A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.
كشفت دراسات الطاقة الحيوية والتمثيل الغذائي على الميتوكوندريا عن دورها متعدد الأوجه في العديد من الأمراض ، لكن طرق عزل هذه العضيات تختلف. الطريقة المفصلة هنا قادرة على تنقية الميتوكوندريا عالية الجودة من مصادر أنسجة متعددة. يتم تحديد الجودة من خلال نسب التحكم في الجهاز التنفسي والمقاييس الأخرى التي يتم تقييمها باستخدام قياس إعادة الالتنفس عالي الدقة.
يمارس عزل الميتوكوندريا منذ عقود ، باتباع الإجراءات التي وضعها الرواد في مجالات البيولوجيا الجزيئية والكيمياء الحيوية لدراسة ضعف التمثيل الغذائي والأمراض. جودة الميتوكوندريا المتسقة ضرورية للتحقيق بشكل صحيح في فسيولوجيا الميتوكوندريا والطاقة الحيوية. ومع ذلك ، تتوفر العديد من طرق العزل المنشورة المختلفة للباحثين. على الرغم من أن الاستراتيجيات التجريبية المختلفة تتطلب طرق عزل مختلفة ، إلا أن المبادئ والإجراءات الأساسية متشابهة. يوضح هذا البروتوكول بالتفصيل طريقة قادرة على استخراج الميتوكوندريا المقترنة جيدا من مجموعة متنوعة من مصادر الأنسجة ، بما في ذلك والخلايا الصغيرة. تشمل الخطوات الموضحة تشريح الأعضاء ، وتنقية الميتوكوندريا ، والقياس الكمي للبروتين ، وفحوصات مراقبة الجودة المختلفة. مقياس مراقبة الجودة الأساسي المستخدم لتحديد الميتوكوندريا عالية الجودة هو نسبة التحكم في الجهاز التنفسي (RCR). RCR هو نسبة معدل التنفس أثناء الفسفرة المؤكسدة إلى المعدل في حالة عدم وجود ADP. تتم مناقشة المقاييس البديلة. بينما يتم الحصول على قيم RCR عالية بالنسبة لمصدر الأنسجة باستخدام هذا البروتوكول ، يمكن تحسين عدة خطوات لتناسب الاحتياجات الفردية للباحثين. هذا الإجراء قوي وقد أدى باستمرار إلى عزل الميتوكوندريا مع قيم RCR أعلى من المتوسط عبر النماذج الحيوانية ومصادر الأنسجة.
الميتوكوندريا هي عضيات تحت الخلوية تنشئ ظروفا نشطة سيتوبلازمية محسنة لوظائف خلوية معينة. في حين أن الدراسات الخلوية والأنسجة والكائن الحي يمكن أن توفر رؤى حول وظيفة الميتوكوندريا ، فإن عزل العضيات يوفر مستوى من التحكم التجريبي غير ممكن بخلاف ذلك. تم إجراء عزلات الميتوكوندريا منذ الأربعينيات ، مما يسمح بإجراء دراسات ميكانيكية لعملية التمثيل الغذائي والتنفس عبر مجموعة متنوعة من الخلايا والأنسجة1،2. الأهمية التاريخية للميتوكوندريا موثقة جيدا3. بصفتها المنتجين الرئيسيين ل ATP ، تلعب الميتوكوندريا العديد من الأدوار الرئيسية الحيوية للوظيفة الخلوية والأعضاء ا....
تم إجراء استخدام وعلاج جميع الفقارية وفقا للبروتوكولات المعتمدة التي تمت مراجعتها وقبولها من قبل اللجنة المؤسسية لرعاية واستخدامه (IACUC) في جامعة ولاية ميشيغان. تم تصميم هذا البروتوكول باستخدام كل من ذكور وإناث خنازير غينيا هارتلي ألبينو وفئران سبراج داولي (SD). لعزل الميتوكوندريا القلبية عن خنازير غينيا ، تم التضحية بالحيوانات في أعمار تتراوح بين 4-6 أسابيع (300-450 جم). تم الحصول على الميتوكوندريا القلبية من الفئران SD من كلا الجنسين بين سن 10-13 أسبوعا (250-400 جم). وصفات للمخازن المؤقتة موصوفة في الجدول 1 ويجب تحضيرها مسبقا. تفاصيل الكواشف والمعدات المستخدمة في هذه الدراسة مدرجة في جدول المواد.
