Isolamento mitocondrial robusto de tecido cardíaco de roedores

Resumo

Estudos bioenergéticos e metabolômicos sobre mitocôndrias revelaram seu papel multifacetado em muitas doenças, mas os métodos de isolamento para essas organelas variam. O método detalhado aqui é capaz de purificar mitocôndrias de alta qualidade de várias fontes de tecido. A qualidade é determinada pelas taxas de controle respiratório e outras métricas avaliadas com respirometria de alta resolução.

Resumo

O isolamento mitocondrial é praticado há décadas, seguindo procedimentos estabelecidos por pioneiros nas áreas de biologia molecular e bioquímica para estudar deficiências metabólicas e doenças. A qualidade mitocondrial consistente é necessária para investigar adequadamente a fisiologia e a bioenergética mitocondrial; no entanto, muitos métodos de isolamento publicados diferentes estão disponíveis para os pesquisadores. Embora diferentes estratégias experimentais exijam diferentes métodos de isolamento, os princípios e procedimentos básicos são semelhantes. Este protocolo detalha um método capaz de extrair mitocôndrias bem acopladas de uma variedade de fontes de tecido, incluindo pequenos animais e células. As etapas descritas incluem dissecção de órgãos, purificação mitocondrial, quantificação de proteínas e várias verificações de controle de qualidade. A principal métrica de controle de qualidade usada para identificar mitocôndrias de alta qualidade é a taxa de controle respiratório (RCR). O RCR é a razão entre a frequência respiratória durante a fosforilação oxidativa e a taxa na ausência de ADP. Métricas alternativas são discutidas. Embora altos valores de RCR em relação à sua fonte de tecido sejam obtidos usando este protocolo, várias etapas podem ser otimizadas para atender às necessidades individuais dos pesquisadores. Este procedimento é robusto e resultou consistentemente em mitocôndrias isoladas com valores de RCR acima da média em modelos animais e fontes de tecido.

Introdução

As mitocôndrias são organelas subcelulares que estabelecem condições energéticas citoplasmáticas otimizadas para funções celulares específicas. Embora os estudos em nível celular, tecidual e de organismo possam fornecer informações sobre a função mitocondrial, o isolamento das organelas oferece um nível de controle experimental que não seria possível de outra forma. Isolamentos mitocondriais têm sido realizados desde a década de 1940, permitindo estudos mecanicistas do metabolismo e da respiração em uma variedade de células e tecidos ^1,2. A relevância histórica das mitocôndrias também está bem documentada³. Como principais produtoras de ATP, as mitocôndrias desempenham muitos papéis importantes que são vitais para a função celular e orgânica ideal⁴. Dentro da matriz mitocondrial, os substratos são oxidados pelo ciclo do TCA, produzindo equivalentes redutores e portadores de elétrons móveis, como NADH e UQH₂ ^5,6. O citocromo C é o terceiro principal transportador de elétrons móveis na rede de reação bioquímica mitocondrial⁷. Essas moléculas são então oxidadas pelos complexos transmembranares do sistema de transporte de elétrons (ETS) embutidos na membrana mitocondrial interna⁸. As reações redox do ETS são acopladas à translocação de prótons da matriz para o espaço intermembranar. Esses processos estabelecem um gradiente eletroquímico de prótons que é usado para fosforilar ADP com Pi por F₁F₀ ATP sintase para produzir ATP ^9,10. Os processos individuais que ocorrem em cada complexo podem ser explorados com respirometria de alta resolução usando eletrodos do tipo Clark ou ensaios de consumo de oxigênio em microplacas^11,12. Além disso, modelos de doenças e tratamentos usando mitocôndrias isoladas podem determinar o impacto ou a importância da função mitocondrial na progressão de certas patologias. Isso tem se mostrado frutífero no campo da cardiologia, onde alterações na liberação de combustível e substrato têm sido usadas para elucidar como a disfunção mitocondrial influencia a insuficiência cardíaca 13,14,15,16. As mitocôndrias também são conhecidas por impactar o desenvolvimento de outros estados de doença, como diabetes, câncer, obesidade, distúrbios neurológicos e miopatias^17,18. Portanto, o uso de mitocôndrias isoladas ou purificadas permite investigações mecanicistas do metabolismo oxidativo e da produção de ATP no tecido de origem.

Não faltam protocolos de isolamento mitocondrial devido à sua importância na pesquisa bioenergética. Além disso, métodos altamente específicos adaptados a subpopulações de mitocôndrias dentro de tecidos e células podem ser encontrados^19,20. As etapas processuais básicas são semelhantes entre os métodos de isolamento, mas variações podem ser feitas na composição do tampão, etapas de homogeneização e spins de centrifugação para melhorar a quantidade e a qualidade das mitocôndrias. As alterações nesses aspectos são baseadas na demanda metabólica do tecido, função geral do órgão, densidade mitocondrial e outros fatores. Em tecidos como fígado e músculo esquelético, homogeneizadores portáteis são usados para preservar a integridade mitocondrial e limitar os danos às membranas mitocondriais²¹. No entanto, ao isolar dos rins, alguns protocolos sugerem o uso de homogeneização manual ou kits comerciais para obter melhores resultados²². Embora ambos os métodos produzam mitocôndrias funcionais, a qualidade das organelas pode ser comprometida pelo tempo adicional necessário para concluir os isolamentos usando esses protocolos. A centrifugação também é vital para a extração da proteína mitocondrial, pois separa componentes celulares, como núcleos e outras organelas, das mitocôndrias²³. Durante o processo de isolamento, é debatido se a centrifugação diferencial ou baseada em densidade deve ser implementada para obter isolados mais puros²⁴. Embora a centrifugação por densidade possa separar as mitocôndrias de organelas de gravidade específica semelhante, como os peroxissomos, não está bem estabelecido se as mitocôndrias desses métodos representam melhor a função da organela in situ em comparação com as mitocôndrias isoladas usando centrifugação diferencial. No campo da fisiologia mitocondrial, a centrifugação baseada em densidade é preferida e pode ser facilmente alterada para aumentar a pureza do isolado. Se as mudanças nas forças g, na duração da centrifugação e no número de spins de centrifugação são incorporadas devem ser consideradas antes da experimentação devido à sua influência na purificação mitocondrial. Além disso, a ressuspensão mitocondrial, indiscutivelmente a etapa mais crucial durante o isolamento, difere muito entre os estudos, com o uso de raspagem, mistura baseada em vórtice ou homogeneização 23,25,26. A ressuspensão mecânica desses tipos pode ser muito abrasiva e prejudicar a integridade da membrana das mitocôndrias. Por esse motivo, deve-se realizar uma lavagem suave para corrigir isso. Apesar da infinidade de modulações e metodologias sugeridas, existem menos protocolos abrangentes com alta reprodutibilidade e adaptabilidade para modelos de roedores.

Os métodos aqui descritos descrevem um protocolo detalhado, robusto e altamente reprodutível que produz mitocôndrias purificadas e bem acopladas a partir de tecido cardíaco de pequenos animais. Conforme demonstrado, este método pode ser facilmente adaptado para acomodar as necessidades específicas de cada experimento e/ou ambiente de laboratório para isolar mitocôndrias de rins, fígado e células cultivadas. Outras modificações podem ser feitas para isolar as mitocôndrias de tecidos e outros animais não listados aqui. As receitas de buffer usadas para todos os isolamentos são fornecidas e podem ser modificadas, se necessário. Semelhante a outros protocolos publicados, a homogeneização motorizada e a centrifugação diferencial são implementadas; no entanto, são feitos ajustes no tempo de cisalhamento e na força com que as amostras são centrifugadas para fornecer consistentemente isolados mitocondriais de alta qualidade, dependendo da fonte de isolamento. Notavelmente, este protocolo difere de outros por usar lavagem suave por pipetagem para ressuspender as mitocôndrias peletizadas, o que ajuda a preservar a integridade da membrana mitocondrial e manter a funcionalidade geral das organelas. A proteína mitocondrial é quantificada pela determinação da proteína total ou pela medição da atividade da citrato sintase. A utilidade e a ampla aplicabilidade deste método de isolamento são ainda mais apoiadas pelos valores das taxas de controle respiratório (RCR) alcançados em vários organismos e fontes de tecido.

Protocolo

O uso e o tratamento de todos os animais vertebrados foram realizados de acordo com protocolos aprovados, revisados e aceitos pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais (IACUC) da Michigan State University. Este protocolo foi projetado usando cobaias albinas Hartley machos e fêmeas e ratos Sprague Dawley (SD). Para o isolamento das mitocôndrias cardíacas de cobaias, os animais foram sacrificados com idades entre 4-6 semanas (300-450 g). As mitocôndrias cardíacas de ratos SD de ambos os sexos foram obtidas entre as idades de 10-13 semanas (250-400 g). As receitas para tampões são descritas na Tabela 1 e devem ser preparadas com antecedência. Os detalhes dos reagentes e equipamentos utilizados neste estudo estão listados na Tabela de Materiais.

