Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

Здесь мы представляем простой и быстрый протокол для обнаружения взаимодействия белков в местах повреждения ДНК.

Аннотация

Реакция на повреждение ДНК является генетической защитой, которая защищает клетки от увековечивания поврежденной ДНК. Характеристика белков, которые взаимодействуют в этом процессе, позволяет идентифицировать альтернативные мишени для терапевтического вмешательства при нескольких заболеваниях, таких как рак, возрастные заболевания и хроническое воспаление. Анализ бесконтактных лигандов (PLA) появился как инструмент для оценки взаимодействия между белками, а также пространственной близости между органеллами или клеточными структурами и позволяет проводить анализ временной локализации и колокализации, например, в условиях стресса. Метод прост, потому что он похож на обычную иммунофлюоресценцию и позволяет одновременно окрашивать органеллу, клеточную структуру или специфический маркер, такой как митохондрии, эндоплазматический ретикулум, PML-тельца или двухцепочечный маркер ДНК, yH2AX. Фосфорилирование S139 в варианте гистона 2A, H2AX, тогда называемом yH2AX, широко используется в качестве очень чувствительного и специфичного маркера двухцепочечных разрывов ДНК. Каждый очаг окрашивания yH2AX соответствует одному разрыву в ДНК, который происходит через несколько минут после повреждения. Анализ изменений в очагах yH2AX является наиболее распространенным методом для изучения того, участвует ли интересующий белок в ответе на повреждение ДНК (DDR). Независимо от того, предполагается ли непосредственная роль в сайте повреждения ДНК, флуоресцентная микроскопия используется для проверки колокализации представляющего интерес белка с очагами yH2AX. Однако, за исключением новых методов флуоресценции со сверхвысоким разрешением, можно сделать вывод, что локальное взаимодействие с сайтами повреждения ДНК может быть немного субъективным. Здесь мы показываем анализ для оценки локализации белков в пути DDR с использованием yH2AX в качестве маркера места повреждения. Этот анализ может быть использован для характеристики временной локализации под различными повреждениями, вызывающими повреждение ДНК.

Введение

Повреждение клеточной ДНК происходит ежедневно из-за спонтанных химических реакций, а также усиливается экзогенными факторами, такими как генотоксические агенты (радиация и химические вещества, такие как этопозид) и окислительный стресс 1,2,3. Клетки имеют сложный механизм, который корректирует множество различных типов повреждений ДНК, от удаления оснований до репликативного перекручивания вилки или прерывания до самого вредного поражения: двухцепочечного разрыва ДНК 4,5.

протокол

1. Покрытие ячеек

ПРИМЕЧАНИЕ: Клетки могут быть засеяны в микроскопические флуоресцентные слайды, камеры или планшеты. Использование небольших покровных стекол или планшетов 96/ 384 лунок рекомендуется для тестирования нескольких условий и запасных реагентов. Использование покровных колпачков рекомендуется для клеточных линий, которые легко отделяются, таких как клетки HEK293. Покровные стекла могут быть предварительно покрыты раствором поли-L-лизина для улучшения крепления.

  1. Пластинчатые клетки с учетом транспортного средства, технического контроля и биологического контроля. Испол....

Результаты

Мы наблюдали взаимодействие Nek4-Ku70 в отсутствие обработки этопозидом. Однако это взаимодействие может происходить за пределами ядра (рис. 1А). Взаимодействие Nek4-Ku70 усиливается после повреждения ДНК и концентрируется в ядре (рис. 1А). В слу.......

Обсуждение

Данные показывают, что использование PLA одновременно с маркером, поврежденным ДНК, может предоставить наибольшую информацию в профилировании ответа на повреждение ДНК, показывая пространственное и временное поведение взаимодействия после повреждения. PLA является у?.......

Раскрытие информации

Авторы заявляют, что у них нет конкурирующих финансовых интересов.

Благодарности

Мы благодарим Fundação de Amparo a Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP, через грант Temático 2022/15126-9 JK и стипендию 21/09439-1 для LARM) и Conselho Nacional de Desenvolvimento Cientifico e Tecnológico (CNPq) за финансирование этого исследования.

....

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
Black 384-well platesPerkin Elmer Cell carrier plates
Donkey  anti- Rabbit Alexa Fluor 488InvitrogenA212061:300
Duo link Donkey anti Mouse MinusSigmaDUO92004
Duolink antibody diluentSigmaDUO82008
Duolink blocking solution 1XSigmaDUO82007
Duolink Detection reagent Far redSigmaDUO92013
Duolink Donkey anti goat plusSigmaDUO92003
Duolink Donkey anti rabbit plusSigmaDUO92002
EtoposideSigmaE1383
Goat anti Nek4Santa Cruz BiotechnologySC-5517goat anti Nek4 was used at 1:50 dilution
Hoechst 33342ThermoH13990.6 µg/mL
Leica DMI microscopeLeica
Mouse anti Ku70ThermoMA5-13110mouse anti Ku70 was used at 1:100 dilution
Mouse anti TOPIIβSanta Cruz BiotechnologySC-3650711:25
Rabbit anti Nek5Santa Cruz BiotechnologySC-845271:25
Rabbit anti Y H2AXCell Signalling9718S1:100 dilution
U2OS cell lineATCCHTB-96 

Ссылки

  1. Xiao, W., Samson, L. In vivo evidence for endogenous DNA alkylation damage as a source of spontaneous mutation in eukaryotic cells. Proc Nat Acad Sci U S A. 90 (6), 2117-2121 (1993).
  2. Lindahl, T., Barnes, D. E. R....

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

210YH2AXDDR

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Исследования

Образование

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены