בדיקת ליגנד קרבה למיקום חלבונים באתרי נזק לדנ"א

Summary

כאן, אנו מציגים פרוטוקול פשוט ומהיר לזיהוי אינטראקציה של חלבונים באתרי נזק לדנ"א.

Abstract

תגובת הנזק לדנ"א היא אמצעי הגנה על מידע גנטי המגן על התאים מפני הנצחת דנ"א פגום. אפיון החלבונים המשתפים פעולה בתהליך זה מאפשר זיהוי מטרות חלופיות להתערבות טיפולית במספר מחלות, כגון סרטן, מחלות הקשורות להזדקנות ודלקות כרוניות. בדיקת ליגנד הקרבה (PLA) התפתחה ככלי להערכת אינטראקציה בין חלבונים, כמו גם קרבה מרחבית בין אברונים או מבנים תאיים, ומאפשרת לוקליזציה זמנית וניתוח קו-לוקליזציה בתנאי עקה, למשל. השיטה פשוטה מכיוון שהיא דומה לאימונופלואורסנציה קונבנציונלית ומאפשרת צביעה של אברון, מבנה תאי או סמן ספציפי כגון מיטוכונדריה, רשתית אנדופלסמית, גופי PML, או סמן DNA דו-גדילי, yH2AX בו זמנית. הזרחן של S139 בגרסת Histone 2A, H2AX, המכונה אז yH2AX, נמצא בשימוש נרחב כסמן רגיש וספציפי מאוד של שברים דו-גדיליים ב-DNA. כל מוקד של צביעת yH2AX מתאים לשבר אחד בדנ"א המתרחש מספר דקות לאחר הנזק. ניתוח השינויים במוקדי yH2AX הוא הבדיקה הנפוצה ביותר למחקר אם החלבון המעניין מעורב בתגובת נזק לדנ"א (DDR). בין אם צפוי תפקיד ישיר באתר הנזק לדנ"א, נעשה שימוש במיקרוסקופ פלואורסצנטי כדי לאמת את הקולוקליזציה של החלבון המעניין עם מוקדי yH2AX. עם זאת, למעט שיטות פלואורסצנטיות חדשות ברזולוציית על, לסיכום, האינטראקציה המקומית עם אתרי נזק לדנ"א יכולה להיות מעט סובייקטיבית. כאן, אנו מראים בדיקה להערכת לוקליזציה של חלבונים במסלול DDR באמצעות yH2AX כסמן של אתר הנזק. בדיקה זו יכולה לשמש כדי לאפיין את לוקליזציה זמנית תחת עלבונות שונים הגורמים נזק DNA.

Introduction

נזק לדנ"א התאי מתרחש מדי יום בגלל התגובות הכימיות הספונטניות והוא מוגבר גם על ידי גורמים אקסוגניים כגון חומרים גנוטוקסיים (קרינה וכימיקלים כגון אטופוסיד) ועקה חמצונית ^1,2,3. לתאים יש מנגנון מורכב שמתקן מספר עצום של סוגים שונים של נזק לדנ"א, החל מהסרת בסיסים דרך פיתול מזלג משוכפל או הפרעה ועד לנגע המזיק ביותר: שבירת הגדילים הדו-גדיליים של הדנ"א ^4,5.

מספר חלבונים המשתתפים ב- DDR כבר אופיינו, ותיקונים מצוינים חוקרים את המסלולים של חיבור קצה לא הומולוגי (NHEJ) ורקומבינציה הומולוגית (HR), המסלולים העיקריים המשתמעים בתיקון הפסקות דו-גדיליות (DSB) ^5,6. הזרחן של וריאנט H2A היסטון, H2AX, בסרין 139 (לאחר מכן y-H2AX) שימש במשך שנים רבות כסמן רגיש ואמין של שבר הגדילים הכפולים. הזרחן של H2AX נצפה בדקות הראשונות לאחר הנזק ויכול להימשך שעות⁷.

היתרון בשימוש בזיהוי אימונופלואורסנציה של מוקדי γ-H2AX הוא אפיון ההתפלגות הטמפורלית והמרחבית של המוקדים, כמו גם צביעתו המשותפת עם חלבונים אחרים. יתר על כן, immunofluorescence אינו דורש ליזיס, אשר משמר מידע בהקשר התאי ועושה את זה אינפורמטיבי יותר. חוץ מזה, כמו γ-H2AX נוצר דה נובו, זה לא נוכח בשפע בהיעדר נזק DNA, מה שהופך אותו סמן ספציפי⁷.

H2AX הוא בעיקר פוספורילציה על ידי חלבון קינאז אטקסיה-telangiectasia מוטציה (ATM) וחלבון קינאז תלוי DNA (DNA-PK), חיישנים של DSBs. Ku70/80 (XRCC6 X-ray repair cross-complementing 6/ XRCC5 X-ray repair cross-complementing 5) ותת-יחידה קטליטית של DNA-protein kinase (DNA-PKcs) אחראים על זיהוי DSB והגנה על קצוות DNA, בעוד Artemis מבצעת עיבוד קצה כדי להקל על קשירה על ידי קומפלקס XRCC4-Ligase IV. הזרחן של H2AX באתרים הסמוכים ל-DSB משמש כאיתות לגיוס מספר חלבוני תיקון ולאיתות למעצר מחזור התא, מוות או הישרדות⁸.

ניתוח השינויים במוקדי y-H2AX הוא הבדיקה הנפוצה ביותר למחקר אם החלבון המעניין מעורב בתגובת נזק לדנ"א. בין אם צפוי תפקיד ישיר באתר הנזק לדנ"א, נעשה שימוש במיקרוסקופ פלואורסצנטי כדי לאמת את הלוקליזציה המשותפת של החלבון המעניין עם מוקדי y-H2AX. עם זאת, למעט שיטות פלואורסצנטיות חדשות ברזולוציית על, סיכום האינטראקציה המקומית עם אתרי נזק לדנ"א יכול להיות מסובך. יתר על כן, זיהוי אימונופלואורסנציה תלוי בדרך כלל במולקולות חלבון רבות באתר הנזק לדנ"א, מה שמקשה על זיהוי חלבונים נדירים⁹.

כאן, אנו מראים בדיקה כדי להעריך את הלוקליזציה של חלבונים המעורבים במסלול DDR באמצעות y-H2AX כסמן של אתר הנזק. בדיקה זו יכולה לשמש לאפיון לוקליזציה זמנית תחת עלבונות שונים הגורמים נזק ל- DNA.

בדיקת ליגנד הקרבה (PLA) התפתחה ככלי להערכת אינטראקציה בין חלבונים, כמו גם קרבה מרחבית בין אברונים או מבנים תאיים^10,11 ומאפשרת ניתוח לוקליזציה בזמן וניתוח קו-לוקליזציה בתנאי עקה, למשל. השיטה פשוטה מכיוון שהיא דומה לאימונופלואורסנציה קונבנציונלית ומאפשרת צביעה בו זמנית של סמנים ספציפיים לאברונים או למבנה התא, כגון מיטוכונדריה, רשתית אנדופלסמית, גופי PML, או סמן דו-גדילי DNA, yH2AX. השימוש ב- PLA מאפשר זיהוי של אינטראקציה חלבונית במהלך נזק לדנ"א באופן רגיש, ספציפי ואמין שניתן להשתמש בו כדי לנטר את האינטראקציה במהלך מחזור התא, בתגובה לגירויים שונים, ובזמנים שונים לאחר לחץ גנוטוקסי.

אנו מראים כאן את השימוש ב- PLA במקביל לאימונופלואורסנציה קונבנציונלית γ-H2AX כדי למקם אינטראקציה Nek4-Ku70 לאחר נזק ל- DNA המושרה על ידי אטופוסיד. ל-Nek4, בן משפחה מסוג Nek (קינאזות הקשורות ל-NIMA), אין תפקיד ברור בתגובת נזק לדנ"א. בשנת 2012, נגוין ועמיתיו הראו כי Nek4 מקיים אינטראקציה עם חלבוני Ku70/Ku80, ובהיעדרו של Nek4, חלבונים אלה אינם מגויסים לאתר הנזק לדנ"א, וזרחן H2AX נפגע¹². הלוקליזציה התאית של אינטראקציה זו אינה ידועה עד כה. ראינו ירידה בזרחון Ku70 בתאים המבטאים מוטציה¹³של Nek4 קינאז, אך עדיין לא ברור אם Nek4 פוספורילטים ישירות Ku70. בהתחשב בכך שהאינטראקציה של Nek4 עם Ku70 מוגברת לאחר טיפול באטופוסיד על פי מחקרי משקעים חיסוניים¹², אנו מנסים למקם אינטראקציה זו באמצעות PLA וסמן γ-H2AX.

