Robusto isolamento mitocondriale dal tessuto cardiaco dei roditori

Riepilogo

Studi bioenergetici e metabolomici sui mitocondri hanno rivelato il loro ruolo multiforme in molte malattie, ma i metodi di isolamento per questi organelli variano. Il metodo qui descritto è in grado di purificare mitocondri di alta qualità da più fonti di tessuto. La qualità è determinata dai rapporti di controllo respiratorio e da altre metriche valutate con la respirometria ad alta risoluzione.

Abstract

L'isolamento mitocondriale è stato praticato per decenni, seguendo le procedure stabilite dai pionieri nel campo della biologia molecolare e della biochimica per studiare le menomazioni metaboliche e le malattie. Una qualità mitocondriale costante è necessaria per studiare correttamente la fisiologia mitocondriale e la bioenergetica; Tuttavia, sono disponibili per i ricercatori molti diversi metodi di isolamento pubblicati. Sebbene diverse strategie sperimentali richiedano metodi di isolamento diversi, i principi e le procedure di base sono simili. Questo protocollo descrive in dettaglio un metodo in grado di estrarre mitocondri ben accoppiati da una varietà di fonti tissutali, inclusi piccoli animali e cellule. Le fasi descritte includono la dissezione degli organi, la purificazione mitocondriale, la quantificazione delle proteine e vari controlli di qualità. La metrica primaria di controllo della qualità utilizzata per identificare i mitocondri di alta qualità è il rapporto di controllo respiratorio (RCR). L'RCR è il rapporto tra la frequenza respiratoria durante la fosforilazione ossidativa e la frequenza in assenza di ADP. Vengono discusse metriche alternative. Sebbene con questo protocollo si ottengano elevati valori di RCR rispetto alla loro fonte tissutale, diversi passaggi possono essere ottimizzati per soddisfare le esigenze individuali dei ricercatori. Questa procedura è robusta e ha costantemente portato a mitocondri isolati con valori RCR superiori alla media tra i modelli animali e le fonti tissutali.

Introduzione

I mitocondri sono organelli subcellulari che stabiliscono condizioni energetiche citoplasmatiche ottimizzate per specifiche funzioni cellulari. Mentre gli studi a livello cellulare, tissutale e di organismo possono fornire informazioni sulla funzione mitocondriale, l'isolamento degli organelli offre un livello di controllo sperimentale non possibile altrimenti. Gli isolamenti mitocondriali sono stati eseguiti a partire dagli anni '40, consentendo studi meccanicistici del metabolismo e della respirazione in una varietà di cellule e tessuti ^1,2. Anche la rilevanza storica dei mi....

Protocollo

L'uso e il trattamento di tutti gli animali vertebrati sono stati eseguiti in conformità con protocolli approvati e accettati dall'Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) presso la Michigan State University. Questo protocollo è stato progettato utilizzando porcellini d'India albini Hartley maschi e femmine e ratti Sprague Dawley (SD). Per l'isolamento dei mitocondri cardiaci dalle cavie, gli animali sono stati sacrificati ad età compresa tra 4 e 6 settimane (300-450 g). I mitocondri cardiaci di ratti SD di entrambi i sessi sono stati ottenuti tra le 10 e le 13 settimane (250-400 g). Le ricette per i tamponi sono descritte ....

Discussione

L'adesione ai metodi descritti in modo conciso in questo protocollo garantirà l'isolamento di mitocondri ben accoppiati dal tessuto cardiaco di piccoli roditori, oltre ad altri tipi di tessuto e fonti. Nel complesso, il processo dovrebbe durare un totale di 3-3,5 ore, durante le quali tutti i tessuti, i campioni e gli isolati animali dovrebbero rimanere in ghiaccio a 4 °C il più possibile per limitare la degradazione. Questa procedura è robusta e può essere modificata in diversi mod.......

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
1.7 mL microcentrifuge tubes
10 mL glass beaker			For organ disection and mincing
50 mL centrifuge tubes			Centrifugation
Adenosine 5'-diphosphate monopotassium salt dihydrate	Sigma	A5285	Respirometry assays
BSA Protein Assay Kit	Thermo Scentific	PI23225	Mitochondrial protein quantification
Dextrose	Sigma	DX0145	For buffer (CB)
Ethylene glycol-bis(2-amino-ethylether)-N,N,N',N'-tetraacetic acid	Sigma	E4378	For buffers (CB and IB) and respirometry assays
Glass cannula	Radnoti		Guinea pig and rat heart perfusion
Heparin sodium porcine mucosa	Sigma	SRE0027-250KU	Animal IP injection
High-resolution respirometer			Clark-type electrode; oxygraph with 2 mL chambers
Induction chamber
Isoflurane	Sigma	792632	Anesthetic
L-malic acid	Sigma	02288-50G	Respirometry assays
Magnesium chloride hexahydrate	Sigma	M9272	For buffer (RB)
Mannitol	Sigma	MX0214	For buffer (IB)
Microliter syringes			Sizes ranging from 5–50 µL
Microplate reader			Must be able to incubate at 37 °C
MOPS	Sigma	475898	For all buffers
O2 tank
OMNI THQ Homogenizer	OMNI International	12-500	Similar rotor stator homogenizers will work
pipettes			Volumes of  2–20 µL; 20–200 µL; 200–1000 µL
Potassium chloride	Sigma	P3911	For buffers (RB and CB)
Potassium phosphate dibasic	Sigma	795496	For buffers (IB and RB)
Protease from Bacillus licheniformis	Sigma	P5459
Sodium chloride	Sigma	S9888	For buffer (CB)
Sodium pyruvate	Fisher bioreagents	BP356-100	Respirometry assays
Sucrose	Sigma	8510-OP	For buffer (IB)
Surgical dissection kit			Depends on animal and tissue source
Tabletop centrifuge			Must cool to 4 °C