Expériences de relaxation RMN 15N pour l’étude de la dynamique structurelle des protéines de la picoseconde à la nanoseconde

Résumé

La spectroscopie par résonance magnétique nucléaire (RMN) peut caractériser la dynamique des protéines structurelles d’une manière spécifique aux résidus. Nous fournissons un protocole pratique pour l’enregistrement d’expériences de relaxation RMN ¹⁵N R₁ et R₂ et d’expériences à effet Overhauser hétéronucléaire {¹H}-¹⁵N, sensibles à l’échelle de temps de la picoseconde à la nanoseconde.

Résumé

La spectroscopie par résonance magnétique nucléaire (RMN) permet d’étudier les protéines en solution et à des températures physiologiques. Fréquemment, les groupes amides du squelette protéique ou les groupes méthyle dans les chaînes latérales sont utilisés comme rapporteurs de la dynamique structurelle des protéines. Une étude de la dynamique structurale du squelette protéique des protéines globulaires sur des échantillons marqués ¹⁵N et entièrement protonés fonctionne généralement bien pour les protéines d’un poids moléculaire allant jusqu’à 50 kDa. Lorsque la deutération de la chaîne latérale en combinaison avec la spectroscopie optimisée de relaxation transverse (TROSY) est appliquée, cette limite peut être étendue jusqu’à 200 kDa pour les protéines globulaires et jusqu’à 1 MDa lorsque l’accent est mis sur les chaînes latérales. Lorsque des protéines intrinsèquement désordonnées (IDP) ou des protéines avec des régions intrinsèquement désordonnées (IDR) sont étudiées, ces limitations de poids ne s’appliquent pas mais peuvent aller bien au-delà. La raison en est que les PDI ou IDR, caractérisés par une grande flexibilité interne, sont souvent découplés dynamiquement. Diverses méthodes de RMN offrent des informations à résolution atomique sur la dynamique des protéines structurelles sur une large gamme d’échelles de temps, de la picoseconde à l’heure. Les mesures de relaxation standard ¹⁵N permettent d’obtenir un aperçu de la flexibilité interne d’une protéine et de caractériser la dynamique du squelette protéique sur une échelle de temps rapide de l’ordre de la pico à la nanoseconde. Cet article présente un protocole pratique pour la mise en place et l’enregistrement d’expériences de RMN ¹⁵N R₁, R₂ et d’effets Overhauser hétéronucléaires (hetNOE). Nous présentons des données exemplaires et expliquons comment les interpréter simplement qualitativement avant toute analyse plus sophistiquée.

Introduction

La fonction d’une protéine est déterminée non seulement par sa structure tridimensionnelle, mais aussi par sa dynamique structurelle, englobant sa flexibilité interne et les transitions structurelles entre les différentes conformations que la protéine adoptera. La spectroscopie par résonance magnétique nucléaire (RMN) permet d’étudier la dynamique structurale des protéines dans la solution ^1,2,3. Les développements récents de la RMN à l’état solide détectée par des protons permettent également de caractériser la dynamique des protéines dans u....

Protocole

1. Préparation des échantillons RMN

REMARQUE : Le marquage isotopique des protéines est effectué pour les expériences de RMN de dimension supérieure et de RMN avancées. Lorsque l’expression des protéines chez E. coli et la purification des protéines ont été établies à l’aide de milieux riches (par exemple, Luria-Bertani [LB] ou milieu tryptone d’extrait de levure 2x [2YT]) avec un rendement de plusieurs milligrammes par litre, la préparation d’un échantillon RMN marqué isotopiquement est généralement relativement simple.

1. Pour le marquage isotopique, utilisez un milieu min....

Discussion

Ce protocole décrit la mise en place d’expériences de relaxation RMN ¹⁵N par Lakomek et ^al.69 et Stief et ^al.70. Nous nous sommes concentrés sur les séquences d’impulsions RMN à l’aide d’un schéma de détection HSQC à sensibilité améliorée. Les ^{expériences 15}N R₁ et R_1ρ sont mises en œuvre comme décrit en détail par Stief et al.70, et l’expérience hetNOE est décrite par .......

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Bruker 600 MHz AVANCE III HD spectrometer	Bruker	https://www.bruker.com/en/products-and-solutions/mr/nmr/avance-nmr-spectrometer.html	NMR experiments conducted