عند الانتهاء من عزل الميتوكوندريا ، يجب اختبار جودة ووظائف العزلات عن طريق تحديد معدلات استهلاك الأكسجين (JO2) باستخدام قياس إعادة التسخين عالي الدقة. للقيام بذلك ، تم تخفيف مخزونات الميتوكوندريا إلى 40 مجم / مل للسماح بتركيزات العمل البالغة 0.1 مجم / مل في 2 مل من RB.......
سيضمن الالتزام بالطرق الموضحة بإيجاز في هذا البروتوكول عزل الميتوكوندريا المقترنة جيدا عن أنسجة القلب للقوارض الصغيرة ، بالإضافة إلى أنواع ومصادر الأنسجة الأخرى. بشكل عام ، يجب أن تستغرق العملية ما مجموعه 3-3.5 ساعة ، حيث يجب أن تبقى جميع الأنسجة الحيوانية والعينات والعز.......
يعلن المؤلفان أنه لا يوجد ما يمكن الكشف عنه.
نود أن نتوجه بخالص الشكر إلى دانيال أ. بيرد وكاليان سي فيناكوتا لمساهماتهم التأسيسية في هذا البروتوكول. تم تمويل هذا العمل من قبل منحة NSF CAREER MCB-2237117.
....Name | Company | Catalog Number | Comments |
1.7 mL microcentrifuge tubes | |||
10 mL glass beaker | For organ disection and mincing | ||
50 mL centrifuge tubes | Centrifugation | ||
Adenosine 5'-diphosphate monopotassium salt dihydrate | Sigma | A5285 | Respirometry assays |
BSA Protein Assay Kit | Thermo Scentific | PI23225 | Mitochondrial protein quantification |
Dextrose | Sigma | DX0145 | For buffer (CB) |
Ethylene glycol-bis(2-amino-ethylether)-N,N,N',N'-tetraacetic acid | Sigma | E4378 | For buffers (CB and IB) and respirometry assays |
Glass cannula | Radnoti | Guinea pig and rat heart perfusion | |
Heparin sodium porcine mucosa | Sigma | SRE0027-250KU | Animal IP injection |
High-resolution respirometer | Clark-type electrode; oxygraph with 2 mL chambers | ||
Induction chamber | |||
Isoflurane | Sigma | 792632 | Anesthetic |
L-malic acid | Sigma | 02288-50G | Respirometry assays |
Magnesium chloride hexahydrate | Sigma | M9272 | For buffer (RB) |
Mannitol | Sigma | MX0214 | For buffer (IB) |
Microliter syringes | Sizes ranging from 5–50 µL | ||
Microplate reader | Must be able to incubate at 37 °C | ||
MOPS | Sigma | 475898 | For all buffers |
O2 tank | |||
OMNI THQ Homogenizer | OMNI International | 12-500 | Similar rotor stator homogenizers will work |
pipettes | Volumes of 2–20 µL; 20–200 µL; 200–1000 µL | ||
Potassium chloride | Sigma | P3911 | For buffers (RB and CB) |
Potassium phosphate dibasic | Sigma | 795496 | For buffers (IB and RB) |
Protease from Bacillus licheniformis | Sigma | P5459 | |
Sodium chloride | Sigma | S9888 | For buffer (CB) |
Sodium pyruvate | Fisher bioreagents | BP356-100 | Respirometry assays |
Sucrose | Sigma | 8510-OP | For buffer (IB) |
Surgical dissection kit | Depends on animal and tissue source | ||
Tabletop centrifuge | Must cool to 4 °C |
Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article
Request PermissionExplore More Articles
This article has been published
Video Coming Soon
Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved