Saggio del ligando di prossimità per localizzare le proteine nei siti di danno al DNA

Riepilogo

Qui, presentiamo un protocollo semplice e rapido per il rilevamento dell'interazione proteica nei siti di danno al DNA.

Abstract

La risposta al danno al DNA è una salvaguardia dell'informazione genetica che protegge le cellule dal perpetuare il DNA danneggiato. La caratterizzazione delle proteine che cooperano in questo processo consente l'identificazione di bersagli alternativi per l'intervento terapeutico in diverse malattie, come il cancro, le malattie legate all'invecchiamento e l'infiammazione cronica. Il Proximity Ligand Assay (PLA) è emerso come strumento per stimare l'interazione tra proteine e la prossimità spaziale tra organelli o strutture cellulari e consente la localizzazione temporale e l'analisi della co-localizzazione in condizioni di stress, ad esempio. Il metodo è semplice perché è simile all'immunofluorescenza convenzionale e consente la colorazione simultanea di un organello, di una struttura cellulare o di un marcatore specifico come i mitocondri, il reticolo endoplasmatico, i corpi PML o il marcatore a doppio filamento del DNA, yH2AX. La fosforilazione di S139 nella variante dell'istone 2A, H2AX, allora indicata come yH2AX, è ampiamente utilizzata come marcatore molto sensibile e specifico delle rotture del doppio filamento di DNA. Ogni punto focale della colorazione yH2AX corrisponde a una rottura del DNA che si verifica pochi minuti dopo il danno. L'analisi dei cambiamenti nei focolai di yH2AX è il test più comune per studiare se la proteina di interesse è implicata nella risposta al danno del DNA (DDR). Indipendentemente dal fatto che si preveda un ruolo diretto nel sito di danno al DNA, la microscopia a fluorescenza viene utilizzata per verificare la colocalizzazione della proteina di interesse con i focolai yH2AX. Tuttavia, ad eccezione dei nuovi metodi di fluorescenza a super-risoluzione, per concludere, l'interazione locale con i siti di danno al DNA può essere un po' soggettiva. Qui, mostriamo un saggio per valutare la localizzazione delle proteine nella via DDR utilizzando yH2AX come marcatore del sito di danno. Questo test può essere utilizzato per caratterizzare la localizzazione temporale sotto diversi insulti che causano danni al DNA.

Introduzione

Il danno al DNA cellulare si verifica quotidianamente a causa delle reazioni chimiche spontanee ed è anche aumentato da fattori esogeni come agenti genotossici (radiazioni e sostanze chimiche come l'etoposide) e stress ossidativo ^1,2,3. Le cellule hanno un complesso macchinario che corregge una miriade di diversi tipi di danno al DNA, dalla rimozione delle basi alla torsione replicativa della forcella o all'interruzione fino alla lesione più deleteria: la rottura del doppio filamento del DNA ^4,5.

Diverse proteine che partecipano alla DDR sono già state caratterizzate, ed eccellenti revisioni esplorano le vie dell'unione terminale non omologa (NHEJ) e della ricombinazione omologa (HR), le principali vie implicate nella riparazione delle rotture a doppio filamento (DSB) ^5,6. La fosforilazione della variante dell'istone H2A, H2AX, alla serina 139 (da allora in poi denominata y-H2AX) è stata utilizzata per molti anni come marcatore sensibile e affidabile della rottura del doppio filamento. La fosforilazione di H2AX si osserva nei primi minuti successivi al danno e può persistere per^{ore 7}.

Il vantaggio dell'utilizzo della rilevazione in immunofluorescenza dei focolai di γ-H2AX è la caratterizzazione della distribuzione temporale e spaziale dei focolai, nonché la sua co-colorazione con altre proteine. Inoltre, l'immunofluorescenza non richiede la lisi, il che preserva le informazioni sul contesto cellulare e le rende più informative. Inoltre, poiché γ-H2AX si forma de novo, non è abbondantemente presente in assenza di danno al DNA, il che lo rende un marcatore specifico⁷.

L'H2AX è per lo più fosforilato dalla proteina chinasi atassia-telangiectasia mutata (ATM) e dalla proteina chinasi DNA-dipendente (DNA-PK), i sensori dei DSB. Ku70/80 (XRCC6 X-ray repair cross-complementing 6/ XRCC5 X-ray repair cross-complementing 5) e la subunità catalitica DNA-proteina chinasi (DNA-PKcs) sono responsabili dell'identificazione dei DSB e della protezione delle estremità del DNA, mentre Artemis esegue il processamento finale per facilitare la legatura da parte del complesso XRCC4-Ligasi IV. La fosforilazione di H2AX nei siti che fiancheggiano i DSB agisce come segnale per il reclutamento di diverse proteine di riparazione e per l'arresto, la morte o la sopravvivenza del ciclo cellulare⁸.

L'analisi dei cambiamenti nei focolai di y-H2AX è il test più comune per studiare se la proteina di interesse è implicata nella risposta al danno del DNA. Indipendentemente dal fatto che si preveda un ruolo diretto nel sito di danno al DNA, la microscopia a fluorescenza viene utilizzata per verificare la co-localizzazione della proteina di interesse con i focolai di y-H2AX. Tuttavia, ad eccezione dei nuovi metodi di fluorescenza a super-risoluzione, concludere l'interazione locale con i siti di danno al DNA può essere difficile. Inoltre, la rilevazione in immunofluorescenza di solito dipende da molte molecole proteiche nel sito di danno al DNA, rendendo difficile l'identificazione di proteine scarse⁹.

Qui, mostriamo un saggio per valutare la localizzazione delle proteine coinvolte nella via DDR utilizzando y-H2AX come marcatore del sito di danno. Questo test può essere utilizzato per caratterizzare la localizzazione temporale sotto diversi insulti che causano danni al DNA.

Il Proximity Ligand Assay (PLA) è emerso come strumento per stimare l'interazione tra proteine e la prossimità spaziale tra organelli o strutture cellulari^10,11 e consente la localizzazione temporale e l'analisi della co-localizzazione in condizioni di stress, ad esempio. Il metodo è semplice perché è simile all'immunofluorescenza convenzionale e consente la colorazione simultanea di organelli o marcatori specifici della struttura cellulare, come i mitocondri, il reticolo endoplasmatico, i corpi PML o il marcatore a doppio filamento del DNA, yH2AX. L'uso del PLA consente l'identificazione dell'interazione proteica durante il danno al DNA in modo sensibile, specifico e affidabile che può essere utilizzato per monitorare l'interazione durante il ciclo cellulare, in risposta a diversi stimoli e in momenti diversi dopo stress genotossico.

Mostriamo qui l'uso del PLA in concomitanza con l'immunofluorescenza convenzionale γ-H2AX per localizzare l'interazione Nek4-Ku70 dopo un danno al DNA indotto da etoposide. Nek4, un membro della famiglia Nek (chinasi correlate al NIMA), non ha un ruolo chiaro nella risposta al danno al DNA. Nel 2012, Nguyen e colleghi hanno dimostrato che Nek4 interagisce con le proteine Ku70/Ku80 e, in assenza di Nek4, queste proteine non vengono reclutate nel sito di danno al DNA e la fosforilazione di H2AX è compromessa¹². La localizzazione cellulare di questa interazione è finora sconosciuta. Abbiamo osservato una riduzione della fosforilazione di Ku70 nelle cellule che esprimono il mutante morto Nek4 chinasi¹³, ma resta da chiarire se Nek4 fosforila direttamente Ku70. Considerando che l'interazione di Nek4 con Ku70 è aumentata dopo il trattamento con etoposide secondo gli studi di immunoprecipitazione¹², tentiamo di localizzare questa interazione utilizzando PLA e il marcatore γ-H2AX.

Di solito, gli studi di interazione si basano su saggi di immunoprecipitazione, ma questi sono in vitro e non forniscono informazioni sulla posizione dell'interazione. Quando possibile, può essere eseguita un'immunoprecipitazione di cellule frazionate (nucleo, mitocondriale, membrana cellulare o citosol), ma eseguire un andamento temporale dell'interazione è costoso e laborioso. L'immunofluorescenza può fornire informazioni sulla localizzazione cellulare delle proteine, ma dimostrare l'interazione può essere difficile e dipende dalla risoluzione dei microscopi. Qui, mostriamo il vantaggio dell'utilizzo del Proximity Ligand Assay per monitorare l'interazione di due proteine in un contesto di danno al DNA.

Protocollo

1. Placcatura delle celle

NOTA: Le cellule possono essere seminate in vetrini microscopici a fluorescenza, camere o piastre. Si consiglia l'uso di piccoli vetrini coprioggetti o piastre da 96/384 pozzetti per testare più condizioni e reagenti di ricambio. L'uso di vetrini coprioggetti è consigliabile per linee cellulari che si staccano facilmente, come le cellule HEK293. I vetrini coprioggetti possono essere precedentemente rivestiti con una soluzione di poli-L-lisina per migliorare l'attaccamento.

1. Cellule a piastra considerando un veicolo, controlli tecnici e controlli biologici. Utilizzare repliche tecniche in due o tre pozzi per condizione.
   NOTA: L'uso del controllo tecnico (sia secondario che primario) è obbligatorio. Se possibile, dovrebbe essere incluso anche il controllo biologico (ad esempio, la sovraespressione o il knockdown di una delle proteine bersaglio o una condizione nota per modificare l'interazione).
   1. Coltura di cellule U2OS nel Modified Eagle Medium (DMEM) di Dulbecco integrati con il 10% di siero fetale bovino (FBS), 4,5 g/L di glucosio e 4 mM di L-glutammina su piastre trattate con coltura tissutale a 37 °C in CO₂ al 5% e in un'atmosfera umidificata contenente il 90% di aria. A seconda del numero di condizioni da testare e se si utilizza un 384 o vetrini coprioggetti con una piastra da 60 mm, iniziare rispettivamente da una piastra da 60 o 100 mm.
   2. Quando le cellule raggiungono la confluenza del 60%-70%, dividere le cellule utilizzando tripsina-EDTA ¹⁴ allo 0,25%. Contare le celle utilizzando una camera Neubauer o un contatore automatico¹⁴. Piastra 4 x 10⁵ celle in una piastra da 60 mm contenente vetrini coprioggetti rotondi multipli da 13 mm o 4 x 10 celle^{da 5} pozzetti per pozzetto in una o più piastre da 384 pozzetti e incubare per 12 - 24 ore a 37 °C in un incubatore umidificato al 5% di CO₂ .

2. Preparazione delle soluzioni

NOTA: La concentrazione e i tempi del trattamento sono stati scelti in base ai risultati della letteratura, che evidenziano l'attivazione delle vie di riparazione del danno al DNA^15,16.

1. Preparare la soluzione madre di Etoposide alla concentrazione di 50 mM in DMSO. La soluzione madre può essere conservata a -20 °C per diversi mesi. Diluire la soluzione di etoposide per l'uso nel terreno di coltura completo alla concentrazione finale di 25 μM. Utilizzare il DMSO diluito allo 0,05% nel terreno di coltura completo come controllo del veicolo.
2. Preparare 20x citrato di sodio salino (SSC; NaCl 3,0 M, citrato trisodico 0,30 M pH 7,0). Questa soluzione può essere conservata per diversi mesi a 4 °C.

3. Trattamento e fissazione cellulare

NOTA: Non lasciare che le celle si asciughino in nessun momento; Cerca di eliminare il più possibile le soluzioni precedenti. Il metodo appropriato per la fissazione cellulare (metanolo ghiacciato o paraformaldeide al 4% (PFA)) deve essere determinato in precedenza, così come la diluizione degli anticorpi, utilizzando un esperimento di immunofluorescenza convenzionale.

ATTENZIONE: Il metanolo deve essere smaltito correttamente.

1. Rimuovere il terreno di coltura dai pozzetti e aggiungere un terreno di coltura contenente etoposide o DMSO rispettivamente a 25 μM o 0,05%. Incubare le cellule a 37 °C in CO₂ al 5% e in un'atmosfera umidificata contenente il 90% di aria con etoposide o DMSO per 3 diversi periodi di tempo: 20 min, 1 h e 3 h. Quando si utilizzano 384 piastre, tutte le condizioni devono essere risolte contemporaneamente.
   1. Per questo, inizia trattando la condizione con il tempo di trattamento più lungo, ad esempio 3 ore. Dopo 2 ore, trattare la condizione di trattamento di 1 ora e, quando rimangono 20 minuti per la fissazione, trattare la condizione di 20 minuti. In seguito, tutte le condizioni possono essere risolte contemporaneamente.
2. Rimuovere il terreno dai pozzetti e lavare le celle con PBS 3x.
3. Fissare le celle aggiungendo metanolo ghiacciato con un volume sufficiente a coprire la superficie del pozzetto. Incubare per 10 minuti a -20 °C. Lavare i pozzetti con PBS 3x.
   NOTA: A questo punto, il protocollo può essere messo in pausa. Le piastre possono essere conservate a 4 °C per 1 settimana.

4. Permeabilizzazione e blocco

NOTA: Se si utilizza il metodo di fissazione con PFA, è necessario eseguire una fase di blocco con glicina prima della permeabilizzazione. La camera di umidità può essere preparata inserendo una vaschetta dell'acqua all'interno dell'incubatrice, ottenendo un'umidità di circa il 95%. La piastra o i vetrini 384 possono essere incubati in un contenitore di plastica chiuso sopra la carta da filtro o la spugna inumidita e la pellicola trasparente.

1. Estrarre il PBS dai campioni.
2. Aggiungere 30-40 μl di tampone di permeabilizzazione (0,2% Triton X-100 in PBS) e incubare per 20 minuti a temperatura ambiente. Lavare 3 volte con PBS
3. Prelevare il PBS dai campioni e aggiungere 30-40 μL di soluzione bloccante 1x fornita nel kit PLA (in alternativa, è possibile utilizzare il 3% di albumina sierica bovina e Triton X-100 0,1% in soluzione PBS) a ciascun pozzetto/vetrino coprioggetti.
4. Incubare la piastra in una camera di umidità preriscaldata a 37 °C per 1 ora.

5. Incubazione degli anticorpi primari (PLA)

NOTA: Se si utilizzano vetrini coprioggetti, è importante assicurarsi che la soluzione anticorpale copra tutte le superfici dei vetrini. Particolare attenzione deve essere prestata alla selezione degli anticorpi. Gli anticorpi devono provenire da specie animali diverse e l'anticorpo secondario utilizzato per γ-H2AX non deve essere contro la specie ospite della produzione delle sonde PLA. Ad esempio, gli anticorpi primari utilizzati per il PLA sono stati allevati in topi e caprini. Le sonde PLA, anti-topo e anti-capra sono state prodotte nell'asino. L'anticorpo contro γ-H2AX è stato prodotto nei conigli e il secondario utilizzato è l'anti-coniglio prodotto negli asini. In questo modo, il secondario non riconoscerà le sonde PLA.

1. Diluire gli anticorpi primari (il topo anti-Ku70 1:100 e il capra anti-Nek4 1:50; coniglio anti-Nek5 1:25 e topino anti-TOPIIβ 1:25) nel diluente anticorpale fornito nel kit (in alternativa, può essere utilizzato il 3% di albumina sierica bovina e Triton X-100 0,1% in soluzione PBS). Preparare 30 μl di soluzione anticorpale per condizione se si utilizzano vetrini coprioggetti o 20 μl per pozzetto se si utilizza una piastra da 384 pozzetti.
2. Tocca la soluzione di blocco. Aggiungere la soluzione di anticorpi primari a ciascun pozzetto. Incubare a 4 °C per una notte in una camera di umidità.

6. Incubazione della sonda PLA

NOTA: Scegliere le sonde, tenendo in considerazione non solo gli anticorpi primari ma anche quelli destinati all'uso nelle fasi di immunofluorescenza. Quando si utilizzano piastre a 384 pozzetti per un'incubazione lunga a 37 °C, è possibile utilizzare la rotazione lenta per migliorare la distribuzione della soluzione anticorpale.

1. Diluire le sonde meno e più 1:5 nel diluente anticorpale. Preparare 10 μl per pozzetto se si utilizzano piastre da 384 pozzetti o 20 μl per campione se si utilizzano vetrini coprioggetti. Utilizza le seguenti combinazioni: Asino anti-topo meno con Asino anti-capra plus; Asino anti-topo meno con Asino anti-coniglio plus.
2. Spillare la soluzione di anticorpi primari. Lavare 1 volta con TBS-T (50 mM Tris pH 7,5, 150 mM NaCl, 0,05% di Tween-20). Lavare 3 volte per 5 minuti ciascuna con TBS-T a temperatura ambiente. Eseguire un ulteriore lavaggio con TBS-T.
3. Picchiettare e aggiungere la soluzione della sonda PLA con 10 μl per le piastre e 20 μl per i vetrini. Incubare nella camera di umidità preriscaldata a 37 °C per 1 ora.

7. Legatura

NOTA: Attendere l'aggiunta della ligasi fino a immediatamente prima di aggiungerla ai campioni. La ligasi deve essere conservata in un blocco congelatore (-20 °C). Rimuovere completamente tutta la soluzione di lavaggio prima di aggiungere la soluzione di ligasi. Evitare di lasciare le cellule senza soluzione per lunghi periodi di tempo. Quando si utilizzano piastre a 384 pozzetti per l'incubazione a 37 °C, è possibile utilizzare la rotazione lenta per migliorare la distribuzione della soluzione anticorpale.

1. Diluire il tampone di legatura 5x in acqua ad alta purezza. Preparare 10 μl per pozzetto se si utilizzano piastre da 384 pozzetti o 20 μl se si utilizzano vetrini coprioggetti.
2. Toccare la soluzione della sonda PLA. Lavare 1 volta con TBS-T. Seguire con altri tre lavaggi, ciascuno della durata di 5 minuti, utilizzando TBS-T. Lavare un'ultima volta e picchiettare il TBS-T prima del passaggio successivo.
3. Aggiungere Ligasi alla soluzione di legatura 1x a 1:40, immediatamente prima di applicarla ai campioni. Incubare nella camera di umidità preriscaldata a 37 °C per 30 minuti - 1 ora.

8. Amplificazione e lavaggio

NOTA: Attendere l'aggiunta della polimerasi fino a immediatamente prima dell'aggiunta al campione. Il buffer di amplificazione è sensibile alla luce; Proteggere dalla luce tutte le soluzioni contenenti il tampone. La polimerasi deve essere conservata in un blocco congelatore (-20 °C). Evitare di lasciare le cellule senza soluzione per un lungo periodo di tempo. Quando si utilizzano piastre a 384 pozzetti per l'incubazione a 37 °C, una rotazione lenta può migliorare la distribuzione della soluzione anticorpale.

