 클릭하여 임계값> 조정합니다. 그에 따라 임계값을 조정하여 이미지에 있는 모든 핵 또는 점을 시각화하되 과도한 채도와 구조 붕괴를 피하십시오. 값을 기록하고 다른 이미지에서 테스트하여 임계값이 다른 이미지에 대해 작동하는지 확인합니다.
   4. Process > Binary > Convert to mask를 클릭하여 마스크로 변환합니다. 핵의 경우 Process > Binary > Fill holes를 클릭한 다음 Process > Binary > Watershed를 클릭합니다. PLA 점의 경우 Process > Binary > Watershed를 클릭합니다.
   5. 핵을 세려면 다른 핵의 면적 또는 길이를 측정하여 평균 크기를 추정합니다. 근사값을 사용하여 입자를 분석합니다. Analyze(분석) > Analyze particles(입자 분석)를 클릭한 다음 Set size: 15-infinity(이 값은 핵의 크기에 따라 다름)를 선택합니다. 다음 옵션을 확인하십시오 : 표시 : 마스크; 결과 표시; 명확한 결과; 요약하다; 관리자에 추가; 가장자리에서 제외합니다.
   6. PLA 점을 계산하려면 점의 면적 또는 반경을 측정하여 평균 크기를 추정합니다.  Apply Nucleus Mask (apply mask는 GDSC 플러그인의 기능입니다. 설치되어 있는지 확인)를 선택한 다음 Analyze > Analyze particles를 선택하고 설정합니다. 0.02-3(이 값은 핵의 크기에 따라 다름). 다음 옵션을 확인하십시오 : 표시 : 마스크; 결과 표시; 명확한 결과; 요약하다; 관리자에 추가; 가장자리에서 제외합니다.
4. 결과는 이미지에 존재하는 각 핵의 핵당 점 수를 보여줍니다. 이 데이터를 저장합니다.

12. 병합된 이미지 시각화

1. PLA, 핵 및 γ-H2AX에 해당하는 채널을 엽니다. 모든 이미지에 대해 11.4.1 및 11.4.2 단계에서 설명한 대로 배경을 빼고 노이즈를 제거합니다.
2. 밝기와 대비를 자동 또는 수동으로 조정하여 동일한 채널의 모든 조건에 대해 동일한 값을 사용할 수 있습니다.  이미지를 선택하고 >> 밝음/대비 조정합니다.
3. 이미지 > 색상 > 채널 병합을 선택하여 이미지를 결합(병합)합니다. 축척 막대 분석 > 도구 > 축척 막대를 선택하여 축척 막대를 추가합니다. 다른 이름으로 저장을 클릭합니다. TIFF 파일.

결과

우리는 etoposide 처리가없는 상태에서 Nek4-Ku70 상호 작용을 관찰했습니다. 그러나 이러한 상호 작용은 핵 외부에서 발생할 수 있습니다(그림 1A). Nek4-Ku70 상호 작용은 DNA 손상 후 증가하며 핵에 집중됩니다(그림 1A). 문헌 결과¹⁸에 근거한 양성 대조군으로 이 분석에서 사용된 Nek5-Topoisomerase II β(TOPIIβ) 상호 작용의...

토론

이 데이터는 DNA 손상 마커와 함께 PLA를 사용하면 DNA 손상 반응 프로파일링에서 가장 많은 정보를 제공할 수 있으며, 모욕 후 상호 작용의 공간적 및 시간적 거동을 보여줄 수 있음을 보여줍니다. PLA는 이합체화 식별, 소기관 접촉 측정, 단백질-핵산 상호 작용 및 주로 단백질-단백질 상호 작용 10,11,19,20<...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
Black 384-well plates	Perkin Elmer Cell carrier plates
Donkey  anti- Rabbit Alexa Fluor 488	Invitrogen	A21206	1:300
Duo link Donkey anti Mouse Minus	Sigma	DUO92004
Duolink antibody diluent	Sigma	DUO82008
Duolink blocking solution 1X	Sigma	DUO82007
Duolink Detection reagent Far red	Sigma	DUO92013
Duolink Donkey anti goat plus	Sigma	DUO92003
Duolink Donkey anti rabbit plus	Sigma	DUO92002
Etoposide	Sigma	E1383
Goat anti Nek4	Santa Cruz Biotechnology	SC-5517	goat anti Nek4 was used at 1:50 dilution
Hoechst 33342	Thermo	H1399	0.6 µg/mL
Leica DMI microscope	Leica
Mouse anti Ku70	Thermo	MA5-13110	mouse anti Ku70 was used at 1:100 dilution
Mouse anti TOPIIβ	Santa Cruz Biotechnology	SC-365071	1:25
Rabbit anti Nek5	Santa Cruz Biotechnology	SC-84527	1:25
Rabbit anti Y H2AX	Cell Signalling	9718S	1:100 dilution
U2OS cell line	ATCC	HTB-96