בדרך כלל, מחקרי האינטראקציה מבוססים על מבחני משקעים חיסוניים, אך אלה הם במבחנה ואינם מספקים מידע על מיקום האינטראקציה. במידת האפשר, ניתן לבצע משקעים חיסוניים של תאים מפוצלים (גרעין, מיטוכונדריה, קרום התא או ציטוזול), אך ביצוע מהלך זמן של האינטראקציה הוא יקר ומייגע. Immunofluorescence יכול לתת מידע על לוקליזציה התא של החלבונים, אבל הוכחת האינטראקציה יכולה להיות קשה תלוי ברזולוציה של המיקרוסקופים. כאן, אנו מראים את היתרון של שימוש בבדיקת ליגנד קרבה כדי לעקוב אחר האינטראקציה של שני חלבונים בהקשר של נזק לדנ"א.

Protocol

1. ציפוי תאים

הערה: ניתן לזרוע תאים בשקופיות, תאים או לוחות פלואורסצנטיים מיקרוסקופיים. השימוש בכיסויים קטנים או צלחות באר 96/384 מומלץ לבדיקת מצבים מרובים וריאגנטים רזרביים. השימוש בכיסויים מומלץ עבור קווי תאים שמתנתקים בקלות, כמו תאי HEK293. ניתן לצפות בעבר את הכיסויים בתמיסת פולי-L-ליזין לשיפור החיבור המצורף.

1. תאי לוחית שוקלים רכב, בקרות טכניות ובקרות ביולוגיות. השתמש בהעתקים טכניים בשתיים או שלוש בארות לכל מצב.
   הערה: השימוש בבקרה טכנית (הן משנית והן אחת ראשית בלבד) הוא חובה. במידת האפשר, יש לכלול גם הדברה ביולוגית (למשל, ביטוי יתר או הפלת אחד מחלבוני המטרה או מצב שידוע כמשנה את האינטראקציה, למשל).
   1. תרבית תאי U2OS במדיום הנשר המעובד (DMEM) של דולבקו בתוספת 10% של סרום בקר עוברי (FBS), 4.5 גרם / ליטר גלוקוז, ו -4 מילימטר של L-גלוטמין על צלחות שטופלו בתרבית רקמות ב 37 ° C ב 5% CO₂ ואווירה לחה המכילה 90% אוויר. בהתאם למספר התנאים שיש לבדוק ואם משתמשים בצלחת 384 או מכסים בצלחת 60 מ"מ, התחל מלוח של 60 או 100 מ"מ, בהתאמה.
   2. כאשר התאים מגיעים למפגש של 60%-70%, יש לפצל תאים באמצעות 0.25% טריפסין-EDTA ¹⁴. ספירת תאים באמצעות תא נויבאואר או מונה אוטומטי¹⁴. צלחת 4 x 10⁵ תאים בצלחת 60 מ"מ המכילה מספר כיסויים עגולים בקוטר 13 מ"מ או 4 x 10⁵ תאים לבאר בצלחות 384 באר ודוגרים במשך 12 - 24 שעות ב 37 ° C באינקובטור לח, 5% CO₂ .

2. הכנת פתרונות

הערה: ריכוז הטיפול וזמני הטיפול נבחרו בהתבסס על תוצאות ספרותיות, המצביעות על הפעלת מסלולי תיקון נזקי DNA^15,16.

1. הכן את תמיסת המניות של Etoposide בריכוז 50 mM ב- DMSO. פתרון המלאי יכול להישמר ב -20 ° C במשך מספר חודשים. לדלל את הפתרון etoposide לשימוש בתווך התרבית המלאה בריכוז סופי של 25 מיקרומטר. השתמש ב-DMSO ב-0.05% מדולל במדיום התרבית המלאה כבקרת רכב.
2. הכינו 20x נתרן ציטראט מי מלח (SSC; 3.0 M NaCl, 0.30 M trisodium citrate pH 7.0). פתרון זה יכול להישמר במשך מספר חודשים ב 4 ° C.

