Анализ на основе бесконтактных лигандов для локализации белков в местах повреждения ДНК

Резюме

Здесь мы представляем простой и быстрый протокол для обнаружения взаимодействия белков в местах повреждения ДНК.

Аннотация

Реакция на повреждение ДНК является генетической защитой, которая защищает клетки от увековечивания поврежденной ДНК. Характеристика белков, которые взаимодействуют в этом процессе, позволяет идентифицировать альтернативные мишени для терапевтического вмешательства при нескольких заболеваниях, таких как рак, возрастные заболевания и хроническое воспаление. Анализ бесконтактных лигандов (PLA) появился как инструмент для оценки взаимодействия между белками, а также пространственной близости между органеллами или клеточными структурами и позволяет проводить анализ временной локализации и колокализации, например, в условиях стресса. Метод прост, потому что он похож на обычную иммунофлюоресценцию и позволяет одновременно окрашивать органеллу, клеточную структуру или специфический маркер, такой как митохондрии, эндоплазматический ретикулум, PML-тельца или двухцепочечный маркер ДНК, yH2AX. Фосфорилирование S139 в варианте гистона 2A, H2AX, тогда называемом yH2AX, широко используется в качестве очень чувствительного и специфичного маркера двухцепочечных разрывов ДНК. Каждый очаг окрашивания yH2AX соответствует одному разрыву в ДНК, который происходит через несколько минут после повреждения. Анализ изменений в очагах yH2AX является наиболее распространенным методом для изучения того, участвует ли интересующий белок в ответе на повреждение ДНК (DDR). Независимо от того, предполагается ли непосредственная роль в сайте повреждения ДНК, флуоресцентная микроскопия используется для проверки колокализации представляющего интерес белка с очагами yH2AX. Однако, за исключением новых методов флуоресценции со сверхвысоким разрешением, можно сделать вывод, что локальное взаимодействие с сайтами повреждения ДНК может быть немного субъективным. Здесь мы показываем анализ для оценки локализации белков в пути DDR с использованием yH2AX в качестве маркера места повреждения. Этот анализ может быть использован для характеристики временной локализации под различными повреждениями, вызывающими повреждение ДНК.

Введение

Повреждение клеточной ДНК происходит ежедневно из-за спонтанных химических реакций, а также усиливается экзогенными факторами, такими как генотоксические агенты (радиация и химические вещества, такие как этопозид) и окислительный стресс ^1,2,3. Клетки имеют сложный механизм, который корректирует множество различных типов повреждений ДНК, от удаления оснований до репликативного перекручивания вилки или прерывания до самого вредного поражения: двухцепочечного разрыва ДНК ^4,5.

Несколько белков, участвующих в DDR, уже были охарактеризованы, и в превосходных ревизиях исследуются пути негомологичного соединения концов (NHEJ) и гомологичной рекомбинации (HR), основные пути, подразумеваемые в репарации двухцепочечных разрывов (DSB) ^5,6. Фосфорилирование варианта гистона H2A, H2AX, в серине 139 (впоследствии названном y-H2AX) в течение многих лет использовалось в качестве чувствительного и надежного маркера двухцепочечного разрыва. Фосфорилирование H2AX наблюдается в первые минуты после повреждения и может сохраняться в течение⁷ часов.

Преимуществом использования иммунофлуоресцентной детекции очагов γ-H2AX является характеристика временного и пространственного распределения очагов, а также их совместное окрашивание с другими белками. Кроме того, иммунофлюоресценция не требует лизиса, что сохраняет информацию о клеточном контексте и делает ее более информативной. Кроме того, поскольку γ-H2AX образуется заново, он не присутствует в изобилии при отсутствии повреждений ДНК, что делает его специфическим маркером⁷.

Ku70/80 (XRCC6 X-ray repair cross-complementing 6 / XRCC5 X-ray repair cross-complementing 5) и каталитическая субъединица ДНК-протеинкиназы (DNA-PKcs) отвечают за идентификацию DSB и защиту концов ДНК, в то время как Artemis выполняет обработку концов для облегчения лигирования комплексом XRCC4-Ligase IV. Фосфорилирование H2AX в сайтах, фланкирующих DSB, действует как сигнал для рекрутирования нескольких белков репарации и сигнализирует об остановке, гибели^{или выживании} клеточного цикла.

Анализ изменений в очагах y-H2AX является наиболее распространенным методом для изучения того, участвует ли интересующий белок в ответе на повреждение ДНК. Независимо от того, предполагается ли непосредственная роль в месте повреждения ДНК, флуоресцентная микроскопия используется для проверки совместной локализации представляющего интерес белка с очагами y-H2AX. Однако, за исключением новых методов флуоресценции со сверхвысоким разрешением, вывод о локальном взаимодействии с сайтами повреждения ДНК может быть сложным. Кроме того, обнаружение иммунофлуоресценции обычно зависит от многих белковых молекул в месте повреждения ДНК, что затрудняет идентификацию дефицитных белков⁹.

Здесь мы показываем анализ для оценки локализации белков, участвующих в пути DDR, с использованием y-H2AX в качестве маркера места повреждения. Этот анализ может быть использован для характеристики временной локализации при различных повреждениях, вызывающих повреждение ДНК.

Анализ бесконтактных лигандов (PLA) появился в качестве инструмента для оценки взаимодействия между белками, а также пространственной близости между органеллами или клеточными структурами^10,11 и позволяет проводить анализ временной локализации и колокализации, например, в условиях стресса. Метод прост, потому что он похож на обычную иммунофлюоресценцию и позволяет одновременно окрашивать маркеры, специфичные для органелл или клеточной структуры, такие как митохондрии, эндоплазматический ретикулум, PML-тельца или двухцепочечный маркер ДНК, yH2AX. Использование PLA позволяет идентифицировать взаимодействие белков во время повреждения ДНК чувствительным, специфичным и надежным способом, который может быть использован для мониторинга взаимодействия во время клеточного цикла, в ответ на различные стимулы и в разное время после генотоксического стресса.

Здесь показано использование PLA в сочетании с обычной иммунофлюоресценцией γ-H2AX для локализации взаимодействия Nek4-Ku70 после этопозид-индуцированного повреждения ДНК. Nek4, член семейства Nek (NIMA-родственных киназ), не играет четкой роли в ответе на повреждение ДНК. В 2012 году Нгуен и его коллеги показали, что Nek4 взаимодействует с белками Ku70/Ku80, и в отсутствие Nek4 эти белки не рекрутируются в сайт повреждения ДНК, и фосфорилирование H2AX^{нарушается}. Клеточная локализация этого взаимодействия до сих пор неизвестна. Мы наблюдали снижение фосфорилирования Ku70 в клетках, экспрессирующих Nek4-киназный мертвый мутант¹³, но еще предстоит выяснить, фосфорилирует ли Nek4 непосредственно Ku70. Учитывая, что взаимодействие Nek4 с Ku70 увеличивается после обработки этопозидом по данным иммунопреципитации¹², мы попытались локализовать это взаимодействие с помощью PLA и маркера γ-H2AX.

Обычно исследования взаимодействия основаны на иммунопреципитации, но они проводятся in vitro и не дают информации о месте взаимодействия. По возможности можно провести иммунопреципитацию фракционированных клеток (ядра, митохондрий, клеточной мембраны или цитозоля), но выполнение временного цикла взаимодействия является дорогостоящим и трудоемким. Иммунофлуоресценция может дать информацию о клеточной локализации белков, но доказать взаимодействие может быть сложно и зависит от разрешения микроскопов. В этой статье мы демонстрируем преимущество использования анализа бесконтактного лиганда для мониторинга взаимодействия двух белков в контексте повреждения ДНК.

протокол

1. Покрытие ячеек

ПРИМЕЧАНИЕ: Клетки могут быть засеяны в микроскопические флуоресцентные слайды, камеры или планшеты. Использование небольших покровных стекол или планшетов 96/ 384 лунок рекомендуется для тестирования нескольких условий и запасных реагентов. Использование покровных колпачков рекомендуется для клеточных линий, которые легко отделяются, таких как клетки HEK293. Покровные стекла могут быть предварительно покрыты раствором поли-L-лизина для улучшения крепления.

1. Пластинчатые клетки с учетом транспортного средства, технического контроля и биологического контроля. Используйте технические повторы на двух-трех скважинах на одно условие.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Использование технического контроля (как вторичного, так и только одного основного) является обязательным. Если это возможно, следует также включить биологический контроль (например, сверхэкспрессию или нокдаун одного из целевых белков или состояние, которое, как известно, изменяет взаимодействие).
   1. Культивирование клеток U2OS в модифицированной среде Dulbecco Modified Eagle Medium (DMEM) с добавлением 10% фетальной сыворотки крупного рогатого скота (FBS), 4,5 г/л глюкозы и 4 мМ L-глютамина на обработанных тканевых культурах планшетах при 37 °C при 5%_CO2 и увлажненной атмосфере, содержащей 90% воздуха. В зависимости от количества проверяемых условий и при использовании 384 или покровных стекол на пластине 60 мм, начните с пластины 60 или 100 мм соответственно.
   2. Когда клетки достигают 60%-70% конфлюенции, расщепляют клетки с использованием 0,25% трипсина-ЭДТА ¹⁴. Подсчет ячеек с помощью камеры Нейбауэра или автоматического счетчика¹⁴. Планшет 4 x 10⁵ ячеек в планшете 60 мм, содержащий несколько круглых покровных стекол 13 мм, или 4 x 10⁵ клеток на лунку в планшете (планшетах) на 384 лунки и инкубируется в течение 12 - 24 часов при 37 °C в увлажненном инкубаторе с 5% содержанием_CO2 .

2. Приготовление растворов

ПРИМЕЧАНИЕ: Концентрация и время лечения были выбраны на основании литературных результатов, которые указывают на активацию путей восстановления повреждений ДНК ^15,16.

1. Приготовьте исходный раствор Этопозида в концентрации 50 мМ в ДМСО. Исходный раствор можно хранить при температуре -20 °C в течение нескольких месяцев. Раствор этопозида разбавляют для использования в полной питательной среде при конечной концентрации 25 мкМ. Используйте ДМСО в концентрации 0,05%, разведенный в полной питательной среде, в качестве средства управления транспортным средством.
2. Приготовьте 20-кратный солевой цитрат натрия (SSC; 3,0 М NaCl, 0,30 М цитрат тринатрия pH 7,0). Этот раствор можно хранить в течение нескольких месяцев при температуре 4 °C.

3. Лечение и фиксация клеток

ПРИМЕЧАНИЕ: Ни в коем случае не допускайте высыхания клеток; Старайтесь как можно больше оттачивать от предыдущих решений. Соответствующий метод фиксации клеток (ледяной метанол или 4% параформальдегид (PFA)) должен быть определен заранее, как и разведение антител с использованием обычного иммунофлуоресцентного эксперимента.

ВНИМАНИЕ: Метанол необходимо утилизировать надлежащим образом.

1. Извлеките питательную среду из лунок и добавьте питательную среду, содержащую этопозид или ДМСО в концентрации 25 мкМ или 0,05% соответственно. Инкубируйте клетки при 37 °C в 5%_CO2 и увлажненной атмосфере, содержащей 90% воздуха, с этопозидом или ДМСО в течение 3 различных периодов времени: 20 минут, 1 час и 3 часа. При использовании пластин 384 все условия должны быть зафиксированы одновременно.
   1. Для этого начните с лечения состояния с самым длительным временем лечения, например, 3 часа. Через 2 часа проведите лечение в течение 1 часа, а когда останется 20 минут для фиксации, проведите лечение в течение 20 минут. После этого все условия могут быть зафиксированы одновременно.
2. Удалите среду из лунок и промойте клетки PBS 3x.
3. Закрепите ячейки, добавив ледяной метанол в объеме, достаточном для покрытия поверхности лунки. Выдерживать в течение 10 мин при температуре -20 °C. Промойте лунки PBS 3x.
   ПРИМЕЧАНИЕ: На этом этапе протокол может быть приостановлен. Пластины можно хранить при температуре 4 °C в течение 1 недели.

