Robusto isolamento mitocondriale dal tessuto cardiaco dei roditori

Riepilogo

Studi bioenergetici e metabolomici sui mitocondri hanno rivelato il loro ruolo multiforme in molte malattie, ma i metodi di isolamento per questi organelli variano. Il metodo qui descritto è in grado di purificare mitocondri di alta qualità da più fonti di tessuto. La qualità è determinata dai rapporti di controllo respiratorio e da altre metriche valutate con la respirometria ad alta risoluzione.

Abstract

L'isolamento mitocondriale è stato praticato per decenni, seguendo le procedure stabilite dai pionieri nel campo della biologia molecolare e della biochimica per studiare le menomazioni metaboliche e le malattie. Una qualità mitocondriale costante è necessaria per studiare correttamente la fisiologia mitocondriale e la bioenergetica; Tuttavia, sono disponibili per i ricercatori molti diversi metodi di isolamento pubblicati. Sebbene diverse strategie sperimentali richiedano metodi di isolamento diversi, i principi e le procedure di base sono simili. Questo protocollo descrive in dettaglio un metodo in grado di estrarre mitocondri ben accoppiati da una varietà di fonti tissutali, inclusi piccoli animali e cellule. Le fasi descritte includono la dissezione degli organi, la purificazione mitocondriale, la quantificazione delle proteine e vari controlli di qualità. La metrica primaria di controllo della qualità utilizzata per identificare i mitocondri di alta qualità è il rapporto di controllo respiratorio (RCR). L'RCR è il rapporto tra la frequenza respiratoria durante la fosforilazione ossidativa e la frequenza in assenza di ADP. Vengono discusse metriche alternative. Sebbene con questo protocollo si ottengano elevati valori di RCR rispetto alla loro fonte tissutale, diversi passaggi possono essere ottimizzati per soddisfare le esigenze individuali dei ricercatori. Questa procedura è robusta e ha costantemente portato a mitocondri isolati con valori RCR superiori alla media tra i modelli animali e le fonti tissutali.

Introduzione

I mitocondri sono organelli subcellulari che stabiliscono condizioni energetiche citoplasmatiche ottimizzate per specifiche funzioni cellulari. Mentre gli studi a livello cellulare, tissutale e di organismo possono fornire informazioni sulla funzione mitocondriale, l'isolamento degli organelli offre un livello di controllo sperimentale non possibile altrimenti. Gli isolamenti mitocondriali sono stati eseguiti a partire dagli anni '40, consentendo studi meccanicistici del metabolismo e della respirazione in una varietà di cellule e tessuti ^1,2. Anche la rilevanza storica dei mitocondri è ben documentata³. In qualità di principali produttori di ATP, i mitocondri svolgono molti ruoli chiave che sono vitali per una funzione cellulare e d'organo ottimale⁴. All'interno della matrice mitocondriale, i substrati vengono ossidati dal ciclo TCA, producendo equivalenti riducenti e portatori elettronici mobili come NADH e UQH₂ ^5,6. Il citocromo C è il terzo principale trasportatore di elettroni mobili nella rete di reazioni biochimiche mitocondriali⁷. Queste molecole vengono poi ossidate dai complessi transmembrana del sistema di trasporto degli elettroni (ETS) incorporati nella membrana mitocondriale interna⁸. Le reazioni redox dell'ETS sono accoppiate con la traslocazione del protone dalla matrice allo spazio intermembrana. Questi processi stabiliscono un gradiente elettrochimico di protoni che viene utilizzato per fosforilare ADP con Pi da F₁F₀ ATP sintasi per produrre ATP ^9,10. I singoli processi che si verificano in ciascun complesso possono essere esplorati con la respirometria ad alta risoluzione utilizzando elettrodi di tipo Clark o saggi di consumo di ossigeno su micropiastra^11,12. Inoltre, i modelli di malattia e i trattamenti che utilizzano mitocondri isolati possono determinare l'impatto o l'importanza della funzione mitocondriale nella progressione di alcune patologie. Ciò si è dimostrato fruttuoso nel campo della cardiologia, dove le alterazioni nel rilascio di carburante e substrato sono state utilizzate per chiarire come la disfunzione mitocondriale influenzi l'insufficienza cardiaca 13,14,15,16. I mitocondri sono anche noti per avere un impatto sullo sviluppo di altri stati patologici come diabete, cancro, obesità, disturbi neurologici e miopatie ^17,18. Pertanto, l'uso di mitocondri isolati o purificati consente indagini meccanicistiche sul metabolismo ossidativo e sulla produzione di ATP nel tessuto di origine.

