タンパク質のピコ秒からナノ秒の構造ダイナミクスを調べるためのNMR 15N緩和実験

要約

核磁気共鳴(NMR)分光法は、構造タンパク質のダイナミクスを残留物特異的な方法で特徴付けることができます。私たちは、ピコ秒からナノ秒の時間スケールに敏感なNMR ¹⁵N R₁ およびR₂ 緩和、および{¹H}-¹⁵Nヘテロ核オーバーハウザー効果(hetNOE)実験を記録するための実践的なプロトコルを提供します。

要約

核磁気共鳴(NMR)分光法により、溶液中および生理学的温度下でタンパク質を研究できます。多くの場合、タンパク質骨格のアミド基または側鎖のメチル基のいずれかが、タンパク質の構造ダイナミクスのレポーターとして使用されます。 ¹⁵N標識および完全プロトン化サンプル上の球状タンパク質のタンパク質骨格の構造動力学研究は、通常、分子量が最大50 kDaのタンパク質に対して良好に機能します。横方向緩和最適化分光法(TROSY)と組み合わせた側鎖重水素化を適用すると、球状タンパク質では最大200 kDaまで、側鎖に焦点が当てられている場合は最大1 MDaまでこの制限を延長できます。天然変性タンパク質(IDP)または天然変性領域(IDR)を持つタンパク質を調査する場合、これらの重量制限は適用されませんが、それをはるかに超える可能性があります。その理由は、内部の柔軟性が高いという特徴を持つ IDP または IDR は、頻繁に動的に分離されるためです。さまざまなNMR法により、ピコ秒から数時間までの幅広い時間スケールで構造タンパク質のダイナミクスを原子分解能で把握することができます。標準的な ^15Nリラクゼーション測定は、タンパク質の内部柔軟性を概観し、ピコ秒からナノ秒の高速タイムスケールで経験するタンパク質骨格のダイナミクスを特徴付けます。この記事では、NMR ¹⁵N R₁、R₂、およびヘテロ核オーバーハウザー効果(hetNOE)実験をセットアップおよび記録するための実践的なプロトコルを紹介します。私たちは、より高度な分析の前に、例示的なデータを示し、それらを単純に定性的に解釈する方法を説明します。

概要

タンパク質の機能は、その三次元構造だけでなく、タンパク質が採用する異なるコンフォメーション間の内部柔軟性と構造遷移を含む構造ダイナミクスによっても決定されます。核磁気共鳴(NMR)分光法は、溶液^1,2,3中のタンパク質の構造ダイナミクスを調べることができます。プロトン検出固体NMRの最近の開発により、例えば脂質二重膜^4,5,6のような難溶性状態でのタンパク質ダイナミクスの特性評価も可能になりました。溶液NMRでは、タンパク質骨格とタンパク質側鎖の構造動態を調べることができます。球状タンパク質の場合、タンパク質が¹⁵N同位体標識されると、タンパク質骨格の構造ダイナミクス研究を最大50 kDaで達成できます。側鎖重水素化および横緩和最適化分光法(TROSY)を使用する場合、この制限は最大200 kDaまで拡張できます^7,8。側鎖ダイナミクスに焦点が当てられると、....

プロトコル

1. NMRサンプル調製

注:タンパク質の同位体標識は、高次元NMRおよび高度なNMR実験のために行われます。 大腸菌 でのタンパク質発現およびタンパク質精製が、リッチ培地(Luria-Bertani [LB]や2x 酵母抽出物トリプトン培地[2YT]など)を用いて数ミリグラム/リットルの収量で確立されていた場合、同位体標識NMRサンプルの調製は通常比較的簡単です。

1. 同位体標識には、 ¹⁵N塩化アンモニウムが唯一の窒素源であり、 ¹³Cが高濃度グルコースが唯一の炭素源である遺伝子発現にM9最小培地を使用します。
2. タンパク質の精製には、それぞれのタンパク質について実験室で確立された標準プロトコルに従ってください。
   注:結果セクションは、IDP、単量体SNAREタンパク質Synaptobrevin-2(1-96)の代表的な結果を示しています。シナプトブレビン-2のNMR同位体標識は、⁷⁰に記載されているように行われてきた。非常に高精度な測定を行うには、低濃度のD₂O(5%未満)を使用することをお勧めします。これは重水素同位体効果によるもので、これはHahn-Echo ¹⁵N T

ディスカッション

このプロトコルは、Lakomekら⁶⁹およびStiefら⁷⁰によるNMR ¹⁵N緩和実験のセットアップについて説明しました。私たちは、感度を高めたHSQC検出スキームを用いたNMRパルス配列に着目しました。¹⁵N R₁およびR_1ρ実験は、Stief et al.70によって詳細に記述されているように実施されており、hetNOE?.......

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Bruker 600 MHz AVANCE III HD spectrometer	Bruker	https://www.bruker.com/en/products-and-solutions/mr/nmr/avance-nmr-spectrometer.html	NMR experiments conducted