Esperimenti di rilassamento NMR 15N per lo studio della dinamica strutturale delle proteine da picosecondi a nanosecondi

Riepilogo

La spettroscopia di risonanza magnetica nucleare (NMR) è in grado di caratterizzare la dinamica strutturale delle proteine in modo specifico per i residui. Forniamo un protocollo pratico per la registrazione di esperimenti di rilassamento NMR ¹⁵N R₁ e R₂ e {¹H}-¹⁵N heteronuclear Overhauser effect (hetNOE), sensibili alla scala temporale da picosecondi a nanosecondi.

Abstract

La spettroscopia di risonanza magnetica nucleare (NMR) consente di studiare le proteine in soluzione e a temperature fisiologiche. Frequentemente, i gruppi ammidici della spina dorsale proteica o i gruppi metilici nelle catene laterali sono utilizzati come reporter della dinamica strutturale nelle proteine. Uno studio di dinamica strutturale della spina dorsale proteica di proteine globulari su campioni marcati con ¹⁵N e completamente protonati di solito funziona bene per proteine con un peso molecolare fino a 50 kDa. Quando viene applicata la deuterazione a catena laterale in combinazione con la spettroscopia ottimizzata a rilassamento trasverso (TROSY), questo limite può essere esteso fino a 200 kDa per le proteine globulari e fino a 1 MDa quando l'attenzione è rivolta alle catene laterali. Quando si studiano le proteine intrinsecamente disordinate (IDP) o le proteine con regioni intrinsecamente disordinate (IDR), queste limitazioni di peso non si applicano, ma possono andare ben oltre. Il motivo è che gli IDP o IDR, caratterizzati da un'elevata flessibilità interna, sono spesso disaccoppiati dinamicamente. Vari metodi NMR offrono informazioni sulla risoluzione atomica della dinamica strutturale delle proteine in un'ampia gamma di scale temporali, dai picosecondi fino alle ore. Le misure standard di rilassamento ^{a 15}N analizzano la flessibilità interna di una proteina e caratterizzano la dinamica della spina dorsale proteica sperimentata su una scala temporale da pico a nanosecondi. Questo articolo presenta un protocollo pratico per l'impostazione e la registrazione di esperimenti NMR ¹⁵N R₁, R₂ e heteronuclear Overhauser effect (hetNOE). Mostriamo dati esemplari e spieghiamo come interpretarli in modo semplice qualitativo prima di qualsiasi analisi più sofisticata.

Introduzione

La funzione di una proteina è determinata non solo dalla sua struttura tridimensionale, ma anche dalla sua dinamica strutturale, che comprende la sua flessibilità interna e le transizioni strutturali tra le diverse conformazioni che la proteina adotterà. La spettroscopia di risonanza magnetica nucleare (NMR) può studiare la dinamica strutturale delle proteine in soluzione ^1,2,3. I recenti sviluppi nella NMR allo stato solido rilevata con protoni consentono anche la caratterizzazione della dinamica delle proteine in uno stato meno solubile, co....

Protocollo

1. Preparazione del campione NMR

NOTA: La marcatura isotopica delle proteine viene eseguita per esperimenti NMR di dimensione superiore e NMR avanzati. Quando l'espressione proteica in E. coli e la purificazione delle proteine sono state stabilite utilizzando terreni ricchi (ad esempio, Luria-Bertani [LB] o 2x estratto di lievito triptone [2YT]) con una resa di diversi milligrammi per litro, la preparazione di un campione NMR marcato isotopicamente è di solito relativamente semplice.

1. Per la marcatura degli isotopi, utilizzare terreni minimi M9 per l'espressione genica, do....

Discussione

Questo protocollo descriveva l'impostazione degli esperimenti di rilassamento NMR ¹⁵N di Lakomek et ^al.69 e Stief et ^al.70. Ci siamo concentrati sulle sequenze di impulsi NMR utilizzando uno schema di rilevamento HSQC con sensibilità migliorata. Gli esperimenti ¹⁵N R₁ e R_1ρ sono implementati come descritto in dettaglio da Stief et al.70, e l'esperimento hetNOE è descritto da Lakomek et

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Bruker 600 MHz AVANCE III HD spectrometer	Bruker	https://www.bruker.com/en/products-and-solutions/mr/nmr/avance-nmr-spectrometer.html	NMR experiments conducted