Non mancano i protocolli di isolamento mitocondriale per la loro importanza nella ricerca bioenergetica. Inoltre, si possono trovare metodi altamente specifici su misura per sottopopolazioni di mitocondri all'interno di tessuti e cellule^19,20. Le fasi procedurali di base sono simili tra i metodi di isolamento, ma è possibile apportare variazioni alla composizione del tampone, alle fasi di omogeneizzazione e agli spin di centrifugazione per migliorare la quantità e la qualità dei mitocondri. Le modifiche a questi aspetti si basano sulla domanda metabolica del tessuto, sulla funzione generale degli organi, sulla densità mitocondriale e su altri fattori. In tessuti come il fegato e il muscolo scheletrico, gli omogeneizzatori portatili vengono utilizzati per preservare l'integrità mitocondriale e limitare i danni alle membrane mitocondriali²¹. Tuttavia, quando si isola dai reni, alcuni protocolli suggeriscono di utilizzare l'omogeneizzazione manuale o kit commerciali per ottenere risultati migliori²². Sebbene entrambi i metodi producano mitocondri funzionali, la qualità degli organelli può essere compromessa dal tempo aggiuntivo necessario per completare gli isolamenti utilizzando questi protocolli. La centrifugazione è anche vitale per l'estrazione della proteina mitocondriale, in quanto separa i componenti cellulari come nuclei e altri organelli dai mitocondri²³. Durante il processo di isolamento, si discute se la centrifugazione differenziale o basata sulla densità debba essere implementata per ottenere isolati più puri²⁴. Mentre la centrifugazione per densità può separare i mitocondri da organelli di peso specifico simile, come i perossisomi, non è ben stabilito se i mitocondri di questi metodi rappresentino meglio la funzione degli organelli in situ rispetto ai mitocondri isolati utilizzando la centrifugazione differenziale. Nel campo della fisiologia mitocondriale, la centrifugazione basata sulla densità è preferita e può essere facilmente modificata per aumentare la purezza dell'isolato. Prima della sperimentazione è necessario considerare se sono incorporate le modifiche alle forze g, alla durata della centrifugazione e al numero di spin di centrifugazione a causa della loro influenza sulla purificazione mitocondriale. Inoltre, la risospensione mitocondriale, probabilmente la fase più cruciale durante l'isolamento, differisce notevolmente tra gli studi, con l'uso di raschiatura, miscelazione basata su vortici o omogeneizzazione 23,25,26. La risospensione meccanica di questi tipi può essere troppo abrasiva e compromettere l'integrità della membrana dei mitocondri. Per questo motivo, è necessario eseguire un lavaggio delicato per correggere questo problema. Nonostante la pletora di modulazioni e metodologie suggerite, ci sono meno protocolli completi con un'elevata riproducibilità e adattabilità per i modelli di roditori.

I metodi qui descritti delineano un protocollo dettagliato, robusto e altamente riproducibile che produce mitocondri purificati e ben accoppiati da tessuto cardiaco di piccoli animali. Come dimostrato, questo metodo può essere facilmente adattato per soddisfare le esigenze specifiche di ogni esperimento e/o ambiente di laboratorio per isolare i mitocondri da reni, fegato e cellule in coltura. Ulteriori modifiche possono essere apportate per isolare i mitocondri da tessuti e altri animali non elencati qui. Vengono fornite le ricette del buffer utilizzate per tutti gli isolamenti e possono essere modificate se necessario. Analogamente ad altri protocolli pubblicati, vengono implementate l'omogeneizzazione motorizzata e la centrifugazione differenziale; Tuttavia, vengono apportate regolazioni sia al tempo di taglio che alla forza con cui i campioni vengono centrifugati per fornire costantemente isolati mitocondriali di alta qualità, a seconda della fonte di isolamento. In particolare, questo protocollo si differenzia dagli altri per l'utilizzo di un lavaggio delicato tramite pipettaggio per risospendere i mitocondri pellettati, che aiuta a preservare l'integrità della membrana mitocondriale e a mantenere la funzionalità complessiva degli organelli. La proteina mitocondriale viene quantificata mediante determinazione della proteina totale o misurazione dell'attività della citrato sintasi. L'utilità e l'ampia applicabilità di questo metodo di isolamento sono ulteriormente supportate dai valori dei rapporti di controllo respiratorio (RCR) raggiunti in vari organismi e fonti tissutali.

Protocollo

L'uso e il trattamento di tutti gli animali vertebrati sono stati eseguiti in conformità con protocolli approvati e accettati dall'Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) presso la Michigan State University. Questo protocollo è stato progettato utilizzando porcellini d'India albini Hartley maschi e femmine e ratti Sprague Dawley (SD). Per l'isolamento dei mitocondri cardiaci dalle cavie, gli animali sono stati sacrificati ad età compresa tra 4 e 6 settimane (300-450 g). I mitocondri cardiaci di ratti SD di entrambi i sessi sono stati ottenuti tra le 10 e le 13 settimane (250-400 g). Le ricette per i tamponi sono descritte nella Tabella 1 e devono essere preparate in anticipo. I dettagli dei reagenti e delle attrezzature utilizzate in questo studio sono elencati nella Tabella dei materiali.

1. Preparazione sperimentale

1. Prima di iniziare l'isolamento, etichettare due provette da centrifugazione da 50 ml come "Spins 1 and 2" e "Spin 3".
2. Posizionare sul ghiaccio le provette, il tampone di isolamento (IB) appena scongelato, le forbici affilate per tritare, la sonda di omogeneizzazione assemblata e un becher da 5 ml o un contenitore di dimensioni equivalenti.
3. Posizionare il tampone respiratorio (RB) appena scongelato in un'incubatrice per riscaldarlo per i successivi saggi respiratori.
4. Pre-raffreddare una centrifuga refrigerata a 4 °C.
5. Assicurarsi che tutte le apparecchiature siano predisposte e che 20 μL di proteasi 7-15 U/mg di Bacillus licheniformis siano stati aggiunti alla provetta etichettata con "Spins 1 and 2".
6. Installare un sistema di pressione dipendente dalla gravità per la perfusione tramite incannulamento utilizzando un tampone per cardioplegia (CB, Tabella 1), una cannula di vetro e un tubo di plastica con una valvola di arresto collegata.
7. Disporre gli strumenti chirurgici e includere forbici e pinze adeguate per la dissezione e l'incannulamento del cuore.
   NOTA: Tutta l'acqua deve essere di qualità pura (18,2 MΩ·cm)

2. Dissezione tissutale

1. Iniettare agli animali eparina solfato sterile per via intraperitoneale alla dose di 500 U/kg.
2. Lasciare riposare l'animale nella camera di induzione per 15 minuti dopo la somministrazione di eparina. Durante questo periodo, fornire 2 L/min di gas O₂ puro per ossigenare completamente gli animali, calmarli e ridurre al minimo lo stress che potrebbe avere conseguenze negative sui tessuti di interesse.
3. Iniziare l'induzione dell'anestesia con un flusso continuo di isoflurano allo 0,5%. Dopo 1 minuto, aumentare all'1%. Continuare ad aumentare dell'1% ogni minuto fino a raggiungere il 5%. Una volta raggiunto il 5%, attendi 1 minuto e monitora il modello di respirazione dell'animale.
4. Una volta che la respirazione è rallentata e diventa affannosa (approssimativamente al minuto 6,5), spegnere l'isoflurano e il flusso di ossigeno.
5. Rimuovere rapidamente l'animale dalla camera di induzione e verificare la profondità dell'anestesia appropriata stringendo una zampa e controllando il riflesso corneale. Se l'animale risponde a uno degli stimoli, riposizionarlo nella camera di induzione, somministrare nuovamente l'anestesia e ripetere il controllo della profondità dell'anestesia.
6. Una volta raggiunta la corretta profondità di anestesia, decapitare rapidamente con una ghigliottina per sezionare il rachide cervicale e posizionare il corpo prono sul ghiaccio.
7. Praticare due incisioni verticali parallele dalle clavicole procedendo lungo la gabbia toracica laterale lungo la lunghezza del torace. Assicurati che le incisioni siano abbastanza profonde da tagliare le costole sul torace laterale, ma evita di danneggiare le strutture intratoraciche come il cuore o i grandi vasi.
   NOTA: Le dimensioni dell'incisione verticale dipendono dall'animale utilizzato. Se si utilizzano porcellini d'India e ratti, tagliare fino al diaframma (circa 6,35 cm per i ratti e 11 cm per i porcellini d'India). Se si utilizzano topi, eseguire una toracotomia standard²⁷.
8. Esporre il cuore usando un emostatico per spostare il torace anteriore e riempire la cavità toracica esposta con ghiaccio. Questo passaggio riduce al minimo il tempo di ischemia calda e migliora la vitalità degli organelli isolati.
9. Usa le pinzette per sezionare senza mezzi termini il timo e il pericardio ed esporre completamente il cuore.
10. Usando il forcipe, applicare una leggera trazione inferiore sul cuore per esporre e identificare l'aorta. L'aorta è il grande vaso più spesso che si dirama dalla base del cuore. Altri vasi di grandi dimensioni, come la vena polmonare, sono notevolmente più traslucidi dell'aorta.
11. Tagliare l'aorta a circa 4-6 mm sopra la radice aortica ma al di sotto dei punti di ramificazione carotidea.
12. Incannulare l'aorta e perfondere il cuore^28,29 con una soluzione di cardioplegia ghiacciata (CB) utilizzando una testina di pressione dipendente dalla gravità fino a quando le arterie coronarie non sono ripulite dal sangue e l'organo appare sbiancato.
    NOTA: Per i roditori di grandi dimensioni, un diametro della cannula di 1,8-2,2 mm funziona bene, mentre per i roditori più piccoli si consiglia un intervallo di diametri di 1,4-1,8 mm. La retroperfusione non dovrebbe richiedere più di 15-30 secondi perché i vasi coronarici si liberino dal sangue.
13. Isolare il miocardio ventricolare sezionando gli atri, il tessuto valvolare cartilagineo e i tessuti adiposi.
14. Porre i ventricoli in un becher da 10 ml pre-raffreddato contenente 0,1-0,2 ml di IB ghiacciato.
15. Tritare il fazzoletto con forbici chirurgiche affilate fino a quando i pezzi sono di circa 1 mm³.

3. Purificazione mitocondriale e quantificazione delle proteine

1. Trasferire il tessuto tritato nella provetta da centrifuga pre-raffreddata etichettata "Spins 1 and 2" contenente la soluzione di proteasi.
2. Aggiungere IB ghiacciato a un volume finale di 25 ml.
3. Utilizzando un omogeneizzatore rotore-statore portatile motorizzato, disperdere il tessuto a 18.000 giri/min su ghiaccio per 20-25 s.
4. Centrifugare il tessuto omogeneizzato in una provetta etichettata "Spins 1 and 2" a 8.000 x g per 10 minuti a 4 °C.
5. Scartare il surnatante (che contiene proteasi) versandolo nella damigiana di scarto e sciacquare delicatamente il pellet con 5 ml di IB per rimuovere la proteasi residua.
6. Dopo aver eliminato il risciacquo, risospendere il pellet con IB fresco ghiacciato fino a un volume finale di 25 mL con un leggero vortice.
7. Centrifugare a 800 x g per 10 min a 4 °C.
8. Rimuovere il surnatante (contiene mitocondri) versandolo delicatamente in una provetta da 50 ml pre-raffreddata etichettata "Spin 3". Durante il versamento, fare attenzione a non rimuovere la parte superiore del pellet allentata. In alternativa, è possibile utilizzare una pipetta di trasferimento o una stripette per raccogliere il surnatante.
9. Centrifugare il surnatante a 8000 x g per 10 minuti a 4 °C.
10. Scartare il surnatante risultante e conservare il pellet contenente mitocondri.
11. Utilizzare un panno privo di lanugine per assorbire il surnatante in eccesso dalla parete interna del tubo, facendo attenzione a non disturbare il pellet. Mantenere il pellet a 4 °C sul ghiaccio il più possibile.
12. Per risospendere i mitocondri, aggiungere 80 μL di IB ghiacciato sul fondo della provetta. Risospendere delicatamente il pellet lavando ripetutamente IB sul pellet.
13. Per evitare la formazione di bolle, impostare una micropipetta per aspirare ed erogare tra 40 e 60 μl di volume.
14. Man mano che il pellet mitocondriale si disperde, aumentare il volume della micropipetta per risospendere in modo efficiente i mitocondri pellettati. Evitare di toccare il pellet con la punta della pipetta ed evitare di formare bolle.
15. Una volta risospesi, trasferire i mitocondri in una provetta da microcentrifuga pre-raffreddata ed etichettarla come mitocondri di serie. Prendere nota del volume totale di risospensione.
16. Per determinare la concentrazione di proteine mitocondriali nel campione, eseguire un test delle proteine totali utilizzando i noti dosaggi delle proteine BCA o Bradford, come definito dalle istruzioni del produttore.
    NOTA: Una strategia alternativa o complementare per valutare la resa consiste nel determinare l'attività della citrato sintasi. Per riferimento, il contenuto mitocondriale può essere quantificato seguendo il protocollo descritto in Vinnakota et ^al.30.