1. Rimuovere completamente tutta la soluzione di lavaggio prima di aggiungere la soluzione di polimerasi. Evitare di lasciare le cellule senza soluzione per un lungo periodo di tempo. Diluire il tampone di amplificazione 5x in acqua ad alta purezza. Preparare 10 μl per pozzetto se si utilizzano piastre da 384 pozzetti o 20 μl se si utilizzano vetrini coprioggetti.
2. Staccare la soluzione di legatura. Lavare 1 volta con TBS-T. Seguire con altri tre lavaggi, ciascuno della durata di 5 minuti, utilizzando TBS-T. Lavare un'ultima volta e picchiettare il TBS-T prima del passaggio successivo.
3. Aggiungere la polimerasi alla soluzione di amplificazione 1x a diluizione 1:80, immediatamente prima di applicarla ai campioni. Incubare nella camera di umidità preriscaldata a 37 °C per 100 min.
   NOTA: Da questo passaggio in poi, evitare l'esposizione diretta alla luce
4. Togliete il buffer di amplificazione. Lavare 2 volte con 1 tampone SSC per 10 minuti ciascuno. Lavare 2 volte con tampone SSC 0,01 x per 2 minuti ciascuno.

9. Colorazione γ-H2AX (Immunofluorescenza - IF)

NOTA: L'etichettatura di γ-H2AX viene eseguita al termine del PLA.

1. Incubazione degli anticorpi primari (IF)
   1. Diluire gli anticorpi primari (Rabbit anti yH2AX a 1:100) in soluzione bloccante (in alternativa, può essere utilizzato il 3% di albumina sierica bovina e Triton X-100 0,1% in soluzione PBS). Preparare 30 μl di soluzione anticorpale per pozzetto se si utilizzano vetrini coprioggetti o 20 μl se si utilizza una piastra da 384 pozzetti.
   2. Togliete la soluzione SSC 0,01x. Lavare 2 volte con PBS.
   3. Aggiungere la soluzione di anticorpi primari a ciascun pozzetto. Incubare a temperatura ambiente per 1 ora.
2. Incubazione secondaria degli anticorpi (IF)
   NOTA: Assicurarsi che gli anticorpi secondari scelti non riconoscano gli anticorpi o le sonde PLA. Inoltre, la lunghezza d'onda dell'anticorpo secondario deve essere diversa dalla lunghezza d'onda del reagente di rilevamento del PLA. Ad esempio: il nostro reagente per la rilevazione del PLA contiene il fluoroforo 647 e il secondario che abbiamo utilizzato per la rilevazione γ-H2AX è il 488.
   1. Diluire gli anticorpi secondari (Donkey anti-Rabbit Alexa Fluor 488) in soluzione bloccante (in alternativa, si può utilizzare il 3% di albumina sierica bovina e Triton X - 100 0,1% in soluzione PBS) alla diluizione 1:300. Preparare 30 μl di soluzione anticorpale per condizione se si utilizzano vetrini coprioggetti o 20 μl per pozzetto se si utilizza una piastra da 384 pozzetti. Aggiungere il colorante Hoechst 33342 alla concentrazione finale di 0,6 μg/mL.
   2. Spillare la soluzione di anticorpi primari. Lavare 3 volte con TBS-T.
   3. Aggiungere la soluzione di anticorpi secondari a ciascun pozzetto. Incubare a temperatura ambiente per 20 min.
   4. Lavare 5 volte con TBS-T. Lavare 2 volte con 1 tampone SSC. Lavare 2 volte con tampone SSC 0,01x.
      NOTA: A questo punto, le lastre possono essere conservate per diverse settimane a 4 °C (in SSC 0,01X) al riparo dalla luce. Se si utilizzano vetrini coprioggetti, i vetrini possono essere montati e, dopo 1 giorno, i vetrini possono essere conservati a -20 °C.

