Saggio del ligando di prossimità per localizzare le proteine nei siti di danno al DNA

Riepilogo

Qui, presentiamo un protocollo semplice e rapido per il rilevamento dell'interazione proteica nei siti di danno al DNA.

Abstract

La risposta al danno al DNA è una salvaguardia dell'informazione genetica che protegge le cellule dal perpetuare il DNA danneggiato. La caratterizzazione delle proteine che cooperano in questo processo consente l'identificazione di bersagli alternativi per l'intervento terapeutico in diverse malattie, come il cancro, le malattie legate all'invecchiamento e l'infiammazione cronica. Il Proximity Ligand Assay (PLA) è emerso come strumento per stimare l'interazione tra proteine e la prossimità spaziale tra organelli o strutture cellulari e consente la localizzazione temporale e l'analisi della co-localizzazione in condizioni di stress, ad esempio. Il metodo è semplice perché è simile all'immunofluorescenza convenzionale e consente la colorazione simultanea di un organello, di una struttura cellulare o di un marcatore specifico come i mitocondri, il reticolo endoplasmatico, i corpi PML o il marcatore a doppio filamento del DNA, yH2AX. La fosforilazione di S139 nella variante dell'istone 2A, H2AX, allora indicata come yH2AX, è ampiamente utilizzata come marcatore molto sensibile e specifico delle rotture del doppio filamento di DNA. Ogni punto focale della colorazione yH2AX corrisponde a una rottura del DNA che si verifica pochi minuti dopo il danno. L'analisi dei cambiamenti nei focolai di yH2AX è il test più comune per studiare se la proteina di interesse è implicata nella risposta al danno del DNA (DDR). Indipendentemente dal fatto che si preveda un ruolo diretto nel sito di danno al DNA, la microscopia a fluorescenza viene utilizzata per verificare la colocalizzazione della proteina di interesse con i focolai yH2AX. Tuttavia, ad eccezione dei nuovi metodi di fluorescenza a super-risoluzione, per concludere, l'interazione locale con i siti di danno al DNA può essere un po' soggettiva. Qui, mostriamo un saggio per valutare la localizzazione delle proteine nella via DDR utilizzando yH2AX come marcatore del sito di danno. Questo test può essere utilizzato per caratterizzare la localizzazione temporale sotto diversi insulti che causano danni al DNA.

Introduzione

Il danno al DNA cellulare si verifica quotidianamente a causa delle reazioni chimiche spontanee ed è anche aumentato da fattori esogeni come agenti genotossici (radiazioni e sostanze chimiche come l'etoposide) e stress ossidativo ^1,2,3. Le cellule hanno un complesso macchinario che corregge una miriade di diversi tipi di danno al DNA, dalla rimozione delle basi alla torsione replicativa della forcella o all'interruzione fino alla lesione più deleteria: la rottura del doppio filamento del DNA ^4,5

Protocollo

1. Placcatura delle celle

NOTA: Le cellule possono essere seminate in vetrini microscopici a fluorescenza, camere o piastre. Si consiglia l'uso di piccoli vetrini coprioggetti o piastre da 96/384 pozzetti per testare più condizioni e reagenti di ricambio. L'uso di vetrini coprioggetti è consigliabile per linee cellulari che si staccano facilmente, come le cellule HEK293. I vetrini coprioggetti possono essere precedentemente rivestiti con una soluzione di poli-L-lisina per migliorare l'attaccamento.

1. Cellule a piastra considerando un veicolo, controlli tecnici e controlli biologici.....

Discussione

I dati mostrano che l'uso del PLA in concomitanza con un marcatore danneggiato dal DNA può fornire la maggior parte delle informazioni in un profilo di risposta al danno del DNA, mostrando il comportamento spaziale e temporale dell'interazione dopo l'insulto. Il PLA è un metodo versatile che è stato utilizzato per l'identificazione della dimerizzazione, la determinazione del contatto degli organelli, l'interazione proteina-acido nucleico e principalmente l'inte.......

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Black 384-well plates	Perkin Elmer Cell carrier plates
Donkey  anti- Rabbit Alexa Fluor 488	Invitrogen	A21206	1:300
Duo link Donkey anti Mouse Minus	Sigma	DUO92004
Duolink antibody diluent	Sigma	DUO82008
Duolink blocking solution 1X	Sigma	DUO82007
Duolink Detection reagent Far red	Sigma	DUO92013
Duolink Donkey anti goat plus	Sigma	DUO92003
Duolink Donkey anti rabbit plus	Sigma	DUO92002
Etoposide	Sigma	E1383
Goat anti Nek4	Santa Cruz Biotechnology	SC-5517	goat anti Nek4 was used at 1:50 dilution
Hoechst 33342	Thermo	H1399	0.6 µg/mL
Leica DMI microscope	Leica
Mouse anti Ku70	Thermo	MA5-13110	mouse anti Ku70 was used at 1:100 dilution
Mouse anti TOPIIβ	Santa Cruz Biotechnology	SC-365071	1:25
Rabbit anti Nek5	Santa Cruz Biotechnology	SC-84527	1:25
Rabbit anti Y H2AX	Cell Signalling	9718S	1:100 dilution
U2OS cell line	ATCC	HTB-96