1. Preparação experimental

1. Antes de iniciar o isolamento, rotule dois tubos de centrifugação de 50 mL como "Spins 1 e 2" e "Spin 3".
2. Coloque tubos, tampão de isolamento (IB) recém-descongelado, tesoura de picar afiada, sonda de homogeneização montada e um copo de 5 mL ou recipiente de tamanho equivalente no gelo.
3. Coloque o tampão respiratório (RB) recém-descongelado em uma incubadora para aquecer para ensaios respiratórios subsequentes.
4. Pré-arrefecer uma centrífuga refrigerada a 4 °C.
5. Certifique-se de que todo o equipamento esteja disposto e 20 μL de protease 7-15 U/mg de Bacillus licheniformis tenham sido adicionados ao tubo rotulado como "Spins 1 e 2".
6. Configure um sistema de pressão dependente da gravidade para perfusão por canulação usando tampão de cardioplegia (CB, Tabela 1), cânula de vidro e tubo de plástico com uma válvula de torneira acoplada.
7. Organize as ferramentas cirúrgicas e inclua tesouras e fórceps adequados para dissecção e canulação do coração.
   NOTA: Toda a água deve ser de qualidade pura (18,2 MΩ · cm)

2. Dissecção de tecido

1. Injetar os animais com sulfato de heparina estéril por via intraperitoneal na dose de 500 U/kg.
2. Deixe o animal sentar na câmara de indução por 15 minutos após a administração de heparina. Durante esse período, forneça 2 L/min de gás O₂ puro para oxigenar totalmente os animais, acalmá-los e minimizar qualquer estresse que possa ter consequências adversas no tecido de interesse.
3. Inicie a indução anestésica por um fluxo contínuo de isoflurano a 0,5%. Após 1 min, aumente para 1%. Continue a aumentar 1% a cada minuto até que 5% seja alcançado. Uma vez a 5%, aguarde 1 min e monitore o padrão respiratório do animal.
4. Uma vez que a respiração tenha diminuído e se torne difícil (aproximadamente na marca de 6,5 minutos), desligue o isoflurano e o fluxo de oxigênio.
5. Remova rapidamente o animal da câmara de indução e verifique a profundidade anestésica apropriada apertando uma pata e verificando o reflexo da córnea. Se o animal responder a qualquer um dos estímulos, coloque-o de volta na câmara de indução, readministre a anestesia e repita a verificação da profundidade do anestésico.
6. Uma vez atingida a profundidade adequada da anestesia, decapite rapidamente com uma guilhotina para cortar a coluna cervical e colocar o corpo em decúbito ventral no gelo.
7. Faça duas incisões verticais paralelas das clavículas ao longo da caixa torácica lateral ao longo do comprimento do tórax. Certifique-se de que as incisões sejam profundas o suficiente para cortar as costelas na lateral do tórax, mas evite danificar as estruturas intratorácicas, como o coração ou os grandes vasos.
   NOTA: Os tamanhos das incisões verticais dependem do animal que está sendo usado. Se estiver usando cobaias e ratos, corte no diafragma (aproximadamente 6,35 cm para ratos e 11 cm para porquinhos-da-índia). Se estiver usando camundongos, faça uma toracotomia padrão²⁷.
8. Exponha o coração usando um hemostático para deslocar o tórax anterior e encha a cavidade torácica exposta com gelo. Esta etapa minimiza o tempo de isquemia quente e aumenta a viabilidade das organelas isoladas.
9. Use uma pinça para dissecar sem rodeios o timo e o pericárdio e expor totalmente o coração.
10. Usando uma pinça, aplique uma tração inferior suave no coração para expor e identificar a aorta. A aorta é o grande vaso mais espesso que se ramifica da base do coração. Outros vasos grandes, como a veia pulmonar, são visivelmente mais translúcidos que a aorta.
11. Corte a aorta aproximadamente 4-6 mm acima da raiz da aorta, mas abaixo dos pontos de ramificação da carótida.
12. Canular a aorta e perfundir o coração ^28,29 com solução de cardioplegia (CB) gelada usando uma cabeça de pressão dependente da gravidade até que as artérias coronárias estejam livres de sangue e o órgão pareça pálido.
    NOTA: Para roedores grandes, um diâmetro de cânula de 1,8-2,2 mm funciona bem, enquanto para roedores menores, recomenda-se uma faixa de diâmetro de 1,4-1,8 mm. A retroperfusão não deve levar mais do que 15-30 s para que os vasos coronários limpem o sangue.
13. Isole o miocárdio ventricular dissecando os átrios, o tecido valvular cartilaginoso e os tecidos adiposos.
14. Coloque os ventrículos em um béquer pré-resfriado de 10 mL contendo 0,1-0,2 mL de IB gelado.
15. Pique o tecido com uma tesoura cirúrgica afiada até que as peças tenham aproximadamente 1 mm³.

3. Purificação mitocondrial e quantificação de proteínas

1. Transfira o tecido picado para o tubo de centrífuga pré-resfriado rotulado como "Spins 1 e 2" contendo a solução de protease.
2. Adicione IB gelado a um volume final de 25 mL.
3. Usando um homogeneizador rotor-estator portátil motorizado, disperse o tecido a 18.000 rpm em gelo por 20-25 s.
4. Centrifugue o tecido homogeneizado em um tubo rotulado como "Spins 1 e 2" a 8.000 x g por 10 min a 4 ° C.
5. Descarte o sobrenadante (que contém protease) despejando-o no garrafão de resíduos e enxágue suavemente o pellet com 5 mL de IB para remover a protease residual.
6. Depois de descartar o enxágue, ressuspenda o pellet com IB fresco gelado até um volume final de 25 mL por vórtice suave.
7. Centrifugue a 800 x g durante 10 min a 4 °C.
8. Remova o sobrenadante (contém mitocôndrias) despejando-o suavemente em um tubo pré-resfriado de 50 mL rotulado como "Spin 3". Ao despejar, tome cuidado para evitar desalojar a parte superior solta do pellet. Como alternativa, uma pipeta ou stripette de transferência pode ser usada para coletar o sobrenadante.
9. Centrifugar o sobrenadante a 8000 x g durante 10 min a 4 °C.
10. Descarte o sobrenadante resultante e retenha o pellet contendo mitocôndrias.
11. Use um pano sem fiapos para absorver o excesso de sobrenadante da parede interna do tubo, tomando cuidado para evitar perturbar o pellet. Mantenha o pellet a 4 °C no gelo o máximo possível.
12. Para ressuspender as mitocôndrias, adicione 80 μL de IB gelado ao fundo do tubo. Ressuspenda suavemente o pellet lavando repetidamente o IB sobre o pellet.
13. Para evitar a criação de bolhas, defina uma micropipeta para aspirar e fornecer entre 40-60 μL de volume.
14. À medida que o pellet mitocondrial se dispersa, aumente o volume da micropipeta para ressuspender eficientemente as mitocôndrias peletizadas. Evite tocar no pellet com a ponta da pipeta e evite fazer bolhas.
15. Uma vez ressuspensas, transfira as mitocôndrias para um tubo de microcentrífuga pré-resfriado e rotule-o como mitocôndrias padrão. Anote o volume total de ressuspensão.
16. Para determinar a concentração de proteína mitocondrial na amostra, realize um ensaio de proteína total usando os conhecidos ensaios de proteína BCA ou Bradford, conforme definido pelas instruções do fabricante.
    NOTA: Uma estratégia alternativa ou complementar para avaliar o rendimento é determinar a atividade da citrato sintase. Para referência, o conteúdo mitocondrial pode ser quantificado seguindo o protocolo descrito em Vinnakota et ^al.30.