3. טיפול וקיבוע תאים

הערה: אין לאפשר לתאים להתייבש בכל רגע; נסה להקיש על הפתרונות הקודמים ככל האפשר. השיטה המתאימה לקיבוע תאים (מתנול קר כקרח או 4% פרפורמלדהיד (PFA)) חייבת להיקבע מראש, כמו גם דילול נוגדנים, באמצעות ניסוי אימונופלואורסצנטי קונבנציונלי.

אזהרה: יש לסלק מתנול כראוי.

1. הסר את מדיום התרבית מהבארות והוסף מדיום תרבית המכיל אטופוסיד או DMSO ב- 25 מיקרומטר או 0.05%, בהתאמה. לדגור על תאים בטמפרטורה של 37°C ב-5%_CO2 ועל אטמוספירה לחה המכילה 90% אוויר עם אטופוסיד או DMSO למשך 3 פרקי זמן שונים: 20 דקות, שעה ו-3 שעות. בעת שימוש 384 לוחות, כל התנאים חייבים להיות קבועים בו זמנית.
   1. לשם כך, התחל בטיפול במצב עם הזמן הארוך ביותר של הטיפול, כגון 3 שעות. לאחר שעתיים, טפל במצב הטיפול של שעה אחת, וכאשר נותרו 20 דקות לקיבוע, טפל במצב של 20 דקות. בעקבות זאת, כל התנאים יכולים להיות קבועים בו זמנית.
2. הסר את המדיום מן הבארות ולשטוף את התאים עם PBS 3x.
3. תקן את התאים על ידי הוספת מתנול קר כקרח עם נפח מספיק כדי לכסות את פני הבאר. יש לדגור במשך 10 דקות בטמפרטורה של -20°C. שטפו את הבארות עם PBS 3x.
   הערה: בשלב זה, ניתן להשהות את הפרוטוקול. הצלחות ניתן לאחסן ב 4 ° C במשך שבוע 1.

4. חדירה וחסימה

הערה: אם משתמשים בשיטת קיבוע PFA, יש לבצע שלב של חסימה עם גליצין לפני החדירה. ניתן להכין את תא הלחות על ידי הכנסת מחבת מים לתוך האינקובטור, וכתוצאה מכך לחות של כ -95%. ניתן לדגור על הצלחת או המגלשות 384 במיכל פלסטיק סגור מעל נייר סינון או ספוג לח וסרט שקוף.

1. הקש על PBS מהדגימות.
2. מוסיפים 30-40 μL של חיץ חדירה (0.2% Triton X-100 ב-PBS) ודגרים במשך 20 דקות בטמפרטורת החדר. לשטוף 3x עם PBS
3. יש לנתק את ה-PBS מהדגימות ולהוסיף 30-40 μL של תמיסת חסימה 1x המסופקת בערכת PLA (לחלופין, ניתן להשתמש ב-3% אלבומין בסרום בקר וטריטון X-100 0.1% בתמיסת PBS) לכל באר/כיסוי.
4. לדגור את הצלחת בתא לחות שחומם מראש ב 37 ° C במשך 1 שעה.

5. דגירה ראשונית של נוגדנים (PLA)

הערה: אם משתמשים בכיסויים, חשוב לוודא שתמיסת הנוגדנים מכסה את כל משטחי הכיסוי. יש להקדיש תשומת לב מיוחדת לבחירת נוגדנים. הנוגדנים חייבים להיות ממינים שונים של בעלי חיים, והנוגדן המשני המשמש לייצור γ-H2AX לא חייב להיות נגד המין המארח של ייצור גשושיות PLA. לדוגמה, הנוגדנים העיקריים ששימשו ל-PLA גודלו בעכברים ובחיות עיזים. גשושיות ה-PLA, האנטי-עכבר והאנטי-עז יוצרו בחמור. הנוגדן נגד γ-H2AX יוצר בארנבות, והנוגדן המשני המשמש הוא אנטי-ארנב המיוצר בחמורים. בדרך זו, המשני לא יזהה את בדיקות PLA.

1. יש לדלל את הנוגדנים הראשוניים (העכבר נגד Ku70 1:100 ואנטי Nek4 1:50; ארנב נגד Nek5 1:25 ועכבר נגד TOPIIβ 1:25) בדילול נוגדנים המסופק בערכה (לחילופין, ניתן להשתמש ב-3% אלבומין בסרום בקר וטריטון X-100 0.1% בתמיסת PBS). הכינו 30 מיקרוליטר של תמיסת נוגדנים לכל מצב אם אתם משתמשים בכיסויים או 20 מיקרוליטר לבאר אם אתם משתמשים בצלחת 384 באר.
2. הקש על פתרון החסימה. הוסף את תמיסת הנוגדנים העיקרית לכל באר. יש לדגור ב-4°C (75 °F) למשך הלילה בתא לחות.

6. דגירה של בדיקת PLA

הערה: בחר את הבדיקות, תוך התחשבות לא רק בנוגדנים הראשוניים אלא גם באלה המיועדים לשימוש בשלבי האימונופלואורסנציה. בעת שימוש בצלחות 384 היטב עבור דגירה ארוכה של 37 מעלות צלזיוס, ניתן להשתמש בסיבוב איטי כדי לשפר את התפלגות תמיסת הנוגדנים.

1. לדלל את מינוס פלוס בדיקות 1: 5 בדילול נוגדנים. הכינו 10 μL לבאר אם אתם משתמשים בצלחות של 384 בארות או 20 μL לדגימה אם אתם משתמשים בכיסויים. השתמש בשילובים הבאים: חמור נגד עכבר מינוס עם חמור נגד עז פלוס; חמור נגד עכבר מינוס עם חמור נגד ארנב פלוס.
2. לחץ על תמיסת הנוגדנים העיקרית. יש לשטוף פעם אחת עם TBS-T (50 mM Tris pH 7.5, 150 mM NaCl, 0.05% של Tween-20). יש לכבס 3 פעמים במשך 5 דקות כל אחת עם TBS-T בטמפרטורת החדר. בצעו שטיפה נוספת עם TBS-T.
3. הקש והוסף את תמיסת הבדיקה PLA עם 10 μL עבור הלוחות ו- 20 μL עבור הכיסויים. יש לדגור בתא לחות שחומם מראש בטמפרטורה של 37°C למשך שעה אחת.

7. קשירה

הערה: המתן להוסיף Ligase עד מיד לפני הוספתו לדגימות. ליגאז חייב להישמר בבלוק מקפיא (-20 מעלות צלזיוס). הסר לחלוטין את כל תמיסת הכביסה לפני הוספת תמיסת הליגאז. הימנעו מהשארת התאים ללא תמיסה לפרקי זמן ארוכים. בעת שימוש בצלחות 384 באר עבור הדגירה של 37 מעלות צלזיוס, ניתן להשתמש בסיבוב איטי כדי לשפר את התפלגות תמיסת הנוגדנים.

1. יש לדלל את חיץ הקשירה 5x במים בעלי טוהר גבוה. הכינו 10 μL לכל באר אם אתם משתמשים בצלחות 384 באר או 20 μL אם אתם משתמשים בכיסויים.
2. הקש על פתרון הבדיקה PLA. יש לכבס פעם אחת עם TBS-T. לאחר מכן יש לבצע שלוש שטיפות נוספות, שכל אחת מהן נמשכת 5 דקות, באמצעות TBS-T. שטפו פעם אחרונה והקישו על TBS-T לפני השלב הבא.
3. הוסף Ligase לתמיסת קשירה 1x בשעה 1:40, מיד לפני החלתו על הדגימות. יש לדגור בתא לחות שחומם מראש בטמפרטורה של 37°C למשך 30 דקות עד שעה אחת.

8. הגברה ושטיפה

הערה: המתן להוספת הפולימראז עד מיד לפני הוספת הדגימה. חיץ ההגברה רגיש לאור; הגן על כל הפתרונות המכילים את המאגר מפני אור. פולימראז חייב להישמר בבלוק מקפיא (-20 ° C). הימנע לעזוב את התאים ללא פתרון במשך תקופה ארוכה של זמן. בעת שימוש בצלחות 384 באר עבור דגירה של 37 מעלות צלזיוס, סיבוב איטי יכול לשפר את התפלגות תמיסת הנוגדנים.

1. יש להסיר לחלוטין את כל תמיסת השטיפה לפני הוספת תמיסת פולימראז. הימנע לעזוב את התאים ללא פתרון במשך תקופה ארוכה של זמן. יש לדלל את חיץ ההגברה פי 5 במים בעלי טוהר גבוה. הכינו 10 μL לכל באר אם אתם משתמשים בצלחות 384 באר או 20 μL אם אתם משתמשים בכיסויים.
2. הקש על תמיסת הקשירה. יש לכבס פעם אחת עם TBS-T. לאחר מכן יש לבצע שלוש שטיפות נוספות, שכל אחת מהן נמשכת 5 דקות, באמצעות TBS-T. שטפו פעם אחרונה והקישו על TBS-T לפני השלב הבא.
3. הוסיפו את הפולימראז לתמיסת ההגברה 1x בדילול 1:80, מיד לפני החלתו על הדגימות. יש לדגור בתא לחות שחומם מראש בטמפרטורה של 37°C למשך 100 דקות.
   הערה: משלב זה ואילך, הימנע מתצוגת אור ישירה
4. הקש על מאגר ההגברה. יש לכבס פעמיים עם מאגר SSC אחד למשך 10 דקות כל אחת. שטפו פעמיים עם מאגר SSC 0.01x למשך 2 דקות כל אחת.

9. צביעת γ-H2AX (Immunofluorescence - IF)

הערה: הסימון של γ-H2AX מתבצע לאחר סיום ה-PLA.

1. דגירה ראשונית של נוגדנים (IF)
   1. יש לדלל את הנוגדנים הראשוניים (Rabbit anti yH2AX בשעה 1:100) בתמיסת חסימה (לחילופין, ניתן להשתמש ב-3% אלבומין בסרום בקר וטריטון X-100 0.1% בתמיסת PBS). הכן 30 μL של תמיסת נוגדנים לכל באר אם באמצעות coverslips או 20 μL אם באמצעות צלחת 384-well.
   2. הקש על פתרון SSC 0.01x. יש לשטוף פעמיים עם PBS.
   3. הוסף את תמיסת הנוגדנים העיקרית לכל באר. יש לדגור בטמפרטורת החדר למשך שעה אחת.
2. דגירה משנית של נוגדנים (IF)
   הערה: ודא שהנוגדנים המשניים שנבחרו אינם מזהים את הנוגדנים או הבדיקות של PLA. בנוסף, אורך הגל של הנוגדן המשני חייב להיות שונה מאורך הגל של מגיב זיהוי PLA. לדוגמה: מגיב זיהוי PLA שלנו מכיל את הפלואורופור 647, והמשני שבו השתמשנו לזיהוי γ-H2AX הוא 488.
   1. יש לדלל את הנוגדנים המשניים (חמור נגד ארנב אלקסה פלואור 488) בתמיסת חסימה (לחילופין, ניתן להשתמש ב-3% אלבומין בסרום בקר וטריטון X - 100 0.1% בתמיסת PBS) בדילול 1:300. הכינו 30 מיקרוליטר של תמיסת נוגדנים לכל מצב אם אתם משתמשים בכיסויים או 20 מיקרוליטר לבאר אם אתם משתמשים בצלחת 384 באר. הוסף צבע Hoechst 33342 בריכוז סופי של 0.6 מיקרוגרם/מ"ל.
   2. לחץ על תמיסת הנוגדנים העיקרית. שטפו 3x עם TBS-T.
   3. הוסף את תמיסת הנוגדנים המשנית לכל באר. יש לדגור בטמפרטורת החדר למשך 20 דקות.
   4. שטפו 5x עם TBS-T. יש לכבס פעמיים עם מאגר SSC אחד. יש לכבס פעמיים עם מאגר SSC 0.01x.
      הערה: בשלב זה, ניתן לאחסן את הלוחות למשך מספר שבועות בטמפרטורה של 4°C (ב-SSC 0.01X) כשהם מוגנים מפני אור. אם משתמשים בכיסויים, ניתן להתקין את המגלשות, ולאחר יום אחד, ניתן לאחסן את המגלשות ב -20 מעלות צלזיוס.

