تجارب الاسترخاء NMR 15N للتحقيق في الديناميكيات الهيكلية للبروتينات بيكو ثانية إلى نانو ثانية

Summary

يمكن أن يميز التحليل الطيفي بالرنين المغناطيسي النووي (NMR) ديناميكيات البروتين الهيكلية بطريقة خاصة بالبقايا. نحن نقدم بروتوكولا عمليا لتسجيل استرخاء الرنين المغناطيسي ^{النووي 15}و N R₁ و R₂ و {¹H}-¹⁵N تجارب تأثير Overhauser غير المتجانسة (hetNOE) ، الحساسة للمقياس الزمني للبيكو ثانية إلى النانو ثانية.

Abstract

يسمح التحليل الطيفي بالرنين المغناطيسي النووي (NMR) بدراسة البروتينات في المحلول وتحت درجات الحرارة الفسيولوجية. في كثير من الأحيان ، يتم استخدام مجموعات الأميد من العمود الفقري للبروتين أو مجموعات الميثيل في السلاسل الجانبية كمراسلين للديناميكيات الهيكلية في البروتينات. عادة ما تعمل دراسة الديناميكيات الهيكلية للعمود الفقري للبروتين للبروتينات الكروية على ^{عينات 15}نيوتن مصنفة وبروتونية بالكامل بشكل جيد للبروتينات التي يصل وزنها الجزيئي إلى 50 كيلو دالتون. عند تطبيق التحليل الطيفي المحسن للاسترخاء العرضي (TROSY) ، يمكن تمديد هذا الحد حتى 200 كيلو دالتون للبروتينات الكروية وما يصل إلى 1 MDa عندما يكون التركيز على السلاسل الجانبية. عندما يتم فحص البروتينات المضطربة جوهريا (IDPs) أو البروتينات ذات المناطق المضطربة جوهريا (IDRs) ، فإن قيود الوزن هذه لا تنطبق ولكن يمكن أن تتجاوز ذلك بكثير. والسبب هو أن النازحين داخليا أو IDRs، الذين يتميزان بالمرونة الداخلية العالية، غالبا ما يتم فصلهم ديناميكيا. تقدم طرق الرنين المغناطيسي النووي المختلفة رؤى ذات دقة ذرية لديناميكيات البروتين الهيكلية عبر مجموعة واسعة من المقاييس الزمنية ، من بيكو ثانية إلى ساعات. نظرة عامة على قياسات الاسترخاء ^{القياسية 15}N المرونة الداخلية للبروتين وتميز ديناميكيات العمود الفقري للبروتين التي يتم اختبارها على المقياس الزمني السريع من بيكو إلى نانو ثانية. تقدم هذه المقالة بروتوكولا عمليا لإعداد وتسجيل تجارب الرنين المغناطيسي ^{النووي 15}N R₁ و R₂ وتأثير Overhauser غير المتجانس (hetNOE). نعرض بيانات نموذجية ونشرح كيفية تفسيرها ببساطة نوعيا قبل أي تحليل أكثر تعقيدا.

Introduction

لا يتم تحديد وظيفة البروتين من خلال هيكله ثلاثي الأبعاد فحسب ، بل أيضا من خلال ديناميكياته الهيكلية ، بما في ذلك مرونته الداخلية والتحولات الهيكلية بين المطابقات المختلفة التي سيتبناها البروتين. يمكن للتحليل الطيفي بالرنين المغناطيسي النووي (NMR) التحقيق في الديناميكيات الهيكلية للبروتينات في المحلول^1،2،3. تسمح التطورات الحديثة في الرنين المغناطيسي النووي للحالة الصلبة المكتشفة بالبروتون أيضا بتوصيف ديناميكيات البروتين في حالة أقل قابلية للذوبان ، مثل ، على سبيل المثال ، غشاء ثنائي الطبقة دهني^4،

Protocol

1. تحضير عينة الرنين المغناطيسي النووي

ملاحظة: يتم إجراء وضع العلامات على النظائر للبروتينات لتجارب الرنين المغناطيسي النووي ذات الأبعاد الأعلى والرنين المغناطيسي النووي المتقدمة. عندما يتم إنشاء تعبير البروتين في الإشريكية القولونية وتنقية البروتين باستخدام الوسائط الغنية (على سبيل المثال ، Luria-Bertani [LB] أو 2x مستخلص الخميرة وسط التربتون [2YT]) بعائد عدة ملليغرام لكل لتر ، فإن تحضير عينة الرنين المغناطيسي النووي النظيرية عادة ما يكون بسيطا نسبيا.

1. لوضع العلامات على النظائر ، استخدم وسائط M9 الدنيا للتعبير الجيني ، حيث يكون كلوريد الأمونيوم ¹⁵نيوتن هو المصد....

النتائج

يوضح ما يلي بعض بيانات استرخاء الرنين المغناطيسي النووي النموذجية المسجلة على بروتين SNARE الحويصلي Synaptobrevin-2 (1-96) ، والذي يطلق عليه غالبا VAMP2 (البروتين المرتبط بالحويصلة 2). لتسجيل بيانات الرنين المغناطيسي النووي ، استخدمنا عينة 171 ميكرومتر ¹⁵نيوتن Synaptobrevin-2 (1-96) (يطلق عل.......

Discussion

وصف هذا البروتوكول إعداد تجارب الاسترخاء NMR ¹⁵N بواسطة Lakomek et ^al.69 و Stief et ^al.70. ركزنا على تسلسل نبضات الرنين المغناطيسي النووي باستخدام مخطط الكشف عن HSQC المعزز بالحساسية. يتم تنفيذ تجارب ¹⁵N R₁ و R_1ρ كما هو موضح بالتفصيل بواسطة Stief.......

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Bruker 600 MHz AVANCE III HD spectrometer	Bruker	https://www.bruker.com/en/products-and-solutions/mr/nmr/avance-nmr-spectrometer.html	NMR experiments conducted