NMR 15N 弛豫实验，用于研究蛋白质皮秒至纳秒的结构动力学

摘要

核磁共振 （NMR） 波谱可以以残基特异性方式表征结构蛋白质动力学。我们提供了一个动手实验方案，用于记录 NMR ¹⁵N R₁ 和 R₂ 弛豫和 {¹H}-¹⁵N 异核 Overhauser 效应 （hetNOE） 实验，对皮秒到纳秒的时间尺度敏感。

摘要

核磁共振 （NMR） 波谱允许在溶液和生理温度下研究蛋白质。通常，蛋白质骨架的酰胺基团或侧链中的甲基被用作蛋白质结构动力学的报告基因。在 ¹⁵N 标记和完全质子化的样品上对球状蛋白质骨架的结构动力学研究通常适用于分子量高达 50 kDa 的蛋白质。当侧链氘与横向弛豫优化光谱 （TROSY） 相结合时，球状蛋白质的极限可以扩展到 200 kDa，当重点放在侧链上时，该极限可以扩展到 1 MDa。当研究固有无序蛋白 （IDP） 或具有固有无序区 （IDR） 的蛋白质时，这些重量限制不适用，但可能远远超出范围。原因是 IDP 或 IDR 具有高度内部灵活性的特点，经常是动态解耦的。各种 NMR 方法提供了对蛋白质结构动力学的原子分辨率见解，范围很广，从皮秒到几小时。标准的 ¹⁵N 弛豫测量概述了蛋白质的内部柔韧性，并表征了在快速皮秒到纳秒时间尺度上经历的蛋白质骨架动力学。本文介绍了一种用于设置和记录 NMR ¹⁵NR₁、R₂ 和异核 Overhauser 效应 （hetNOE） 实验的动手实验方案。我们展示了示例性数据，并解释了如何在任何更复杂的分析之前简单地定性地解释它们。

引言

蛋白质的功能不仅取决于其三维结构，还取决于其结构动力学，包括其内部灵活性和蛋白质将采用的不同构象之间的结构转变。核磁共振 （NMR） 波谱可以研究溶液 ^1,2,3 中蛋白质的结构动力学。质子检测固体 NMR 的最新发展还允许表征难溶状态下的蛋白质动力学，例如脂质双层膜 ^4,5,6。在溶液 NMR 中，可以研究蛋白质骨架和蛋白质侧链的结构动力学。对于球状蛋白质，一旦蛋白质被 ¹⁵N 同位素标记，就可以实现高达 50 kDa 的蛋白质骨架的结构动力学研究。当采用侧链氘化和横向弛豫优化光谱 （TROSY） 时，该极限可以扩展到 200 kDa ^7,8。当重点在于侧链动力学时，可接近的蛋白质和复合物的范围可以扩展到 1 MDa ^2,9。

研究方案

1. NMR 样品制备

注：蛋白质的同位素标记用于高维 NMR 和高级 NMR 实验。当使用富培养基（例如，Luria-Bertani [LB] 或 2x 酵母提取物胰蛋白胨培养基 [2YT]）以每升几毫克的产量建立大 肠杆菌 中的蛋白质表达和蛋白质纯化时，制备同位素标记的 NMR 样品通常相对简单。

1. 对于同位素标记，使用 M9 最低培养基进行基因表达，其中 ¹⁵N 氯化铵是唯一的氮源， ¹³N 富集 C 的葡萄糖是唯一的碳源。
2. 对于蛋白质纯化，请遵循实验室中为相应蛋白质制定的标准方案。
   注：结果部分显示了 IDP（单体 SNARE 蛋白 Synaptobrevin-2 （1-96））的代表性结果。Synaptobrevin-2 的 NMR 同位素标记已按照⁷⁰ 中的描述进行。对于非常高精度的测量，建议使用低于 5% 的低 D₂O 浓度。这是因为氘同位素效应，可以在 Hahn-Echo ¹⁵N T₂ 和低频 ¹⁵N CPMG 弛豫色散实验（此处不讨论）中观察到，但在 ¹⁵N R_1ρ 实验（主要....

讨论

该协议描述了 Lakomek 等人 ⁶⁹ 和 Stief 等人 ⁷⁰ 的 NMR ¹⁵N 弛豫实验的设置。我们专注于使用灵敏度增强的 HSQC 检测方案的 NMR 脉冲序列。¹⁵N R₁ 和 R_1ρ 实验按照 Stief 等人 ⁷⁰ 的详细描述实现，hetNOE 实验由 Lakomek 等人 ⁶⁹ 描述。

在设置 NMR 弛豫实验时，

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Bruker 600 MHz AVANCE III HD spectrometer	Bruker	https://www.bruker.com/en/products-and-solutions/mr/nmr/avance-nmr-spectrometer.html	NMR experiments conducted