10. Acquisizione delle immagini

1. Utilizzare un microscopio a fluorescenza convenzionale e l'obiettivo 63x. Determina il tempo di esposizione confrontando i controlli negativi e positivi per evitare la saturazione e il collasso dei punti.
   NOTA: L'uso di microscopi confocali migliora il rilevamento dei punti PLA. L'obiettivo 20x può essere utilizzato anche per aumentare il numero di nuclei rilevati.
2. Una volta regolato il tempo di esposizione, eseguire tutte le acquisizioni di punti PLA con gli stessi parametri. Cercate di acquisire immagini da diversi pozzetti o regioni di vetrini per evitare artefatti dovuti a un'incubazione non omogenea.
3. Salva tutti i canali con lo stesso modello di nome. Se il microscopio scatta foto nei canali separatamente, salvare le immagini corrispondenti con lo stesso nome, aggiungendo solo PLA o Nucleus all'inizio del nome del file per differenziare il canale.

11. Analisi delle immagini

NOTA: È stata creata una macro per l'analisi dei punti per nucleo nell'immagine J/FIJI¹⁷ e da utilizzare con i microscopi in cui le informazioni sulla scala devono essere aggiunte manualmente. La dimensione dei pixel per la lente dell'obiettivo utilizzata deve essere nota. Posizionare le immagini per ciascun canale in cartelle diverse (File di codifica supplementare 1, Figura supplementare 1).
NOTA: La macro considera i canali di fluorescenza ottenuti separatamente. In questo caso, è importante salvare tutte le immagini con lo stesso nome.

1. La macro consente la selezione di una regione specifica nel campo. Utilizzare l'opzione Seleziona un ROI quando una regione dell'immagine mostra artefatti che possono essere dannosi per l'analisi. Scegli ROI all'inizio dell'analisi e usalo per tutte le immagini.
   NOTA: Questa è una funzione opzionale. Se non è selezionata, l'intera immagine verrà considerata nell'analisi (Figura 2 supplementare).
2. Il file ROI deve essere creato prima dell'utilizzo della macro, come descritto di seguito. Per la selezione del ROI, utilizzare uno strumento rettangolo, selezionare la regione per l'analisi e aggiungerla al gestore ROI facendo clic su Modifica > selezione> Aggiungi al gestore. Salva il ROI facendo clic su Altro> Salva.
3. In ImageJ ¹⁷, aprire le immagini di diverse condizioni per regolare i parametri per l'analisi. Questi parametri devono essere determinati dall'utente e specificati, insieme ai dati, nel programma macro (File di codifica supplementare 1)
   1. Correzione dello sfondo: per rimuovere lo sfondo, fai clic su Elabora> Sottrai sfondo. Testare diversi raggi della sfera rotante utilizzando la funzione di anteprima). Abbiamo usato il rotolamento 10 per i punti PLA e il rotolamento 100 per il nucleo.
   2. Per rimuovere il rumore, fare clic su Elabora > Disturbo > Elimina puntini. Per il nucleo, utilizzare la funzione leviga per migliorare il riempimento del nucleo facendo clic su Elabora>Leviga.
   3. Regolazione della soglia: consente di convertire un'immagine a 8 bit e di regolare la soglia facendo clic su Tipo di > immagine > 8 bit e Regola > immagine >Soglia. Regola la soglia di conseguenza per visualizzare tutti i nuclei o i punti presenti nell'immagine, ma evitando la saturazione eccessiva e il collasso delle strutture. Prendi nota dei valori e verifica in immagini diverse per verificare se la soglia funziona per immagini diverse.
   4. Converti in maschera facendo clic su Elabora > binario > Converti in maschera. Nel caso del nucleo, fare clic su Elabora > binaria > Riempi buchi , quindi su Elabora > binario > spartiacque. Nel caso dei punti PLA, fare clic su Elabora > binario > spartiacque.
   5. Per contare i nuclei, misurare l'area o la lunghezza dei diversi nuclei per stimare la dimensione media. Utilizzare un valore approssimativo per analizzare le particelle. Fare clic su Analizza > Analizza particelle, quindi selezionare Imposta dimensione: 15-infinito (questi valori dipendono dalla dimensione dei nuclei). Seleziona le seguenti opzioni: Mostra: Maschera; Visualizza i risultati; Risultati chiari; Riassumere; Aggiungi al Manager; Escludi sui bordi.
   6. Per contare i punti PLA, misurare l'area o il raggio dei punti per stimare la dimensione media. Seleziona Applica maschera nucleo (applica maschera è una funzione del plug-in GDSC, controlla se è installato) seguito da Analizza > analizza particelle e imposta. 0,02-3 (questi valori dipendono dalle dimensioni dei nuclei). Seleziona le seguenti opzioni: Mostra: Maschera; Visualizza i risultati; Risultati chiari; Riassumere; Aggiungi al Manager; Escludi sui bordi.
4. I risultati mostrano il numero di punti per nucleo in ciascun nucleo presente nell'immagine. Salva questi dati.

