Robuste mitochondriale Isolierung aus Herzgewebe von Nagetieren

Zusammenfassung

Bioenergetische und metabolomische Studien an Mitochondrien haben ihre facettenreiche Rolle bei vielen Krankheiten gezeigt, aber die Isolierungsmethoden für diese Organellen variieren. Die hier beschriebene Methode ist in der Lage, hochwertige Mitochondrien aus mehreren Gewebequellen zu reinigen. Die Qualität wird durch Atemkontrollverhältnisse und andere Metriken bestimmt, die mit hochauflösender Respirometrie bewertet werden.

Zusammenfassung

Die mitochondriale Isolierung wird seit Jahrzehnten praktiziert, nach Verfahren, die von Pionieren auf dem Gebiet der Molekularbiologie und Biochemie entwickelt wurden, um metabolische Beeinträchtigungen und Krankheiten zu untersuchen. Eine gleichbleibende mitochondriale Qualität ist notwendig, um die mitochondriale Physiologie und Bioenergetik richtig zu untersuchen; Für Forschende stehen jedoch viele verschiedene veröffentlichte Isolationsmethoden zur Verfügung. Obwohl unterschiedliche experimentelle Strategien unterschiedliche Isolationsmethoden erfordern, sind die Grundprinzipien und Verfahren ähnlich. Dieses Protokoll beschreibt eine Methode, die in der Lage ist, gut gekoppelte Mitochondrien aus einer Vielzahl von Gewebequellen, einschließlich Kleintieren und Zellen, zu extrahieren. Zu den skizzierten Schritten gehören die Organdissektion, die mitochondriale Reinigung, die Proteinquantifizierung und verschiedene Qualitätskontrollen. Die primäre Qualitätskontrollmetrik zur Identifizierung hochwertiger Mitochondrien ist das Respiratory Control Ratio (RCR). Die RCR ist das Verhältnis der Atemfrequenz während der oxidativen Phosphorylierung zur Rate in Abwesenheit von ADP. Alternative Metriken werden diskutiert. Während mit diesem Protokoll hohe RCR-Werte im Verhältnis zu ihrer Gewebequelle erzielt werden, können mehrere Schritte optimiert werden, um den individuellen Bedürfnissen der Forscher gerecht zu werden. Dieses Verfahren ist robust und hat durchweg zu isolierten Mitochondrien mit überdurchschnittlichen RCR-Werten in Tiermodellen und Gewebequellen geführt.

Einleitung

Mitochondrien sind subzelluläre Organellen, die zytoplasmatische energetische Bedingungen schaffen, die für bestimmte Zellfunktionen optimiert sind. Während Studien auf Zell-, Gewebe- und Organismusebene Einblicke in die mitochondriale Funktion geben können, bietet die Isolierung der Organellen ein Maß an experimenteller Kontrolle, das sonst nicht möglich wäre. Mitochondriale Isolierungen werden seit den 1940er Jahren durchgeführt, was mechanistische Untersuchungen des Stoffwechsels und der Atmung in einer Vielzahl von Zellen und Geweben ermöglicht ^1,2. Die historische Bedeutu....

Protokoll

Die Verwendung und Behandlung aller Wirbeltiere erfolgte in Übereinstimmung mit genehmigten Protokollen, die vom Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) an der Michigan State University überprüft und akzeptiert wurden. Dieses Protokoll wurde sowohl mit männlichen als auch mit weiblichen Hartley-Albino-Meerschweinchen und Sprague Dawley (SD)-Ratten entwickelt. Für die Isolierung von Herzmitochondrien aus Meerschweinchen wurden Tiere im Alter zwischen 4 und 6 Wochen (300-450 g) getötet. Herzmitochondrien von SD-Ratten beiderlei Geschlechts wurden im Alter von 10-13 Wochen (250-400 g) gewonnen. Rezepte für Puffer sind in

Diskussion

Die Einhaltung der in diesem Protokoll kurz beschriebenen Methoden wird die Isolierung gut gekoppelter Mitochondrien aus dem Herzgewebe kleiner Nagetiere sowie anderer Gewebetypen und -quellen gewährleisten. Insgesamt sollte der Prozess 3-3,5 Stunden dauern, während derer alle tierischen Gewebe, Proben und Isolate so weit wie möglich auf Eis bei 4 °C verbleiben sollten, um den Abbau zu begrenzen. Dieses Verfahren ist robust und kann auf verschiedene Weise geändert werden, um die exp.......

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
1.7 mL microcentrifuge tubes
10 mL glass beaker			For organ disection and mincing
50 mL centrifuge tubes			Centrifugation
Adenosine 5'-diphosphate monopotassium salt dihydrate	Sigma	A5285	Respirometry assays
BSA Protein Assay Kit	Thermo Scentific	PI23225	Mitochondrial protein quantification
Dextrose	Sigma	DX0145	For buffer (CB)
Ethylene glycol-bis(2-amino-ethylether)-N,N,N',N'-tetraacetic acid	Sigma	E4378	For buffers (CB and IB) and respirometry assays
Glass cannula	Radnoti		Guinea pig and rat heart perfusion
Heparin sodium porcine mucosa	Sigma	SRE0027-250KU	Animal IP injection
High-resolution respirometer			Clark-type electrode; oxygraph with 2 mL chambers
Induction chamber
Isoflurane	Sigma	792632	Anesthetic
L-malic acid	Sigma	02288-50G	Respirometry assays
Magnesium chloride hexahydrate	Sigma	M9272	For buffer (RB)
Mannitol	Sigma	MX0214	For buffer (IB)
Microliter syringes			Sizes ranging from 5–50 µL
Microplate reader			Must be able to incubate at 37 °C
MOPS	Sigma	475898	For all buffers
O2 tank
OMNI THQ Homogenizer	OMNI International	12-500	Similar rotor stator homogenizers will work
pipettes			Volumes of  2–20 µL; 20–200 µL; 200–1000 µL
Potassium chloride	Sigma	P3911	For buffers (RB and CB)
Potassium phosphate dibasic	Sigma	795496	For buffers (IB and RB)
Protease from Bacillus licheniformis	Sigma	P5459
Sodium chloride	Sigma	S9888	For buffer (CB)
Sodium pyruvate	Fisher bioreagents	BP356-100	Respirometry assays
Sucrose	Sigma	8510-OP	For buffer (IB)
Surgical dissection kit			Depends on animal and tissue source
Tabletop centrifuge			Must cool to 4 °C