4. Verificações de controle de qualidade

1. Em um tubo de microcentrífuga pré-resfriado, dilua o estoque mitocondrial até a concentração de trabalho desejada com IB.
   NOTA: Os estoques mitocondriais são diluídos a 40 mg / mL para trabalhar na concentração final de 0,1 mg / mL para ensaios de respirometria ao usar isolados de tecido cardíaco.
2. Enxágue as câmaras do oxígrafo, as rolhas e as seringas de microlitros dez vezes com água destilada para limpá-las antes de usá-las em ensaios de respirometria.
3. Para testar a viabilidade e a qualidade dos isolados mitocondriais, carregue 2,3 mL de tampão respiratório (RB) nas câmaras do oxígrafo e permita que o sinal de consumo de oxigênio se equilibre a 37 ° C por cerca de 10 min ou quando a taxa estiver próxima de 0.
4. Uma vez que o sinal esteja equilibrado, empurre para baixo as rolhas e aspire o excesso de tampão que emerge do capilar da rolha.
5. Adicione 1 mM de EGTA usando uma seringa de microlitro para quelar qualquer cálcio residual nos tampões ou na amostra mitocondrial.
6. Para alimentar a respiração, adicione 5 mM de piruvato de sódio e 1 mM de L-malato.
7. Após a adição de substratos, adicione um bolo de mitocôndrias diluídas para atingir a concentração de trabalho e permitir que a respiração ocorra por 5 min. Este período é denominado VAZAMENTO ou respiração Estado 2.
8. Na marca de 5 minutos, adicione um bolus de 500 μM de ADP para iniciar a respiração do Estado 3, também denominado OXHPOS, e permita que as mitocôndrias respirem até a anóxia.
9. Calcule a taxa de controle respiratório (RCR) dividindo a taxa máxima de consumo de oxigênio durante o Estado 3 pela taxa de consumo de oxigênio imediatamente antes da adição de ADP no Estado 2 (ver Figura 1).
   NOTA: Uma expressão RCR alternativa de 1 - 1/RCR também pode ser usada como uma métrica de qualidade, que é limitada entre 0 e 1; no entanto, dificulta a diferenciação da qualidade usando essa métrica quando o RCR > 10 (consulte a Figura 2).
10. Enxágue as câmaras e rolhas 10 vezes com água pura para limpar o oxígrafo para ensaios subsequentes. Se a respirometria estiver completa, encha as câmaras com etanol a 70% e coloque as rolhas nas câmaras até o próximo uso.

Resultados

Após a conclusão do isolamento mitocondrial, a qualidade e a funcionalidade dos isolados devem ser testadas através da quantificação das taxas de consumo de oxigénio (J_O2) utilizando respirometria de alta resolução. Para isso, os estoques mitocondriais foram diluídos a 40 mg/mL para permitir concentrações de trabalho de 0,1 mg/mL em 2 mL de RB para todos os ensaios de respirometria usando mitocôndrias cardíacas isoladas. A respiração foi alimentada por ...

Discussão

A adesão aos métodos descritos de forma concisa neste protocolo garantirá o isolamento de mitocôndrias bem acopladas do tecido cardíaco de pequenos roedores, além de outros tipos e fontes de tecido. No geral, o processo deve levar um total de 3-3,5 h, durante o qual todos os tecidos animais, amostras e isolados devem permanecer no gelo a 4 ° C, tanto quanto possível, para limitar a degradação. Esse procedimento é robusto e pode ser alterado de várias maneiras para melhor se a...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
1.7 mL microcentrifuge tubes
10 mL glass beaker			For organ disection and mincing
50 mL centrifuge tubes			Centrifugation
Adenosine 5'-diphosphate monopotassium salt dihydrate	Sigma	A5285	Respirometry assays
BSA Protein Assay Kit	Thermo Scentific	PI23225	Mitochondrial protein quantification
Dextrose	Sigma	DX0145	For buffer (CB)
Ethylene glycol-bis(2-amino-ethylether)-N,N,N',N'-tetraacetic acid	Sigma	E4378	For buffers (CB and IB) and respirometry assays
Glass cannula	Radnoti		Guinea pig and rat heart perfusion
Heparin sodium porcine mucosa	Sigma	SRE0027-250KU	Animal IP injection
High-resolution respirometer			Clark-type electrode; oxygraph with 2 mL chambers
Induction chamber
Isoflurane	Sigma	792632	Anesthetic
L-malic acid	Sigma	02288-50G	Respirometry assays
Magnesium chloride hexahydrate	Sigma	M9272	For buffer (RB)
Mannitol	Sigma	MX0214	For buffer (IB)
Microliter syringes			Sizes ranging from 5–50 µL
Microplate reader			Must be able to incubate at 37 °C
MOPS	Sigma	475898	For all buffers
O2 tank
OMNI THQ Homogenizer	OMNI International	12-500	Similar rotor stator homogenizers will work
pipettes			Volumes of  2–20 µL; 20–200 µL; 200–1000 µL
Potassium chloride	Sigma	P3911	For buffers (RB and CB)
Potassium phosphate dibasic	Sigma	795496	For buffers (IB and RB)
Protease from Bacillus licheniformis	Sigma	P5459
Sodium chloride	Sigma	S9888	For buffer (CB)
Sodium pyruvate	Fisher bioreagents	BP356-100	Respirometry assays
Sucrose	Sigma	8510-OP	For buffer (IB)
Surgical dissection kit			Depends on animal and tissue source
Tabletop centrifuge			Must cool to 4 °C