عزل قوي للميتوكوندريا عن أنسجة قلب القوارض

Summary

كشفت دراسات الطاقة الحيوية والتمثيل الغذائي على الميتوكوندريا عن دورها متعدد الأوجه في العديد من الأمراض ، لكن طرق عزل هذه العضيات تختلف. الطريقة المفصلة هنا قادرة على تنقية الميتوكوندريا عالية الجودة من مصادر أنسجة متعددة. يتم تحديد الجودة من خلال نسب التحكم في الجهاز التنفسي والمقاييس الأخرى التي يتم تقييمها باستخدام قياس إعادة الالتنفس عالي الدقة.

Abstract

يمارس عزل الميتوكوندريا منذ عقود ، باتباع الإجراءات التي وضعها الرواد في مجالات البيولوجيا الجزيئية والكيمياء الحيوية لدراسة ضعف التمثيل الغذائي والأمراض. جودة الميتوكوندريا المتسقة ضرورية للتحقيق بشكل صحيح في فسيولوجيا الميتوكوندريا والطاقة الحيوية. ومع ذلك ، تتوفر العديد من طرق العزل المنشورة المختلفة للباحثين. على الرغم من أن الاستراتيجيات التجريبية المختلفة تتطلب طرق عزل مختلفة ، إلا أن المبادئ والإجراءات الأساسية متشابهة. يوضح هذا البروتوكول بالتفصيل طريقة قادرة على استخراج الميتوكوندريا المقترنة جيدا من مجموعة متنوعة من مصادر الأنسجة ، بما في ذلك والخلايا الصغيرة. تشمل الخطوات الموضحة تشريح الأعضاء ، وتنقية الميتوكوندريا ، والقياس الكمي للبروتين ، وفحوصات مراقبة الجودة المختلفة. مقياس مراقبة الجودة الأساسي المستخدم لتحديد الميتوكوندريا عالية الجودة هو نسبة التحكم في الجهاز التنفسي (RCR). RCR هو نسبة معدل التنفس أثناء الفسفرة المؤكسدة إلى المعدل في حالة عدم وجود ADP. تتم مناقشة المقاييس البديلة. بينما يتم الحصول على قيم RCR عالية بالنسبة لمصدر الأنسجة باستخدام هذا البروتوكول ، يمكن تحسين عدة خطوات لتناسب الاحتياجات الفردية للباحثين. هذا الإجراء قوي وقد أدى باستمرار إلى عزل الميتوكوندريا مع قيم RCR أعلى من المتوسط عبر النماذج الحيوانية ومصادر الأنسجة.

