A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.
בדיקת ליגנד קרבה למיקום חלבונים באתרי נזק לדנ"א
In This Article
Summary
כאן, אנו מציגים פרוטוקול פשוט ומהיר לזיהוי אינטראקציה של חלבונים באתרי נזק לדנ"א.
Abstract
תגובת הנזק לדנ"א היא אמצעי הגנה על מידע גנטי המגן על התאים מפני הנצחת דנ"א פגום. אפיון החלבונים המשתפים פעולה בתהליך זה מאפשר זיהוי מטרות חלופיות להתערבות טיפולית במספר מחלות, כגון סרטן, מחלות הקשורות להזדקנות ודלקות כרוניות. בדיקת ליגנד הקרבה (PLA) התפתחה ככלי להערכת אינטראקציה בין חלבונים, כמו גם קרבה מרחבית בין אברונים או מבנים תאיים, ומאפשרת לוקליזציה זמנית וניתוח קו-לוקליזציה בתנאי עקה, למשל. השיטה פשוטה מכיוון שהיא דומה לאימונופלואורסנציה קונבנציונלית ומאפשרת צביעה של אברון, מבנה תאי או סמן ספציפי כגון מיטוכונדריה, רשתית אנדופלסמית, גופי PML, או סמן DNA דו-גדילי, yH2AX בו זמנית. הזרחן של S139 בגרסת Histone 2A, H2AX, המכונה אז yH2AX, נמצא בשימוש נרחב כסמן רגיש וספציפי מאוד של שברים דו-גדיליים ב-DNA. כל מוקד של צביעת yH2AX מתאים לשבר אחד בדנ"א המתרחש מספר דקות לאחר הנזק. ניתוח השינויים במוקדי yH2AX הוא הבדיקה הנפוצה ביותר למחקר אם החלבון המעניין מעורב בתגובת נזק לדנ"א (DDR). בין אם צפוי תפקיד ישיר באתר הנזק לדנ"א, נעשה שימוש במיקרוסקופ פלואורסצנטי כדי לאמת את הקולוקליזציה של החלבון המעניין עם מוקדי yH2AX. עם זאת, למעט שיטות פלואורסצנטיות חדשות ברזולוציית על, לסיכום, האינטראקציה המקומית עם אתרי נזק לדנ"א יכולה להיות מעט סובייקטיבית. כאן, אנו מראים בדיקה להערכת לוקליזציה של חלבונים במסלול DDR באמצעות yH2AX כסמן של אתר הנזק. בדיקה זו יכולה לשמש כדי לאפיין את לוקליזציה זמנית תחת עלבונות שונים הגורמים נזק DNA.
Introduction
נזק לדנ"א התאי מתרחש מדי יום בגלל התגובות הכימיות הספונטניות והוא מוגבר גם על ידי גורמים אקסוגניים כגון חומרים גנוטוקסיים (קרינה וכימיקלים כגון אטופוסיד) ועקה חמצונית 1,2,3. לתאים יש מנגנון מורכב שמתקן מספר עצום של סוגים שונים של נזק לדנ"א, החל מהסרת בסיסים דרך פיתול מזלג משוכפל או הפרעה ועד לנגע המזיק ביותר: שבירת הגדילים הדו-גדיליים של הדנ"א 4,5.
מספר חלבונים המשתתפים ב- DDR כבר אופיינו, ותיקונים מצוינים חוקרים את המסלולים של חיבור קצה לא הומולוגי (NHEJ) ....
Protocol
1. ציפוי תאים
הערה: ניתן לזרוע תאים בשקופיות, תאים או לוחות פלואורסצנטיים מיקרוסקופיים. השימוש בכיסויים קטנים או צלחות באר 96/384 מומלץ לבדיקת מצבים מרובים וריאגנטים רזרביים. השימוש בכיסויים מומלץ עבור קווי תאים שמתנתקים בקלות, כמו תאי HEK293. ניתן לצפות בעבר את הכיסויים בתמיסת פולי-L-ליזין לשיפור החיבור המצורף.
- תאי לוחית שוקלים רכב, בקרות טכניות ובקרות ביולוגיות. השתמש בהעתקים טכניים בשתיים או שלוש בארות לכל מצב.
הערה: השימוש בבקרה טכנית (הן משנית והן אחת ראשית בלבד) הוא חובה. במידת האפשר, יש לכלול גם הדברה ביולוגית (למשל, ביטוי יתר או הפלת אחד מחלבוני המטרה או מצב שידוע כמשנה....
תוצאות
ראינו אינטראקציה Nek4-Ku70 בהיעדר טיפול etoposide. אולם האינטראקציה הזו יכולה להתרחש מחוץ לגרעין (איור 1A). האינטראקציה של Nek4-Ku70 גדלה לאחר נזק לדנ"א והיא מרוכזת בגרעין (איור 1A). במקרה של אינטראקציה Nek5-Topoisomerase II β (TOPIIβ), המשמשת בבדיקה זו כבקרה חיובית המ.......
Discussion
הנתונים מראים כי השימוש ב- PLA במקביל לסמן פגום ב- DNA יכול לספק את המידע הרב ביותר בפרופיל תגובת נזק ל- DNA, המראה את ההתנהגות המרחבית והזמנית של האינטראקציה לאחר העלבון. PLA היא שיטה רב-תכליתית המשמשת לזיהוי דימריזציה, קביעת מגע אברונים, אינטראקציה חלבון-חומצת גרעין, ובעיקר אי?.......
Disclosures
המחברים מצהירים כי אין להם אינטרסים כלכליים מתחרים.
Acknowledgements
אנו מודים ל- Fundação de Amparo a Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP, באמצעות Grant Temático 2022/15126-9 ל- JK ו- fellowship 21/09439-1 ל- LARM) ול- Conselho Nacional de Desenvolvimento Cientifico e Tecnológico (CNPq) על מימון מחקר זה.
....Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Black 384-well plates | Perkin Elmer Cell carrier plates | ||
| Donkey anti- Rabbit Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A21206 | 1:300 |
| Duo link Donkey anti Mouse Minus | Sigma | DUO92004 | |
| Duolink antibody diluent | Sigma | DUO82008 | |
| Duolink blocking solution 1X | Sigma | DUO82007 | |
| Duolink Detection reagent Far red | Sigma | DUO92013 | |
| Duolink Donkey anti goat plus | Sigma | DUO92003 | |
| Duolink Donkey anti rabbit plus | Sigma | DUO92002 | |
| Etoposide | Sigma | E1383 | |
| Goat anti Nek4 | Santa Cruz Biotechnology | SC-5517 | goat anti Nek4 was used at 1:50 dilution |
| Hoechst 33342 | Thermo | H1399 | 0.6 µg/mL |
| Leica DMI microscope | Leica | ||
| Mouse anti Ku70 | Thermo | MA5-13110 | mouse anti Ku70 was used at 1:100 dilution |
| Mouse anti TOPIIβ | Santa Cruz Biotechnology | SC-365071 | 1:25 |
| Rabbit anti Nek5 | Santa Cruz Biotechnology | SC-84527 | 1:25 |
| Rabbit anti Y H2AX | Cell Signalling | 9718S | 1:100 dilution |
| U2OS cell line | ATCC | HTB-96 |
References
- Xiao, W., Samson, L. In vivo evidence for endogenous DNA alkylation damage as a source of spontaneous mutation in eukaryotic cells. Proc Nat Acad Sci U S A. 90 (6), 2117-2121 (1993).
- Lindahl, T., Barnes, D. E. R....
Reprints and Permissions
Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article
Request PermissionThis article has been published
Video Coming Soon
Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved