Experimentos de relaxamento de RMN 15N para a investigação da dinâmica estrutural de proteínas de picossegundos a nanossegundos

Resumo

A espectroscopia de ressonância magnética nuclear (RMN) pode caracterizar a dinâmica estrutural da proteína de maneira específica do resíduo. Fornecemos um protocolo prático para registrar experimentos de relaxamento de RMN ¹⁵N R₁ e R₂ e {¹H}-¹⁵N heteronuclear Overhauser effect (hetNOE), sensíveis à escala de tempo de picossegundos a nanossegundos.

Resumo

A espectroscopia de ressonância magnética nuclear (RMN) permite estudar proteínas em solução e sob temperaturas fisiológicas. Freqüentemente, os grupos amida da estrutura da proteína ou os grupos metil nas cadeias laterais são usados como repórteres da dinâmica estrutural em proteínas. Um estudo de dinâmica estrutural da estrutura proteica de proteínas globulares em amostras marcadas com ¹⁵N e totalmente protonadas geralmente funciona bem para proteínas com peso molecular de até 50 kDa. Quando a deuteração de cadeia lateral em combinação com espectroscopia otimizada de relaxamento transversal (TROSY) é aplicada, esse limite pode ser estendido até 200 kDa para proteínas globulares e até 1 MDa quando o foco está nas cadeias laterais. Quando proteínas intrinsecamente desordenadas (IDPs) ou proteínas com regiões intrinsecamente desordenadas (IDRs) são investigadas, essas limitações de peso não se aplicam, mas podem ir muito além. A razão é que os IDPs ou IDRs, caracterizados por alta flexibilidade interna, são frequentemente desacoplados dinamicamente. Vários métodos de RMN oferecem insights de resolução atômica sobre a dinâmica estrutural das proteínas em uma ampla gama de escalas de tempo, de picossegundos a horas. As medições de relaxamento padrão de ¹⁵N apresentam uma visão geral da flexibilidade interna de uma proteína e caracterizam a dinâmica da estrutura da proteína experimentada na escala de tempo rápida de pico a nanossegundo. Este artigo apresenta um protocolo prático para configurar e registrar experimentos de RMN ¹⁵NR₁, R₂ e efeito Overhauser heteronuclear (hetNOE). Mostramos dados exemplares e explicamos como interpretá-los de forma simples qualitativa antes de qualquer análise mais sofisticada.

Introdução

A função de uma proteína é determinada não apenas por sua estrutura tridimensional, mas também por sua dinâmica estrutural, englobando sua flexibilidade interna e transições estruturais entre diferentes conformações que a proteína adotará. A espectroscopia de ressonância magnética nuclear (RMN) pode investigar a dinâmica estrutural de proteínas em solução ^1,2,3. Desenvolvimentos recentes na RMN de estado sólido detectada por prótons também permitem a caracterização da dinâmica de proteínas em um estado menos solúvel, como, por exemplo, uma me....

Protocolo

1. Preparação da amostra de RMN

NOTA: A marcação isotópica das proteínas é realizada para experimentos de RMN de dimensão superior e RMN avançada. Quando a expressão de proteínas em E. coli e a purificação de proteínas foram estabelecidas usando meios ricos (por exemplo, Luria-Bertani [LB] ou meio triptona de extrato de levedura 2x [2YT]) com um rendimento de vários miligramas por litro, a preparação de uma amostra de RMN marcada isotopicamente é geralmente relativamente simples.

1. Para marcação de isótopos, use meio mínimo M9 para expressão gênica, onde cloreto de amônio <....

Discussão

Este protocolo descreveu a configuração de experimentos de relaxamento de RMN ¹⁵N por Lakomek et ^al.69 e Stief et ^al.70. Nós nos concentramos nas sequências de pulso de RMN usando um esquema de detecção HSQC aprimorado por sensibilidade. Os experimentos ¹⁵N R₁ e R_1ρ são implementados conforme descrito em detalhes por Stief et al.70, e o experimento hetNOE é descrito por Lakomek et

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Bruker 600 MHz AVANCE III HD spectrometer	Bruker	https://www.bruker.com/en/products-and-solutions/mr/nmr/avance-nmr-spectrometer.html	NMR experiments conducted