Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.
Здесь мы представляем простой и быстрый протокол для обнаружения взаимодействия белков в местах повреждения ДНК.
Реакция на повреждение ДНК является генетической защитой, которая защищает клетки от увековечивания поврежденной ДНК. Характеристика белков, которые взаимодействуют в этом процессе, позволяет идентифицировать альтернативные мишени для терапевтического вмешательства при нескольких заболеваниях, таких как рак, возрастные заболевания и хроническое воспаление. Анализ бесконтактных лигандов (PLA) появился как инструмент для оценки взаимодействия между белками, а также пространственной близости между органеллами или клеточными структурами и позволяет проводить анализ временной локализации и колокализации, например, в условиях стресса. Метод прост, потому что он похож на обычную иммунофлюоресценцию и позволяет одновременно окрашивать органеллу, клеточную структуру или специфический маркер, такой как митохондрии, эндоплазматический ретикулум, PML-тельца или двухцепочечный маркер ДНК, yH2AX. Фосфорилирование S139 в варианте гистона 2A, H2AX, тогда называемом yH2AX, широко используется в качестве очень чувствительного и специфичного маркера двухцепочечных разрывов ДНК. Каждый очаг окрашивания yH2AX соответствует одному разрыву в ДНК, который происходит через несколько минут после повреждения. Анализ изменений в очагах yH2AX является наиболее распространенным методом для изучения того, участвует ли интересующий белок в ответе на повреждение ДНК (DDR). Независимо от того, предполагается ли непосредственная роль в сайте повреждения ДНК, флуоресцентная микроскопия используется для проверки колокализации представляющего интерес белка с очагами yH2AX. Однако, за исключением новых методов флуоресценции со сверхвысоким разрешением, можно сделать вывод, что локальное взаимодействие с сайтами повреждения ДНК может быть немного субъективным. Здесь мы показываем анализ для оценки локализации белков в пути DDR с использованием yH2AX в качестве маркера места повреждения. Этот анализ может быть использован для характеристики временной локализации под различными повреждениями, вызывающими повреждение ДНК.
Повреждение клеточной ДНК происходит ежедневно из-за спонтанных химических реакций, а также усиливается экзогенными факторами, такими как генотоксические агенты (радиация и химические вещества, такие как этопозид) и окислительный стресс 1,2,3. Клетки имеют сложный механизм, который корректирует множество различных типов повреждений ДНК, от удаления оснований до репликативного перекручивания вилки или прерывания до самого вредного поражения: двухцепочечного разрыва ДНК 4,5.
1. Покрытие ячеек
ПРИМЕЧАНИЕ: Клетки могут быть засеяны в микроскопические флуоресцентные слайды, камеры или планшеты. Использование небольших покровных стекол или планшетов 96/ 384 лунок рекомендуется для тестирования нескольких условий и запасных реагентов. Использование покровных колпачков рекомендуется для клеточных линий, которые легко отделяются, таких как клетки HEK293. Покровные стекла могут быть предварительно покрыты раствором поли-L-лизина для улучшения крепления.
Мы наблюдали взаимодействие Nek4-Ku70 в отсутствие обработки этопозидом. Однако это взаимодействие может происходить за пределами ядра (рис. 1А). Взаимодействие Nek4-Ku70 усиливается после повреждения ДНК и концентрируется в ядре (рис. 1А). В слу.......
Данные показывают, что использование PLA одновременно с маркером, поврежденным ДНК, может предоставить наибольшую информацию в профилировании ответа на повреждение ДНК, показывая пространственное и временное поведение взаимодействия после повреждения. PLA является у?.......
Авторы заявляют, что у них нет конкурирующих финансовых интересов.
Мы благодарим Fundação de Amparo a Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP, через грант Temático 2022/15126-9 JK и стипендию 21/09439-1 для LARM) и Conselho Nacional de Desenvolvimento Cientifico e Tecnológico (CNPq) за финансирование этого исследования.
....Name | Company | Catalog Number | Comments |
Black 384-well plates | Perkin Elmer Cell carrier plates | ||
Donkey anti- Rabbit Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A21206 | 1:300 |
Duo link Donkey anti Mouse Minus | Sigma | DUO92004 | |
Duolink antibody diluent | Sigma | DUO82008 | |
Duolink blocking solution 1X | Sigma | DUO82007 | |
Duolink Detection reagent Far red | Sigma | DUO92013 | |
Duolink Donkey anti goat plus | Sigma | DUO92003 | |
Duolink Donkey anti rabbit plus | Sigma | DUO92002 | |
Etoposide | Sigma | E1383 | |
Goat anti Nek4 | Santa Cruz Biotechnology | SC-5517 | goat anti Nek4 was used at 1:50 dilution |
Hoechst 33342 | Thermo | H1399 | 0.6 µg/mL |
Leica DMI microscope | Leica | ||
Mouse anti Ku70 | Thermo | MA5-13110 | mouse anti Ku70 was used at 1:100 dilution |
Mouse anti TOPIIβ | Santa Cruz Biotechnology | SC-365071 | 1:25 |
Rabbit anti Nek5 | Santa Cruz Biotechnology | SC-84527 | 1:25 |
Rabbit anti Y H2AX | Cell Signalling | 9718S | 1:100 dilution |
U2OS cell line | ATCC | HTB-96 |
Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи
Запросить разрешениеThis article has been published
Video Coming Soon
Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены