Анализ на основе бесконтактных лигандов для локализации белков в местах повреждения ДНК

Резюме

Здесь мы представляем простой и быстрый протокол для обнаружения взаимодействия белков в местах повреждения ДНК.

Аннотация

Реакция на повреждение ДНК является генетической защитой, которая защищает клетки от увековечивания поврежденной ДНК. Характеристика белков, которые взаимодействуют в этом процессе, позволяет идентифицировать альтернативные мишени для терапевтического вмешательства при нескольких заболеваниях, таких как рак, возрастные заболевания и хроническое воспаление. Анализ бесконтактных лигандов (PLA) появился как инструмент для оценки взаимодействия между белками, а также пространственной близости между органеллами или клеточными структурами и позволяет проводить анализ временной локализации и колокализации, например, в условиях стресса. Метод прост, потому что он похож на обычную иммунофлюоресценцию и позволяет одновременно окрашивать органеллу, клеточную структуру или специфический маркер, такой как митохондрии, эндоплазматический ретикулум, PML-тельца или двухцепочечный маркер ДНК, yH2AX. Фосфорилирование S139 в варианте гистона 2A, H2AX, тогда называемом yH2AX, широко используется в качестве очень чувствительного и специфичного маркера двухцепочечных разрывов ДНК. Каждый очаг окрашивания yH2AX соответствует одному разрыву в ДНК, который происходит через несколько минут после повреждения. Анализ изменений в очагах yH2AX является наиболее распространенным методом для изучения того, участвует ли интересующий белок в ответе на повреждение ДНК (DDR). Независимо от того, предполагается ли непосредственная роль в сайте повреждения ДНК, флуоресцентная микроскопия используется для проверки колокализации представляющего интерес белка с очагами yH2AX. Однако, за исключением новых методов флуоресценции со сверхвысоким разрешением, можно сделать вывод, что локальное взаимодействие с сайтами повреждения ДНК может быть немного субъективным. Здесь мы показываем анализ для оценки локализации белков в пути DDR с использованием yH2AX в качестве маркера места повреждения. Этот анализ может быть использован для характеристики временной локализации под различными повреждениями, вызывающими повреждение ДНК.

Введение

Повреждение клеточной ДНК происходит ежедневно из-за спонтанных химических реакций, а также усиливается экзогенными факторами, такими как генотоксические агенты (радиация и химические вещества, такие как этопозид) и окислительный стресс ^1,2,3. Клетки имеют сложный механизм, который корректирует множество различных типов повреждений ДНК, от удаления оснований до репликативного перекручивания вилки или прерывания до самого вредного поражения: двухцепочечного разрыва ДНК ^4,5.

протокол

1. Покрытие ячеек

ПРИМЕЧАНИЕ: Клетки могут быть засеяны в микроскопические флуоресцентные слайды, камеры или планшеты. Использование небольших покровных стекол или планшетов 96/ 384 лунок рекомендуется для тестирования нескольких условий и запасных реагентов. Использование покровных колпачков рекомендуется для клеточных линий, которые легко отделяются, таких как клетки HEK293. Покровные стекла могут быть предварительно покрыты раствором поли-L-лизина для улучшения крепления.

1. Пластинчатые клетки с учетом транспортного средства, технического контроля и биологического контроля. Испол....

Результаты

Мы наблюдали взаимодействие Nek4-Ku70 в отсутствие обработки этопозидом. Однако это взаимодействие может происходить за пределами ядра (рис. 1А). Взаимодействие Nek4-Ku70 усиливается после повреждения ДНК и концентрируется в ядре (рис. 1А). В слу.......

Обсуждение

Данные показывают, что использование PLA одновременно с маркером, поврежденным ДНК, может предоставить наибольшую информацию в профилировании ответа на повреждение ДНК, показывая пространственное и временное поведение взаимодействия после повреждения. PLA является у?.......

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Black 384-well plates	Perkin Elmer Cell carrier plates
Donkey  anti- Rabbit Alexa Fluor 488	Invitrogen	A21206	1:300
Duo link Donkey anti Mouse Minus	Sigma	DUO92004
Duolink antibody diluent	Sigma	DUO82008
Duolink blocking solution 1X	Sigma	DUO82007
Duolink Detection reagent Far red	Sigma	DUO92013
Duolink Donkey anti goat plus	Sigma	DUO92003
Duolink Donkey anti rabbit plus	Sigma	DUO92002
Etoposide	Sigma	E1383
Goat anti Nek4	Santa Cruz Biotechnology	SC-5517	goat anti Nek4 was used at 1:50 dilution
Hoechst 33342	Thermo	H1399	0.6 µg/mL
Leica DMI microscope	Leica
Mouse anti Ku70	Thermo	MA5-13110	mouse anti Ku70 was used at 1:100 dilution
Mouse anti TOPIIβ	Santa Cruz Biotechnology	SC-365071	1:25
Rabbit anti Nek5	Santa Cruz Biotechnology	SC-84527	1:25
Rabbit anti Y H2AX	Cell Signalling	9718S	1:100 dilution
U2OS cell line	ATCC	HTB-96