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단백질의 피코초에서 나노초까지의 구조 역학 조사를 위한 NMR 15N 이완 실험
요약
핵 자기 공명(NMR) 분광법은 잔류물 특이적 방식으로 구조적 단백질 역학을 특성화할 수 있습니다. 당사는 피코초에서 나노초의 시간 척도에 민감한 NMR 15NR1 및 R2 이완 및 {1H}-15N 이종 핵 오버하우저 효과(hetNOE) 실험을 기록하기 위한 실습 프로토콜을 제공합니다.
초록
핵 자기 공명(NMR) 분광법을 사용하면 용액 내 단백질과 생리학적 온도에서 단백질을 연구할 수 있습니다. 종종, 단백질 골격의 아미드 그룹 또는 곁사슬의 메틸 그룹은 단백질의 구조 역학을 보고하는 데 사용됩니다. 15N표지 및 완전 양성자 화된 샘플에서 구상 단백질의 단백질 골격에 대한 구조 역학 연구는 일반적으로 분자량이 최대 50kDa인 단백질에 대해 잘 작동합니다. TROSY(Transverse Relaxation Optimized Spectroscopy)와 함께 곁사슬 중수소화가 적용되면 이 한계는 구상 단백질의 경우 최대 200kDa, 곁사슬에 초점이 맞춰진 경우 최대 1MDa까지 확장될 수 있습니다. 내재적 장애 단백질(IDP) 또는 내재적 무질서 영역(IDR)을 가진 단백질을 조사할 때 이러한 중량 제한은 적용되지 않지만 그 이상일 수 있습니다. 그 이유는 높은 내부 유연성을 특징으로 하는 IDP 또는 IDR이 동적으로 분리되는 경우가 많기 때문입니다. 다양한 NMR 분석법은 피코초에서 최대 시간에 이르는 광범위한 시간 척도에 걸쳐 구조 단백질 역학에 대한 원자 분해능 통찰력을 제공합니다. 표준 15N 이완 측정은 단백질의 내부 유연성을 개관하고 빠른 피코에서 나노초까지의 시간 척도에서 경험하는 단백질 골격 역학을 특성화합니다. 이 기사에서는 NMR 15NR1, R2 및 hetNOE(Heteronuclear Overhauser effect) 실험을 설정하고 기록하기 위한 실습 프로토콜을 제시합니다. 우리는 예시적인 데이터를 보여주고 보다 정교한 분석을 하기 전에 이를 간단하게 정성적으로 해석하는 방법을 설명합니다.
서문
단백질의 기능은 3차원 구조뿐만 아니라 내부 유연성과 단백질이 채택할 다양한 형태 간의 구조적 전이를 포함하는 구조적 역학에 의해서도 결정됩니다. 핵 자기 공명(NMR) 분광법은 용액 1,2,3에서 단백질의 구조 역학을 조사할 수 있습니다. 양성자 검출 고체 상태 NMR의 최근 개발은 예를 들어 지질 이중층 멤브레인 4,5,6과 같은 덜 용해성 상태의 단백질 역학의 특성 분석을 허용합니다. 용액 NMR에서는 단백질 골격 및 단백질 곁사슬의 구조 역학을 연구할 수 있습니다. 구상 단백질의 경우, 단백질이 15N동위원소로 표지되면 단백질 골격의 구조 역학 연구를 최대 50kDa까지 달성할 수 있습니다. 측쇄 중수소 및 횡방향 이완 최적화 분광법(TROSY)을 사용하는 경우 이 한계는 최대 200kDa 7,8
프로토콜
1. NMR 시료 전처리
참고: 단백질의 동위원소 라벨링은 고차원 NMR 및 고급 NMR 실험을 위해 수행됩니다. 대장균 의 단백질 발현 및 단백질 정제가 리치 배지(예: Luria-Bertani[LB] 또는 2x 효모 추출물 트립톤 배지[2YT])를 사용하여 리터당 수 밀리그램의 수율로 확립된 경우, 동위원소 표지된 NMR 샘플을 준비하는 것은 일반적으로 비교적 간단합니다.
- 동위원소 라벨링의 경우 유전자 발현을 위해 M9 최소 배지를 사용하며, 여기서 15N염화암모늄이 유일한 질소 공급원이고 13C농축 포도당이 유일한 탄소원입니다.
- 단백질 정제의 경우 각 단백질에 대해 실험실에서 수립된 표준 프로토콜을 따르십시오.
참고: 결과 섹션에는 IDP, 단량체 SNARE 단백질 Synaptobrevin-2(1-96)에 대한 대표적인 결과가 나와 있습니다. Synaptobrevin-2의 NMR 동위원소 표지는70에 기재된 바와 같이 수행되었다. 매우 고정밀 측정의 경우 5% 미만의 낮은 D2O 농도를 사용....
대표적 결과
다음은 종종 VAMP2(소포 관련 단백질 2)라고 불리는 소포성 SNARE 단백질 Synaptobrevin-2(1-96)에 기록된 몇 가지 예시적인 NMR 이완 데이터를 보여줍니다. NMR 데이터를 기록하기 위해 150mM NaCl, 0.1mM TCEP 및 1mM EDTA를 포함하는 50mM MES(pH 6.0) 완충액에 171μM 15NSynaptobrevin-2(1-96) 샘플(다음에서는 Syb-2라고 함)을 사용했습니다. 모든 실험 데이터는 3mm NMR 샘플 튜브에 채워진 250μL 부피.......
토론
이 프로토콜은 Lakomek et al.69 및 Stief et al.70에 의한 NMR 15N 이완 실험의 설정을 설명했습니다. 우리는 감도가 향상된 HSQC 검출 체계를 사용하여 NMR 펄스 시퀀스에 중점을 두었습니다. 15NR1 및R1ρ 실험은 Stief et al.70에 의해 상세히 기술된 바와 같이 구현되고, hetNOE 실험은 Lakomek et
공개
저자들은 이 논문에 보고된 연구에 영향을 미칠 수 있는 경쟁적인 재정적 이해관계나 개인적 관계를 알지 못한다고 선언한다.
감사의 말
유익한 토론에 참여해 주신 Melinda Jaspert와 Kevin Bochinsky에게 감사드립니다. N.L.은 하이젠베르크 프로그램(DFG 보조금 번호 433700474)을 통해 자금을 지원해 준 독일 과학 재단에 감사를 표합니다. 이 연구는 헬름홀츠 협회의 이니셔티브 및 네트워킹 기금(Helmholtz Association's Initiative and Networking Fund)의 보조금인 "COVID-19 발병기전의 바이러스 및 면역학적 결정 요인 - 미래 팬데믹에 대비하기 위한 교훈(KA1-Co-02 "COVIPA") 프로젝트의 지원을 받고 있습니다. 우리는 Forschungszentrum Jülich와 Heinrich Heine University Düsseldorf (HHU)가 공동으로 운영하는 Jülich-Düsseldorf Biomolecular NMR Center에 대한 관대한 접근을 인정합니다.
....자료
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Bruker 600 MHz AVANCE III HD spectrometer | Bruker | https://www.bruker.com/en/products-and-solutions/mr/nmr/avance-nmr-spectrometer.html | NMR experiments conducted |
참고문헌
- Sekhar, A., Kay, L. E. An NMR view of protein dynamics in health and disease. Annu Rev Biophys. 48, 297-319 (2019).
- Rosenzweig, R., Kay, L. E. Bringing dynamic molecular machines into focus by methyl-TROSY NMR.
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