Introduction

الميتوكوندريا هي عضيات تحت الخلوية تنشئ ظروفا نشطة سيتوبلازمية محسنة لوظائف خلوية معينة. في حين أن الدراسات الخلوية والأنسجة والكائن الحي يمكن أن توفر رؤى حول وظيفة الميتوكوندريا ، فإن عزل العضيات يوفر مستوى من التحكم التجريبي غير ممكن بخلاف ذلك. تم إجراء عزلات الميتوكوندريا منذ الأربعينيات ، مما يسمح بإجراء دراسات ميكانيكية لعملية التمثيل الغذائي والتنفس عبر مجموعة متنوعة من الخلايا والأنسجة^1،2. الأهمية التاريخية للميتوكوندريا موثقة جيدا³. بصفتها المنتجين الرئيسيين ل ATP ، تلعب الميتوكوندريا العديد من الأدوار الرئيسية الحيوية للوظيفة الخلوية والأعضاء المثلى⁴. داخل مصفوفة الميتوكوندريا ، تتأكسد الركائز بواسطة دورة TCA ، مما ينتج عنه مكافئات مختزلة وناقلات إلكترونية متنقلة مثل NADH و UQH₂^5،6. السيتوكروم C هو ثالث ناقل إلكتروني متحرك رئيسي في شبكة التفاعل الكيميائي الحيوي للميتوكوندريا⁷. ثم تتأكسد هذه الجزيئات بواسطة مجمعات الغشاء لنظام نقل الإلكترون (ETS) المضمنة في غشاء الميتوكوندريا^{الداخلي 8}. تقترن تفاعلات الأكسدة والاختزال ل ETS بانتقال البروتون من المصفوفة إلى الفضاء بين الغشاء. تنشئ هذه العمليات تدرجا كهروكيميائيا للبروتون يستخدم لفسفرة ADP مع Pi بواسطة F₁F₀ ATP synthase لإنتاج ATP^9،10. يمكن استكشاف العمليات الفردية التي تحدث في كل مجمع من خلال قياس إعادة الوضوح عالي الدقة باستخدام أقطاب كهربائية من نوع كلارك أو فحوصات استهلاك الأكسجين الدقيقة^11،12. بالإضافة إلى ذلك ، يمكن لنماذج المرض والعلاجات التي تستخدم الميتوكوندريا المعزولة تحديد تأثير أو أهمية وظيفة الميتوكوندريا في تطور بعض الأمراض. وقد ثبت أن هذا مثمر في مجال أمراض القلب ، حيث تم استخدام التعديلات في توصيل الوقود والركيزة لتوضيح كيفية تأثير الخلل الوظيفي في الميتوكوندريا على قصور القلب^{13،14،15،16}. من المعروف أيضا أن الميتوكوندريا تؤثر على تطور حالات مرضية أخرى مثل مرض السكري والسرطان والسمنة والاضطرابات العصبية والاعتلالات العضلية^17،18. لذلك ، فإن استخدام الميتوكوندريا المعزولة أو المنقاة يتيح إجراء تحقيقات ميكانيكية لعملية التمثيل الغذائي التأكسدي وإنتاج ATP في أنسجة المصدر.

لا يوجد نقص في بروتوكولات عزل الميتوكوندريا نظرا لأهميتها في أبحاث الطاقة الحيوية. بالإضافة إلى ذلك ، يمكن العثور على طرق محددة للغاية مصممة خصيصا لمجموعات سكانية فرعية من الميتوكوندريا داخل^{الأنسجة والخلايا 19،20}. تتشابه الخطوات الإجرائية الأساسية بين طرق العزل ، ولكن يمكن إجراء اختلافات في التركيب المؤقت ، وخطوات التجانس ، ودورات الطرد المركزي لتحسين كمية وجودة الميتوكوندريا. تستند التغييرات في هذه الجوانب إلى الطلب الأيضي للأنسجة ، ووظيفة الجهاز الكلية ، وكثافة الميتوكوندريا ، وعوامل أخرى. في أنسجة مثل الكبد والعضلات الهيكلية ، تستخدم المجانسات المحمولة للحفاظ على سلامة الميتوكوندريا والحد من تلف أغشية الميتوكوندريا²¹. ومع ذلك ، عند العزل عن الكلى ، تقترح بعض البروتوكولات استخدام التجانس المدفوع يدويا أو مجموعات تجارية لتحقيق نتائج أفضل²². على الرغم من أن كلتا الطريقتين تسفر عن ميتوكوندريا وظيفية ، إلا أن جودة العضيات يمكن أن تتأثر بسبب الوقت الإضافي الذي يستغرقه إكمال عمليات العزل باستخدام هذه البروتوكولات. يعد الطرد المركزي أمرا حيويا أيضا لاستخراج بروتين الميتوكوندريا ، لأنه يفصل المكونات الخلوية مثل النوى والعضيات الأخرى عن الميتوكوندريا²³. أثناء عملية العزل ، يناقش ما إذا كان ينبغي تنفيذ الطرد المركزي التفاضلي أو القائم على الكثافة للحصول على عزلات أنقى²⁴. في حين أن الطرد المركزي الكثافة يمكن أن يفصل الميتوكوندريا عن العضيات ذات الثقل النوعي المماثل ، مثل البيروكسيسومات ، فليس من الثابت ما إذا كانت الميتوكوندريا من هذه الطرق تمثل وظيفة العضية في الموقع بشكل أفضل مقارنة بالميتوكوندريا المعزولة باستخدام الطرد المركزي التفاضلي. في مجال فسيولوجيا الميتوكوندريا ، يفضل الطرد المركزي القائم على الكثافة ويمكن تغييره بسهولة لزيادة نقاء المعزول. يجب النظر في ما إذا كانت التغييرات في قوى g ومدة الطرد المركزي وعدد دورات الطرد المركزي مدمجة قبل التجربة نظرا لتأثيرها على تنقية الميتوكوندريا. علاوة على ذلك ، فإن إعادة تعليق الميتوكوندريا ، التي يمكن القول إنها الخطوة الأكثر أهمية أثناء العزلة ، تختلف اختلافا كبيرا بين الدراسات ، مع استخدام الكشط أو الخلط القائم على الدوامة أو التجانس^23،25،26. يمكن أن يكون التعليق الميكانيكي لهذه الأنواع كاشطة للغاية ويضعف سلامة غشاء الميتوكوندريا. لهذا السبب ، يجب إجراء الغسيل اللطيف لتصحيح ذلك. على الرغم من عدد كبير من التعديلات والمنهجيات المقترحة ، هناك عدد أقل من البروتوكولات الشاملة ذات قابلية عالية للاستنساخ والقدرة على التكيف مع نماذج القوارض.

تحدد الطرق الموضحة هنا بروتوكولا مفصلا وقويا وقابلا للتكرار بدرجة كبيرة ينتج ميتوكوندريا نقية ومقترنة جيدا من أنسجة القلب الحيوانية الصغيرة. كما هو موضح ، يمكن تكييف هذه الطريقة بسهولة لاستيعاب الاحتياجات المحددة لكل تجربة و / أو بيئة معملية لعزل الميتوكوندريا عن الكلى والكبد والخلايا المستنبتة. يمكن إجراء مزيد من التعديلات لعزل الميتوكوندريا عن الأنسجة الأخرى غير المدرجة هنا. يتم توفير وصفات العازلة المستخدمة لجميع العزل ويمكن تعديلها إذا لزم الأمر. على غرار البروتوكولات المنشورة الأخرى ، يتم تنفيذ التجانس الآلي والطرد المركزي التفاضلي. ومع ذلك ، يتم إجراء تعديلات على كل من وقت القص والقوة التي يتم بها الطرد المركزي للعينات لتقديم عزلات الميتوكوندريا عالية الجودة باستمرار ، اعتمادا على مصدر العزل. والجدير بالذكر أن هذا البروتوكول يختلف عن غيره باستخدام الغسيل اللطيف عن طريق سحب العينة لإعادة تعليق الميتوكوندريا المحببة، مما يساعد في الحفاظ على سلامة غشاء الميتوكوندريا والحفاظ على الوظيفة العامة للعضيات. يتم قياس بروتين الميتوكوندريا إما عن طريق تحديد البروتين الكلي أو عن طريق قياس نشاط سينسيز السترات. يتم دعم فائدة طريقة العزل هذه وقابليتها للتطبيق الواسع من خلال قيم نسب التحكم في الجهاز التنفسي (RCR) التي تم تحقيقها عبر الكائنات الحية ومصادر الأنسجة المختلفة.

Protocol

تم إجراء استخدام وعلاج جميع الفقارية وفقا للبروتوكولات المعتمدة التي تمت مراجعتها وقبولها من قبل اللجنة المؤسسية لرعاية واستخدامه (IACUC) في جامعة ولاية ميشيغان. تم تصميم هذا البروتوكول باستخدام كل من ذكور وإناث خنازير غينيا هارتلي ألبينو وفئران سبراج داولي (SD). لعزل الميتوكوندريا القلبية عن خنازير غينيا ، تم التضحية بالحيوانات في أعمار تتراوح بين 4-6 أسابيع (300-450 جم). تم الحصول على الميتوكوندريا القلبية من الفئران SD من كلا الجنسين بين سن 10-13 أسبوعا (250-400 جم). وصفات للمخازن المؤقتة موصوفة في الجدول 1 ويجب تحضيرها مسبقا. تفاصيل الكواشف والمعدات المستخدمة في هذه الدراسة مدرجة في جدول المواد.

1. التحضير التجريبي

1. قبل البدء في العزل ، قم بتسمية أنبوبين للطرد المركزي سعة 50 مل على أنهما "Spins 1 و 2" و "Spin 3".
2. ضع الأنابيب ، وعازلة العزل المذابة حديثا (IB) ، ومقص فرم حاد ، ومسبار تجانس مجمع ، ودورق 5 مل أو حاوية مكافئة الحجم على الثلج.
3. ضع عازلة التنفس المذابة حديثا (RB) في حاضنة للتدفئة لإجراء فحوصات الجهاز التنفسي اللاحقة.
4. قم بتبريد جهاز طرد مركزي مبرد مسبقا إلى 4 درجات مئوية.
5. تأكد من ترتيب جميع المعدات وإضافة 20 ميكرولتر من 7-15 وحدة / ملغ بروتياز من Bacillus licheniformis إلى الأنبوب المسمى "الدوران 1 و 2".
6. قم بإعداد نظام ضغط يعتمد على الجاذبية للتروية عن طريق القنية باستخدام عازلة شلل القلب (CB ، الجدول 1) ، والقنية الزجاجية ، والأنابيب البلاستيكية مع توصيل صمام محبس.
7. رتب الأدوات الجراحية وقم بتضمين المقص والملقط المناسب لتشريح القلب وقنطه.
   ملاحظة: يجب أن تكون جميع المياه ذات جودة نقية (18.2 MΩ · سم)

2. تشريح الأنسجة

1. حقن بكبريتات الهيبارين المعقمة داخل الصفاق بجرعة 500 وحدة / كجم.
2. اسمح للحيوان بالجلوس في غرفة الحث لمدة 15 دقيقة بعد إعطاء الهيبارين. خلال هذا الوقت ، قم بتوفير 2 لتر / دقيقة من غاز O₂ النقي لتزويد بالأكسجين الكامل ، وتهدئتها ، وتقليل أي إجهاد قد يكون له عواقب سلبية على الأنسجة ذات الأهمية.
3. ابدأ تحريض التخدير عن طريق التدفق المستمر للأيزوفلوران بنسبة 0.5٪. بعد 1 دقيقة ، قم بالزيادة إلى 1٪. استمر في زيادة بنسبة 1٪ كل دقيقة حتى يتم الوصول إلى 5٪. مرة واحدة في 5٪ ، انتظر لمدة 1 دقيقة وراقب نمط تنفس.
4. بمجرد أن يتباطأ التنفس ويصبح شاقا (تقريبا عند علامة 6.5 دقيقة) ، قم بإيقاف تشغيل تدفق الأيزوفلوران والأكسجين.
5. قم بإزالة بسرعة من غرفة الحث وتحقق من عمق التخدير المناسب عن طريق الضغط على مخلب والتحقق من منعكس القرنية. إذا استجاب لأي من المنبهين ، فضعه مرة أخرى في غرفة الحث ، وأعد إدارة التخدير ، وكرر فحص عمق التخدير.
6. بمجرد الوصول إلى العمق المناسب للتخدير ، قم بقطع رأسه بسرعة بالمقصلة لتشديد العمود الفقري العنقي ووضع الجسم المعرض على الجليد.
7. قم بعمل شقين رأسيين متوازيين من الترقوة على طول القفص الصدري الجانبي أسفل طول الصدر. تأكد من أن الشقوق عميقة بما يكفي لقطع الأضلاع الموجودة في الصدر الجانبي ، ولكن تجنب إتلاف الهياكل داخل الصدر مثل القلب أو الأوعية الكبيرة.
   ملاحظة: تعتمد أحجام الشق الرأسي على المستخدم. في حالة استخدام خنازير غينيا والجرذان ، قم بقصها إلى الحجاب الحاجز (حوالي 6.35 سم للفئران و 11 سم لخنازير غينيا). في حالة استخدام الفئران ، قم بإجراء بضع الصدر^{القياسي 27}.
8. كشف القلب باستخدام الإرقاء لإزاحة الصدر الأمامي وتعبئة التجويف الصدري المكشوف بالثلج. تقلل هذه الخطوة من وقت نقص التروية الدافئ وتعزز صلاحية العضيات المعزولة.
9. استخدم الملقط لتشريح الغدة الصعترية والتامور بصراحة وتعريض القلب بالكامل.
10. باستخدام الملقط ، ضع قوة جر سفلية لطيفة على القلب لكشف الشريان الأورطي والتعرف عليه. الشريان الأورطي هو أثخن وعاء كبير يتفرع من قاعدة القلب. الأوعية الكبيرة الأخرى ، مثل الوريد الرئوي ، أكثر شفافية بشكل ملحوظ من الشريان الأورطي.
11. قطع الشريان الأورطي حوالي 4-6 مم فوق جذر الشريان الأورطي ولكن أسفل نقاط التفرع السباتية.
12. قم بقنية الشريان الأورطي وزرع القلب^28،29 بمحلول شلل القلب المثلج (CB) باستخدام رأس ضغط يعتمد على الجاذبية حتى يتم تطهير الشرايين التاجية من الدم ويظهر العضو مبيضا.
    ملاحظة: بالنسبة للقوارض الكبيرة ، يعمل قطر القنية من 1.8 إلى 2.2 مم بشكل جيد ، بينما بالنسبة للقوارض الصغيرة ، يوصى بنطاق قطر يتراوح بين 1.4 و 1.8 مم. يجب ألا يستغرق التروية الرجعية أكثر من 15-30 ثانية حتى تتخلص الأوعية التاجية من الدم.
13. اعزل عضلة القلب البطينية عن طريق تشريح الأذينين والأنسجة الصمامية الغضروفية والأنسجة الدهنية.
14. ضع البطينين في دورق مبرد مسبقا سعة 10 مل يحتوي على 0.1-0.2 مل من IB المثلج.
15. افرم الأنسجة بمقص جراحي حاد حتى تصبح القطع حوالي 1 مم³.