10. רכישת תמונות

1. השתמש במיקרוסקופ פלואורסצנטי קונבנציונלי והמטרה 63x. קבע את זמן האקספוזיציה על-ידי השוואת פקדים שליליים וחיוביים כדי למנוע רוויה וקריסת נקודות.
   הערה: השימוש במיקרוסקופ קונפוקלי משפר את זיהוי נקודות PLA. המטרה פי 20 יכולה לשמש גם להגדלת מספר הגרעינים שזוהו.
2. לאחר התאמת זמן התערוכה, בצע את כל הרכישות של נקודות PLA עם אותם פרמטרים. נסו לרכוש תמונות מבארות שונות או מאזורי כיסוי, כדי להימנע מממצאים עקב דגירה לא הומוגנית.
3. שמור את כל הערוצים עם אותה תבנית שם. אם המיקרוסקופ מצלם תמונות בערוצים בנפרד, שמור את התמונות המתאימות באותו שם, והוסף רק PLA או Nucleus בתחילת שם הקובץ כדי להבדיל בין הערוץ.

11. ניתוח תמונות

הערה: מאקרו נוצר לניתוח נקודות לכל גרעין בתמונה J/FIJI¹⁷ ולשימוש עם מיקרוסקופים שבהם יש להוסיף את מידע קנה המידה באופן ידני. יש לדעת את גודל הפיקסלים של עדשת המטרה שבה נעשה שימוש. מקמו את התמונות עבור כל ערוץ בתיקיות שונות (קובץ קידוד משלים 1, איור משלים 1).
הערה: המאקרו מתייחס לתעלות פלואורסצנטיות המתקבלות בנפרד. במקרה זה, חשוב לשמור את כל התמונות עם אותו שם.

1. המאקרו מאפשר בחירה של אזור ספציפי בשדה. השתמש באפשרות בחר החזר השקעה כאשר אזור בתמונה מציג לכלוכים שעלולים להזיק לניתוח. בחר ROI בתחילת הניתוח והשתמש בו עבור כל התמונות.
   הערה: זוהי תכונה אופציונלית. אם לא נבחרה, התמונה כולה תילקח בחשבון בניתוח (איור משלים 2).
2. יש ליצור את קובץ החזר ההשקעה לפני השימוש במאקרו, כמתואר להלן. לבחירת החזר השקעה, השתמש בכלי מלבן, בחר את האזור לניתוח והוסף אותו למנהל החזר ההשקעה על-ידי לחיצה על ערוך בחירת >> הוסף למנהל. שמור את החזר ההשקעה על-ידי לחיצה על עוד> שמור.
3. ב- ImageJ ¹⁷, פתח תמונות מתנאים שונים כדי להתאים את הפרמטרים לניתוח. פרמטרים אלה חייבים להיקבע על ידי המשתמש ולציין, יחד עם הנתונים, בתוכנית המאקרו (קובץ קידוד משלים 1)
   1. תיקון רקע: כדי להסיר את הרקע, לחץ/י על ״תהליך״> ״הפחת רקע״. בדוק רדיוסים שונים של כדור מתגלגל באמצעות פונקציית התצוגה המקדימה). השתמשנו גלגול 10 עבור נקודות PLA וגלגול 100 עבור גרעין.
   2. הסר רעש על-ידי לחיצה על תהליך > רעש > הסרת כתמים. עבור גרעין, השתמש בפונקציה חלקה כדי לשפר את מילוי הגרעין על-ידי לחיצה על תהליך>החלקה.
   3. התאמת סף: המר לתמונה של 8 סיביות והתאם את הסף על-ידי לחיצה על > תמונה הקלד > 8 סיביות ועל > תמונה התאם >סף. התאימו את הסף בהתאם כדי להציג באופן חזותי את כל הגרעין או הנקודות הקיימים בתמונה, אך הימנעו מרוויה יתר וממבנים קורסים. רשמו לעצמכם את הערכים ובדקו בתמונות שונות אם הסף מתאים לתמונות שונות.
   4. המר למסיכה על-ידי לחיצה על תהליך > בינארי > המר למסיכה. במקרה של הגרעין, לחץ על Process > Binary > Fill Holes ולאחר מכן על Process > Binary > Watershed. במקרה של נקודות PLA, לחץ על תהליך > קו פרשת המים של > בינארי.
   5. לספירת גרעינים, מדדו את השטח או האורך של הגרעינים השונים כדי להעריך את הגודל הממוצע. השתמש בערך משוער כדי לנתח חלקיקים. לחץ/י על ״נתח״ > ״נתח חלקיקים״ ולאחר מכן בחר/י ״הגדר גודל: 15-אינסוף ״ (ערכים אלה תלויים בגודל הגרעינים). בדוק את האפשרויות הבאות: הצג: מסכה; להציג תוצאות; תוצאות ברורות; לסכם; הוסף למנהל; אל תכלול בקצוות.
   6. לספירת נקודות PLA, מדדו את השטח או את רדיוס הנקודות כדי להעריך את הגודל הממוצע. בחר החל מסיכת גרעין (החל מסיכה היא פונקציה בתוסף GDSC, בדוק אם היא מותקנת) ואחריו נתח > נתח חלקיקים והגדר. 0.02-3 (ערכים אלה תלויים בגודל הגרעינים). בדוק את האפשרויות הבאות: הצג: מסכה; להציג תוצאות; תוצאות ברורות; לסכם; הוסף למנהל; אל תכלול בקצוות.
4. התוצאות מציגות את מספר הנקודות לכל גרעין בכל גרעין שנמצא בתמונה. שמור נתונים אלה.