4. Пермеабилизация и блокировка

ПРИМЕЧАНИЕ: При использовании метода фиксации PFA перед пермеабилизацией необходимо провести этап блокировки глицином. Камеру влажности можно подготовить, поместив внутрь инкубатора поддон для воды, в результате чего влажность составит около 95%. Планшет или предметные стекла 384 можно инкубировать в закрытом пластиковом контейнере над фильтровальной бумагой или смоченной губкой и прозрачной пленкой.

1. Отключите PBS от образцов.
2. Добавьте 30-40 μл пермеабилизационного буфера (0,2% Triton X-100 в PBS) и инкубируйте в течение 20 минут при комнатной температуре. Стирка 3 раза с PBS
3. Отсоедините PBS от образцов и добавьте 30-40 мкл 1x блокирующего раствора, входящего в набор PLA (в качестве альтернативы можно использовать 3% бычьей сыворотки альбумина и 0,1% раствора PBS Triton X-100) в каждую лунку/покровное стекло.
4. Инкубировать планшет в предварительно нагретой влажной камере при температуре 37 °C в течение 1 ч.

5. Первичная инкубация антител (PLA)

ПРИМЕЧАНИЕ: При использовании покровных стекол важно убедиться, что раствор антитела покрывает все поверхности покровных стекол. Особое внимание необходимо уделить подбору антител. Антитела должны быть получены от различных видов животных, а вторичное антитело, используемое для γ-H2AX, не должно быть направлено против вида-хозяина, производящего зонды PLA. Например, первичные антитела, используемые для PLA, были выращены у мышей и коз. В осле были изготовлены зонды PLA, антимышь и антикозла. Антитело против γ-H2AX было получено у кроликов, а вторичным используется анти-кролик, полученный у ослов. Таким образом, вторичный не будет распознавать зонды НОАК.

1. Разведите первичные антитела (мышиный анти-Ku70 1:100 и козий анти-Nek4 1:50; кролик анти-Nek5 1:25 и мышиный анти-TOPIIβ 1:25) в разбавителе антител, входящем в комплект (в качестве альтернативы можно использовать 3% бычьего сывороточного альбумина и 0,1% Triton X-100 0,1% в растворе PBS). Приготовьте 30 мкл раствора антитела на одно условие при использовании покровных стекол или 20 мкл на лунку при использовании 384-луночного планшета.
2. Отключите решение для блокировки. Добавьте раствор первичного антитела в каждую лунку. Инкубировать при температуре 4 °C в течение ночи в камере с влажностью.

6. Инкубация зонда PLA

ПРИМЕЧАНИЕ: Выбирайте зонды, принимая во внимание не только первичные антитела, но и те, которые предназначены для использования на этапах иммунофлуоресценции. При использовании 384-луночных планшетов для длительной инкубации при температуре 37 °C можно использовать медленное вращение для улучшения распределения раствора антитела.

1. Разведите зонды минус и плюс 1:5 в разбавителе антител. Приготовьте 10 мкл на лунку при использовании 384-луночных планшетов или 20 мкл на пробу при использовании покровных стекол. Используйте следующие комбинации: Donkey anti-mouse minus с Donkey anti-goat plus; Ослиный анти-мышиный минус с Осликом анти-кролик плюс.
2. Выведите из рук первичный раствор антитела. Умывайтесь 1x с TBS-T (50 мМ Tris pH 7,5, 150 мМ NaCl, 0,05% от Tween-20). Постирайте 3 раза по 5 минут каждый с TBS-T при комнатной температуре. Выполните дополнительную промывку с помощью TBS-T.
3. Вытряхните и добавьте раствор для зонда PLA с 10 μL для пластин и 20 μL для покровных стекол. Инкубировать в предварительно разогретой влажной камере при температуре 37 °C в течение 1 часа.

7. Лигирование

ПРИМЕЧАНИЕ: Подождите с добавлением Лигазы непосредственно перед добавлением ее в образцы. Лигазу необходимо хранить в морозильной камере (-20 °C). Перед добавлением раствора лигазы удалите полностью весь раствор для стирки. Не оставляйте клетки без раствора в течение длительного периода времени. При использовании 384-луночных планшетов для инкубации при температуре 37 °C можно использовать медленное вращение для улучшения распределения раствора антитела.

1. Разбавьте 5-кратный буфер для лигирования в воде высокой чистоты. Приготовьте 10 мкл на лунку при использовании 384-луночных планшетов или 20 мкл при использовании покровных стекол.
2. Отключите зонд из PLA. Постирайте 1x с TBS-T. Затем проведите три дополнительных мытья, каждое из которых длится 5 минут, используя TBS-T. Промойте в последний раз и постучите по TBS-T перед следующим шагом.
3. Добавьте Лигазу в раствор 1x Ligation через 1:40, непосредственно перед нанесением его на образцы. Инкубировать в предварительно разогретой влажной камере при температуре 37 °C в течение от 30 минут до 1 часа.

8. Усиление и промывка

ПРИМЕЧАНИЕ: Подождите с добавлением полимеразы непосредственно перед добавлением в образец. Буфер усиления чувствителен к свету; Защитите от света все растворы, содержащие буфер. Полимеразу необходимо хранить в морозильной камере (-20 °C). Не оставляйте клетки без раствора в течение длительного периода времени. При использовании 384-луночных планшетов для инкубации при температуре 37 °C медленное вращение может улучшить распределение раствора антитела.

1. Перед добавлением раствора полимеразы полностью удалите весь раствор для промывки. Не оставляйте клетки без раствора в течение длительного периода времени. Разбавьте 5-кратный амплификационный буфер в воде высокой чистоты. Приготовьте 10 мкл на лунку при использовании 384-луночных планшетов или 20 мкл при использовании покровных стекол.
2. Постучите по раствору для лигирования. Постирайте 1x с TBS-T. Затем проведите три дополнительных мытья, каждое из которых длится 5 минут, используя TBS-T. Промойте в последний раз и постучите по TBS-T перед следующим шагом.
3. Добавьте полимеразу в раствор для амплификации 1x в соотношении 1:80, непосредственно перед нанесением его на образцы. Выдерживать в предварительно разогретой влажной камере при температуре 37 °C в течение 100 минут.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Начиная с этого шага, избегайте прямого освещения
4. Отключите буфер усиления. Промойте 2x с 1x буфером SSC по 10 минут каждый. Промойте 2 раза с 0,01x буфером SSC в течение 2 минут каждый.

9. Окрашивание γ-H2AX (иммунофлуоресценция - IF)

ПРИМЕЧАНИЕ: Маркировка γ-H2AX выполняется после окончания PLA.

1. Первичная инкубация антител (ИФ)
   1. Разведите первичные антитела (Rabbit anti yH2AX в соотношении 1:100) в блокирующем растворе (в качестве альтернативы можно использовать 3% бычьего сывороточного альбумина и 0,1% Triton X-100 в растворе PBS). Приготовьте 30 мкл раствора антитела на лунку при использовании покровных стекол или 20 мкл при использовании 384-луночного планшета.
   2. Выключите решение 0.01x SSC. Постирайте 2 раза с PBS.
   3. Добавьте раствор первичного антитела в каждую лунку. Выдерживать при комнатной температуре в течение 1 ч.
2. Вторичная инкубация антител (ИФ)
   ПРИМЕЧАНИЕ: Убедитесь, что выбранные вторичные антитела не распознают антитела или зонды PLA. Кроме того, длина волны вторичного антитела должна отличаться от длины волны реагента для обнаружения PLA. Например: наш реагент для обнаружения PLA содержит флуорофор 647, а вторичный реагент, который мы использовали для обнаружения γ-H2AX, — 488.
   1. Разведите вторичные антитела (Donkey anti-Rabbit Alexa Fluor 488) в блокирующем растворе (в качестве альтернативы можно использовать 3% Bovine Serum Albumin и Triton X - 100 0,1% в растворе PBS) в разведении 1:300. Приготовьте 30 мкл раствора антитела на одно условие при использовании покровных стекол или 20 мкл на лунку при использовании 384-луночного планшета. Добавьте краситель Hoechst 33342 в конечную концентрацию 0,6 мкг/мл.
   2. Выведите из рук первичный раствор антитела. Постирайте 3 раза с TBS-T.
   3. Добавьте вторичный раствор антитела в каждую лунку. Выдерживать при комнатной температуре в течение 20 минут.
   4. Постирайте 5 раз с TBS-T. Промойте 2x с 1x буфером SSC. Промойте 2x с 0,01x SSC буфером.
      ПРИМЕЧАНИЕ: На этом этапе пластины можно хранить в течение нескольких недель при температуре 4 °C (при SSC 0,01X) в защищенном от света месте. При использовании покровных стекол слайды можно монтировать, а через 1 день их можно хранить при температуре -20 °C.

10. Получение изображения

1. Используйте обычный флуоресцентный микроскоп и объектив с 63-кратным увеличением. Определите время экспозиции, сравнивая отрицательный и положительный контроль, чтобы избежать насыщения и схлопывания точек.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Использование конфокальных микроскопов улучшает обнаружение точек PLA. Объектив 20x также может быть использован для увеличения числа обнаруженных ядер.
2. После того, как время экспозиции будет скорректировано, выполните все сборы точек PLA с теми же параметрами. Старайтесь получать изображения из разных скважин или областей покровных покрытий, чтобы избежать артефактов из-за неоднородной инкубации.
3. Сохраните все каналы с одинаковым именем. Если микроскоп делает фотографии в каналах отдельно, сохраните соответствующие снимки с одинаковым именем, добавив в начале имени файла только PLA или Nucleus для дифференциации канала.

11. Анализ изображений

ПРИМЕЧАНИЕ: Макрос был создан для анализа точек на ядро на изображении J/FIJI¹⁷ и для использования с микроскопами, где информация о масштабе должна быть добавлена вручную. Размер пикселя используемого объектива должен быть известен. Поместите изображения для каждого канала в разные папки (Файл дополнительного кодирования 1, Дополнительный рисунок 1).
ПРИМЕЧАНИЕ: Макрос учитывает каналы флуоресценции, полученные отдельно. В этом случае важно сохранить все изображения с одинаковым именем.