12. Visualizzazione delle immagini unite

1. Aprire i canali corrispondenti a PLA, nucleo e γ-H2AX. Sottrai lo sfondo e rimuovi il rumore, come indicato nei passaggi 11.4.1 e 11.4.2 per tutte le immagini.
2. Regola la luminosità e il contrasto automaticamente o manualmente utilizzando lo stesso valore per tutte le condizioni dallo stesso canale. Selezionare Immagine > Regola > Luminosità/contrasto.
3. Combina le immagini (unione) selezionando Immagine > Colore > Unisci canali. Aggiungere la barra della scala selezionando Analizza > Strumenti > Barra della scala. Salva con nome. file TIFF.

Risultati

Abbiamo osservato l'interazione Nek4-Ku70 in assenza di trattamento con etoposide. Tuttavia, questa interazione può avvenire al di fuori del nucleo (Figura 1A). L'interazione Nek4-Ku70 aumenta dopo il danno al DNA e si concentra nel nucleo (Figura 1A). Nel caso dell'interazione Nek5-Topoisomerasi II β (TOPIIβ), utilizzata in questo test come controllo positivo sulla base dei risultati della letteratura¹⁸

Discussione

I dati mostrano che l'uso del PLA in concomitanza con un marcatore danneggiato dal DNA può fornire la maggior parte delle informazioni in un profilo di risposta al danno del DNA, mostrando il comportamento spaziale e temporale dell'interazione dopo l'insulto. Il PLA è un metodo versatile che è stato utilizzato per l'identificazione della dimerizzazione, la determinazione del contatto degli organelli, l'interazione proteina-acido nucleico e principalmente l'inte...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Black 384-well plates	Perkin Elmer Cell carrier plates
Donkey  anti- Rabbit Alexa Fluor 488	Invitrogen	A21206	1:300
Duo link Donkey anti Mouse Minus	Sigma	DUO92004
Duolink antibody diluent	Sigma	DUO82008
Duolink blocking solution 1X	Sigma	DUO82007
Duolink Detection reagent Far red	Sigma	DUO92013
Duolink Donkey anti goat plus	Sigma	DUO92003
Duolink Donkey anti rabbit plus	Sigma	DUO92002
Etoposide	Sigma	E1383
Goat anti Nek4	Santa Cruz Biotechnology	SC-5517	goat anti Nek4 was used at 1:50 dilution
Hoechst 33342	Thermo	H1399	0.6 µg/mL
Leica DMI microscope	Leica
Mouse anti Ku70	Thermo	MA5-13110	mouse anti Ku70 was used at 1:100 dilution
Mouse anti TOPIIβ	Santa Cruz Biotechnology	SC-365071	1:25
Rabbit anti Nek5	Santa Cruz Biotechnology	SC-84527	1:25
Rabbit anti Y H2AX	Cell Signalling	9718S	1:100 dilution
U2OS cell line	ATCC	HTB-96