12. הדמיה של התמונות הממוזגות

1. פתח את הערוצים המתאימים ל- PLA, גרעין ו- γ-H2AX. החסר את הרקע והסר רעש, כפי שצוין בשלבים 11.4.1 ו- 11.4.2 עבור כל התמונות.
2. כוונן את הבהירות והניגודיות באופן אוטומטי או ידני באמצעות אותו ערך עבור כל התנאים מאותו ערוץ. בחר תמונה > התאם > בהירות/ניגודיות.
3. שלבו תמונות (מיזוג) באמצעות בחירה באפשרות 'תמונה' > 'צבע' >'ז ערוצים'. הוסף סרגל קנה מידה על-ידי בחירה באפשרות נתח כלי > > סרגל קנה מידה. שמירה בשם. קובץ TIFF.

תוצאות

ראינו אינטראקציה Nek4-Ku70 בהיעדר טיפול etoposide. אולם האינטראקציה הזו יכולה להתרחש מחוץ לגרעין (איור 1A). האינטראקציה של Nek4-Ku70 גדלה לאחר נזק לדנ"א והיא מרוכזת בגרעין (איור 1A). במקרה של אינטראקציה Nek5-Topoisomerase II β (TOPIIβ), המשמשת בבדיקה זו כבקרה חיובית המ...

Discussion

הנתונים מראים כי השימוש ב- PLA במקביל לסמן פגום ב- DNA יכול לספק את המידע הרב ביותר בפרופיל תגובת נזק ל- DNA, המראה את ההתנהגות המרחבית והזמנית של האינטראקציה לאחר העלבון. PLA היא שיטה רב-תכליתית המשמשת לזיהוי דימריזציה, קביעת מגע אברונים, אינטראקציה חלבון-חומצת גרעין, ובעיקר אי?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Black 384-well plates	Perkin Elmer Cell carrier plates
Donkey  anti- Rabbit Alexa Fluor 488	Invitrogen	A21206	1:300
Duo link Donkey anti Mouse Minus	Sigma	DUO92004
Duolink antibody diluent	Sigma	DUO82008
Duolink blocking solution 1X	Sigma	DUO82007
Duolink Detection reagent Far red	Sigma	DUO92013
Duolink Donkey anti goat plus	Sigma	DUO92003
Duolink Donkey anti rabbit plus	Sigma	DUO92002
Etoposide	Sigma	E1383
Goat anti Nek4	Santa Cruz Biotechnology	SC-5517	goat anti Nek4 was used at 1:50 dilution
Hoechst 33342	Thermo	H1399	0.6 µg/mL
Leica DMI microscope	Leica
Mouse anti Ku70	Thermo	MA5-13110	mouse anti Ku70 was used at 1:100 dilution
Mouse anti TOPIIβ	Santa Cruz Biotechnology	SC-365071	1:25
Rabbit anti Nek5	Santa Cruz Biotechnology	SC-84527	1:25
Rabbit anti Y H2AX	Cell Signalling	9718S	1:100 dilution
U2OS cell line	ATCC	HTB-96