3. تنقية الميتوكوندريا وقياس البروتين

1. انقل الأنسجة المفرومة إلى أنبوب الطرد المركزي المبرد مسبقا المسمى "Spins 1 و 2" الذي يحتوي على محلول البروتياز.
2. أضف IB المثلج إلى الحجم النهائي البالغ 25 مل.
3. باستخدام الخالط الدوار الثابت المحمول باليد ، قم بتفريق الأنسجة عند 18,000 دورة في الدقيقة على الجليد لمدة 20-25 ثانية.
4. أنسجة متجانسة بأجهزة الطرد المركزي في أنبوب يسمى "يدور 1 و 2" عند 8,000 × جم لمدة 10 دقائق عند 4 درجات مئوية.
5. تخلص من المادة الطافية (التي تحتوي على البروتياز) عن طريق سكبها في نفايات الكربوي واشطف الحبيبات برفق مع 5 مل من IB لإزالة البروتياز المتبقي.
6. بعد التخلص من الشطف ، أعد تعليق الحبيبات باستخدام IB المثلج الطازج إلى حجم نهائي يبلغ 25 مل بواسطة دوامة لطيفة.
7. جهاز طرد مركزي عند 800 × جم لمدة 10 دقائق عند 4 درجات مئوية.
8. قم بإزالة المادة الطافية (التي تحتوي على الميتوكوندريا) عن طريق سكبها برفق في أنبوب مبرد مسبقا سعة 50 مل يسمى "Spin 3". أثناء الصب, احرص على تجنب إزاحة الجزء العلوي السائب من الحبيبات. كبديل ، يمكن استخدام ماصة النقل أو الشريط لجمع المادة الطافية.
9. جهاز الطرد المركزي للطافي عند 8000 × جم لمدة 10 دقائق عند 4 درجات مئوية.
10. تخلص من المادة الطافية الناتجة واحتفظ بالحبيبات المحتوية على الميتوكوندريا.
11. استخدم منديلا خاليا من النسالة لامتصاص المادة الطافية الزائدة من الجدار الداخلي للأنبوب ، مع الحرص على تجنب إزعاج الحبيبات. احتفظ بالحبيبات عند 4 درجات مئوية على الجليد قدر الإمكان.
12. لإعادة تعليق الميتوكوندريا ، أضف 80 ميكرولتر من IB المثلج إلى قاع الأنبوب. أعد تعليق الحبيبات برفق عن طريق غسل IB بشكل متكرر على الحبيبات.
13. لتجنب تكوين فقاعات، اضبط ماصة دقيقة على الشفط وتوفر ما بين 40-60 ميكرولتر من الحجم.
14. عندما تشتت حبيبات الميتوكوندريا ، قم بزيادة حجم الماصة الدقيقة لإعادة تعليق الميتوكوندريا المحببة بكفاءة. تجنب لمس الحبيبات بطرف الماصة ، وتجنب تكوين الفقاعات.
15. بمجرد إعادة تعليقها ، انقل الميتوكوندريا إلى أنبوب طرد مركزي دقيق مبرد مسبقا وقم بتسميتها على أنها ميتوكوندريا مخزون. قم بتدوين الحجم الإجمالي لإعادة التعليق.
16. لتحديد تركيز بروتين الميتوكوندريا في العينة ، قم بإجراء فحص بروتين كلي باستخدام فحوصات بروتين BCA أو برادفورد المعروفة كما هو محدد في تعليمات الشركة المصنعة.
    ملاحظة: تتمثل الإستراتيجية البديلة أو التكميلية لتقييم العائد في تحديد نشاط سينسيز السترات. كمرجع ، يمكن قياس محتوى الميتوكوندريا باتباع البروتوكول الموضح في Vinnakota et ^al.30.

4. فحوصات مراقبة الجودة

1. في أنبوب الطرد المركزي الدقيق المبرد مسبقا ، قم بتخفيف مخزون الميتوكوندريا إلى تركيز العمل المطلوب باستخدام IB.
   ملاحظة: يتم تخفيف مخزون الميتوكوندريا إلى 40 مجم / مل للعمل بتركيز نهائي 0.1 مجم / مل لمقايسات قياس التنفس عند استخدام العزلات من أنسجة القلب.
2. اشطف غرف الأوكسجراف، والسدادات، وماقن الميكرولتر عشر مرات بالماء المقطر لتنظيفها قبل استخدامها في فحوصات قياس إعادة التصنيع.
3. لاختبار جدوى وجودة عزلات الميتوكوندريا ، قم بتحميل 2.3 مل من عازلة التنفس (RB) في غرف الأوكسجين والسماح لإشارة استهلاك الأكسجين بالتوازن عند 37 درجة مئوية لمدة 10 دقائق تقريبا أو عندما يكون المعدل قريبا من 0.
4. بمجرد أن يتم توازن الإشارة ، ادفع السدادات لأسفل واستنشق المخزن المؤقت الزائد الذي يخرج من الشعيرات الدموية للسدادة.
5. أضف 1 ملي مولار EGTA باستخدام حقنة ميكرولتر لاستخلاص أي كالسيوم متبقي في المخازن المؤقتة أو عينة الميتوكوندريا.
6. لتغذية التنفس ، أضف 5 ملي مولار من بيروفات الصوديوم و 1 ملي مولار من المالات.
7. بعد إضافة الركائز ، أضف بلعة من الميتوكوندريا المخففة لتحقيق تركيز العمل والسماح بحدوث التنفس لمدة 5 دقائق. تسمى هذه الفترة LEAK أو تنفس الحالة 2.
8. عند علامة 5 دقائق ، أضف بلعة 500 ميكرومتر ADP لبدء التنفس في الحالة 3 ، والتي تسمى أيضا OXHPOS ، واسمح للميتوكوندريا بالتنفس حتى نقص الأكسجين.
9. احسب نسبة التحكم في الجهاز التنفسي (RCR) بقسمة الحد الأقصى لمعدل استهلاك الأكسجين خلال الحالة 3 على معدل استهلاك الأكسجين قبل إضافة ADP في الحالة 2 (انظر الشكل 1).
   ملاحظة: يمكن أيضا استخدام تعبير RCR بديل للعدد 1 - 1 / RCR كمقياس للجودة ، والذي يحد بين 0 و 1 ؛ ومع ذلك ، فإنه يجعل من الصعب التمييز بين الجودة باستخدام هذا المقياس عندما > RCR 10 (انظر الشكل 2).
10. اشطف الغرف والسدادات 10 مرات بالماء النقي لتنظيف الأوكسجرافية للفحوصات اللاحقة. إذا اكتمل قياس إعادة التسخين ، املأ الغرف بنسبة 70٪ من الإيثانول وضع السدادات في الغرف حتى الاستخدام التالي.