1. Макрос позволяет выбрать определенный регион в поле. Используйте параметр Выбрать ROI, если в области изображения отображаются артефакты, которые могут нанести ущерб анализу. Выберите ROI в начале анализа и используйте его для всех изображений.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Это дополнительная функция. Если этот параметр не выбран, то при анализе будет учитываться все изображение (дополнительный рисунок 2).
2. Файл ROI должен быть создан до использования макроса, как описано ниже. Для выбора ROI используйте инструмент прямоугольника, выберите область для анализа и добавьте ее в менеджер ROI, нажав Редактировать > выбор> Добавить в менеджер. Сохраните ROI , нажав «Еще> «Сохранить».
3. В ImageJ ¹⁷ откройте изображения из разных условий, чтобы настроить параметры для анализа. Эти параметры должны быть определены пользователем и указаны, вместе с данными, в макропрограмме (Supplementary Coding File 1)
   1. Коррекция фона: Чтобы удалить фон, нажмите «Процесс> «Вычесть фон». Проверьте различный радиус катящегося шара с помощью функции предварительного просмотра). Мы использовали раскатку 10 для точек PLA и раскатку 100 для ядра.
   2. Удалите шум, нажав кнопку Обработать > Шум > удалить пятна. Для ядра используйте функцию smooth, чтобы улучшить заполнение ядра, нажав Process>Smooth.
   3. Настройка порога: Преобразуйте изображение в 8-битное изображение и настройте порог, нажав Изображение > Тип > 8 бит и Изображение > Настроить >Порог. Отрегулируйте порог соответствующим образом, чтобы визуализировать все ядра или точки, присутствующие на изображении, но избежать перенасыщения и коллапса структур. Запишите значения и проверьте их на разных изображениях, чтобы проверить, работает ли пороговое значение для разных изображений.
   4. Преобразуйте в маску, нажав Обработать > Двоичный файл > Преобразовать в маску. В случае ядра нажмите Process > Binary > Fill holes, а затем Process > Binary > Watershed. В случае с точками PLA нажмите «Обработать > двоичный > водораздел».
   5. Для подсчета ядер измерьте площадь или длину различных ядер, чтобы оценить средний размер. Используйте приблизительное значение для анализа частиц. Нажмите «Анализировать» > «Анализировать частицы», затем выберите «Установить размер: 15-бесконечность» (эти значения зависят от размера ядер). Отметьте следующие опции: Показать: Маска; Отображение результатов; Понятные результаты; Суммировать; Добавить в Менеджер; Исключить по краям.
   6. Для подсчета точек PLA измерьте площадь или радиус точек, чтобы оценить средний размер. Выберите Apply Nucleus Mask (apply mask - это функция в плагине GDSC, проверьте, установлена ли она), затем Analyze > Analyze particles и установите. 0,02-3 (эти значения зависят от размера ядер). Отметьте следующие опции: Показать: Маска; Отображение результатов; Понятные результаты; Суммировать; Добавить в Менеджер; Исключить по краям.
4. Результаты показывают количество точек на ядро в каждом ядре, присутствующем на изображении. Сохраните эти данные.

12. Визуализация объединенных изображений

1. Откройте каналы, соответствующие PLA, ядру и γ-H2AX. Вычтите фон и удалите шум, как указано в шагах 11.4.1 и 11.4.2 для всех изображений.
2. Регулируйте яркость и контрастность автоматически или вручную, используя одно и то же значение для всех условий из одного и того же канала. Выберите Изображение > Настроить > Яркость/контрастность.
3. Объедините изображения (слияние), выбрав «Изображение > цвет > «Объединить каналы». Добавьте масштабную линейку, выбрав «Анализ > Инструменты» > «Масштабная линейка». Сохранить как. Файл TIFF.

Результаты

Мы наблюдали взаимодействие Nek4-Ku70 в отсутствие обработки этопозидом. Однако это взаимодействие может происходить за пределами ядра (рис. 1А). Взаимодействие Nek4-Ku70 усиливается после повреждения ДНК и концентрируется в ядре (рис. 1А). В слу...

Обсуждение

Данные показывают, что использование PLA одновременно с маркером, поврежденным ДНК, может предоставить наибольшую информацию в профилировании ответа на повреждение ДНК, показывая пространственное и временное поведение взаимодействия после повреждения. PLA является у?...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Black 384-well plates	Perkin Elmer Cell carrier plates
Donkey  anti- Rabbit Alexa Fluor 488	Invitrogen	A21206	1:300
Duo link Donkey anti Mouse Minus	Sigma	DUO92004
Duolink antibody diluent	Sigma	DUO82008
Duolink blocking solution 1X	Sigma	DUO82007
Duolink Detection reagent Far red	Sigma	DUO92013
Duolink Donkey anti goat plus	Sigma	DUO92003
Duolink Donkey anti rabbit plus	Sigma	DUO92002
Etoposide	Sigma	E1383
Goat anti Nek4	Santa Cruz Biotechnology	SC-5517	goat anti Nek4 was used at 1:50 dilution
Hoechst 33342	Thermo	H1399	0.6 µg/mL
Leica DMI microscope	Leica
Mouse anti Ku70	Thermo	MA5-13110	mouse anti Ku70 was used at 1:100 dilution
Mouse anti TOPIIβ	Santa Cruz Biotechnology	SC-365071	1:25
Rabbit anti Nek5	Santa Cruz Biotechnology	SC-84527	1:25
Rabbit anti Y H2AX	Cell Signalling	9718S	1:100 dilution
U2OS cell line	ATCC	HTB-96