عزل قوي للميتوكوندريا عن أنسجة قلب القوارض

Summary

كشفت دراسات الطاقة الحيوية والتمثيل الغذائي على الميتوكوندريا عن دورها متعدد الأوجه في العديد من الأمراض ، لكن طرق عزل هذه العضيات تختلف. الطريقة المفصلة هنا قادرة على تنقية الميتوكوندريا عالية الجودة من مصادر أنسجة متعددة. يتم تحديد الجودة من خلال نسب التحكم في الجهاز التنفسي والمقاييس الأخرى التي يتم تقييمها باستخدام قياس إعادة الالتنفس عالي الدقة.

Abstract

يمارس عزل الميتوكوندريا منذ عقود ، باتباع الإجراءات التي وضعها الرواد في مجالات البيولوجيا الجزيئية والكيمياء الحيوية لدراسة ضعف التمثيل الغذائي والأمراض. جودة الميتوكوندريا المتسقة ضرورية للتحقيق بشكل صحيح في فسيولوجيا الميتوكوندريا والطاقة الحيوية. ومع ذلك ، تتوفر العديد من طرق العزل المنشورة المختلفة للباحثين. على الرغم من أن الاستراتيجيات التجريبية المختلفة تتطلب طرق عزل مختلفة ، إلا أن المبادئ والإجراءات الأساسية متشابهة. يوضح هذا البروتوكول بالتفصيل طريقة قادرة على استخراج الميتوكوندريا المقترنة جيدا من مجموعة متنوعة من مصادر الأنسجة ، بما في ذلك والخلايا الصغيرة. تشمل الخطوات الموضحة تشريح الأعضاء ، وتنقية الميتوكوندريا ، والقياس الكمي للبروتين ، وفحوصات مراقبة الجودة المختلفة. مقياس مراقبة الجودة الأساسي المستخدم لتحديد الميتوكوندريا عالية الجودة هو نسبة التحكم في الجهاز التنفسي (RCR). RCR هو نسبة معدل التنفس أثناء الفسفرة المؤكسدة إلى المعدل في حالة عدم وجود ADP. تتم مناقشة المقاييس البديلة. بينما يتم الحصول على قيم RCR عالية بالنسبة لمصدر الأنسجة باستخدام هذا البروتوكول ، يمكن تحسين عدة خطوات لتناسب الاحتياجات الفردية للباحثين. هذا الإجراء قوي وقد أدى باستمرار إلى عزل الميتوكوندريا مع قيم RCR أعلى من المتوسط عبر النماذج الحيوانية ومصادر الأنسجة.

Introduction

الميتوكوندريا هي عضيات تحت الخلوية تنشئ ظروفا نشطة سيتوبلازمية محسنة لوظائف خلوية معينة. في حين أن الدراسات الخلوية والأنسجة والكائن الحي يمكن أن توفر رؤى حول وظيفة الميتوكوندريا ، فإن عزل العضيات يوفر مستوى من التحكم التجريبي غير ممكن بخلاف ذلك. تم إجراء عزلات الميتوكوندريا منذ الأربعينيات ، مما يسمح بإجراء دراسات ميكانيكية لعملية التمثيل الغذائي والتنفس عبر مجموعة متنوعة من الخلايا والأنسجة^1،2. الأهمية التاريخية للميتوكوندريا موثقة جيدا³. بصفتها المنتجين الرئيسيين ل ATP ، تلعب الميتوكوندريا العديد من الأدوار الرئيسية الحيوية للوظيفة الخلوية والأعضاء ا....

Protocol

تم إجراء استخدام وعلاج جميع الفقارية وفقا للبروتوكولات المعتمدة التي تمت مراجعتها وقبولها من قبل اللجنة المؤسسية لرعاية واستخدامه (IACUC) في جامعة ولاية ميشيغان. تم تصميم هذا البروتوكول باستخدام كل من ذكور وإناث خنازير غينيا هارتلي ألبينو وفئران سبراج داولي (SD). لعزل الميتوكوندريا القلبية عن خنازير غينيا ، تم التضحية بالحيوانات في أعمار تتراوح بين 4-6 أسابيع (300-450 جم). تم الحصول على الميتوكوندريا القلبية من الفئران SD من كلا الجنسين بين سن 10-13 أسبوعا (250-400 جم). وصفات للمخازن المؤقتة موصوفة في الجدول 1 ويجب تحضيرها مسبقا. تفاصيل الكواشف والمعدات المستخدمة في هذه الدراسة مدرجة في جدول المواد.

النتائج

عند الانتهاء من عزل الميتوكوندريا ، يجب اختبار جودة ووظائف العزلات عن طريق تحديد معدلات استهلاك الأكسجين (J_O2) باستخدام قياس إعادة التسخين عالي الدقة. للقيام بذلك ، تم تخفيف مخزونات الميتوكوندريا إلى 40 مجم / مل للسماح بتركيزات العمل البالغة 0.1 مجم / مل في 2 مل من RB.......

Discussion

سيضمن الالتزام بالطرق الموضحة بإيجاز في هذا البروتوكول عزل الميتوكوندريا المقترنة جيدا عن أنسجة القلب للقوارض الصغيرة ، بالإضافة إلى أنواع ومصادر الأنسجة الأخرى. بشكل عام ، يجب أن تستغرق العملية ما مجموعه 3-3.5 ساعة ، حيث يجب أن تبقى جميع الأنسجة الحيوانية والعينات والعز.......

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
1.7 mL microcentrifuge tubes
10 mL glass beaker			For organ disection and mincing
50 mL centrifuge tubes			Centrifugation
Adenosine 5'-diphosphate monopotassium salt dihydrate	Sigma	A5285	Respirometry assays
BSA Protein Assay Kit	Thermo Scentific	PI23225	Mitochondrial protein quantification
Dextrose	Sigma	DX0145	For buffer (CB)
Ethylene glycol-bis(2-amino-ethylether)-N,N,N',N'-tetraacetic acid	Sigma	E4378	For buffers (CB and IB) and respirometry assays
Glass cannula	Radnoti		Guinea pig and rat heart perfusion
Heparin sodium porcine mucosa	Sigma	SRE0027-250KU	Animal IP injection
High-resolution respirometer			Clark-type electrode; oxygraph with 2 mL chambers
Induction chamber
Isoflurane	Sigma	792632	Anesthetic
L-malic acid	Sigma	02288-50G	Respirometry assays
Magnesium chloride hexahydrate	Sigma	M9272	For buffer (RB)
Mannitol	Sigma	MX0214	For buffer (IB)
Microliter syringes			Sizes ranging from 5–50 µL
Microplate reader			Must be able to incubate at 37 °C
MOPS	Sigma	475898	For all buffers
O2 tank
OMNI THQ Homogenizer	OMNI International	12-500	Similar rotor stator homogenizers will work
pipettes			Volumes of  2–20 µL; 20–200 µL; 200–1000 µL
Potassium chloride	Sigma	P3911	For buffers (RB and CB)
Potassium phosphate dibasic	Sigma	795496	For buffers (IB and RB)
Protease from Bacillus licheniformis	Sigma	P5459
Sodium chloride	Sigma	S9888	For buffer (CB)
Sodium pyruvate	Fisher bioreagents	BP356-100	Respirometry assays
Sucrose	Sigma	8510-OP	For buffer (IB)
Surgical dissection kit			Depends on animal and tissue source
Tabletop centrifuge			Must cool to 4 °C