النتائج

عند الانتهاء من عزل الميتوكوندريا ، يجب اختبار جودة ووظائف العزلات عن طريق تحديد معدلات استهلاك الأكسجين (J_O2) باستخدام قياس إعادة التسخين عالي الدقة. للقيام بذلك ، تم تخفيف مخزونات الميتوكوندريا إلى 40 مجم / مل للسماح بتركيزات العمل البالغة 0.1 مجم / مل في 2 مل من RB...

Discussion

سيضمن الالتزام بالطرق الموضحة بإيجاز في هذا البروتوكول عزل الميتوكوندريا المقترنة جيدا عن أنسجة القلب للقوارض الصغيرة ، بالإضافة إلى أنواع ومصادر الأنسجة الأخرى. بشكل عام ، يجب أن تستغرق العملية ما مجموعه 3-3.5 ساعة ، حيث يجب أن تبقى جميع الأنسجة الحيوانية والعينات والعز...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
1.7 mL microcentrifuge tubes
10 mL glass beaker			For organ disection and mincing
50 mL centrifuge tubes			Centrifugation
Adenosine 5'-diphosphate monopotassium salt dihydrate	Sigma	A5285	Respirometry assays
BSA Protein Assay Kit	Thermo Scentific	PI23225	Mitochondrial protein quantification
Dextrose	Sigma	DX0145	For buffer (CB)
Ethylene glycol-bis(2-amino-ethylether)-N,N,N',N'-tetraacetic acid	Sigma	E4378	For buffers (CB and IB) and respirometry assays
Glass cannula	Radnoti		Guinea pig and rat heart perfusion
Heparin sodium porcine mucosa	Sigma	SRE0027-250KU	Animal IP injection
High-resolution respirometer			Clark-type electrode; oxygraph with 2 mL chambers
Induction chamber
Isoflurane	Sigma	792632	Anesthetic
L-malic acid	Sigma	02288-50G	Respirometry assays
Magnesium chloride hexahydrate	Sigma	M9272	For buffer (RB)
Mannitol	Sigma	MX0214	For buffer (IB)
Microliter syringes			Sizes ranging from 5–50 µL
Microplate reader			Must be able to incubate at 37 °C
MOPS	Sigma	475898	For all buffers
O2 tank
OMNI THQ Homogenizer	OMNI International	12-500	Similar rotor stator homogenizers will work
pipettes			Volumes of  2–20 µL; 20–200 µL; 200–1000 µL
Potassium chloride	Sigma	P3911	For buffers (RB and CB)
Potassium phosphate dibasic	Sigma	795496	For buffers (IB and RB)
Protease from Bacillus licheniformis	Sigma	P5459
Sodium chloride	Sigma	S9888	For buffer (CB)
Sodium pyruvate	Fisher bioreagents	BP356-100	Respirometry assays
Sucrose	Sigma	8510-OP	For buffer (IB)
Surgical dissection kit			Depends on animal and tissue source
Tabletop centrifuge			Must cool to 4 °C