4. Controlli di qualità

1. In una provetta da microcentrifuga pre-raffreddata, diluire il brodo mitocondriale alla concentrazione di lavoro desiderata con IB.
   NOTA: Le scorte mitocondriali vengono diluite a 40 mg/mL per lavorare alla concentrazione finale di 0,1 mg/mL per i saggi respirometrici quando si utilizzano isolati da tessuto cardiaco.
2. Sciacquare dieci volte le camere dell'ossigrafo, i tappi e le siringhe da microlitri con acqua distillata per pulirle prima dell'uso nei saggi di respirometria.
3. Per testare la vitalità e la qualità degli isolati mitocondriali, caricare 2,3 mL di tampone respiratorio (RB) in camere ossigrafiche e lasciare che il segnale di consumo di ossigeno si equilibri a 37 °C per circa 10 minuti o quando la velocità è vicina allo 0.
4. Una volta che il segnale è equilibrato, spingere verso il basso i tappi e aspirare il tampone in eccesso che fuoriesce dal capillare del tappo.
5. Aggiungere 1 mM di EGTA utilizzando una siringa da microlitro per chelare l'eventuale residuo di calcio nei tamponi o nel campione mitocondriale.
6. Per alimentare la respirazione, aggiungere 5 mM di piruvato di sodio e 1 mM di L-malato.
7. Dopo l'aggiunta di substrati, aggiungere un bolo di mitocondri diluiti per raggiungere la concentrazione di lavoro e consentire la respirazione per 5 minuti. Questo periodo è chiamato LEAK o respirazione di Stato 2.
8. Al segno dei 5 minuti, aggiungere un bolo di 500 μM di ADP per avviare la respirazione dello Stato 3, chiamata anche OXHPOS, e lasciare che i mitocondri respirino fino all'anossia.
9. Calcolare il rapporto di controllo respiratorio (RCR) dividendo il tasso massimo di consumo di ossigeno durante lo Stato 3 per il tasso di consumo di ossigeno appena prima dell'aggiunta di ADP nello Stato 2 (vedere Figura 1).
   NOTA: Un'espressione RCR alternativa di 1 - 1/RCR può essere utilizzata anche come metrica di qualità, che è limitata tra 0 e 1; tuttavia, rende difficile differenziare la qualità utilizzando questa metrica quando l'RCR > 10 (vedere la Figura 2).
10. Sciacquare le camere e i tappi 10 volte con acqua pura per pulire l'ossigrafo per i saggi successivi. Se la respirometria è completa, riempire le camere con etanolo al 70% e posizionare i tappi nelle camere fino al successivo utilizzo.

Risultati

Al termine dell'isolamento mitocondriale, la qualità e la funzionalità degli isolati devono essere testate quantificando i tassi di consumo di ossigeno (J_O2) utilizzando la respirometria ad alta risoluzione. A tal fine, le scorte mitocondriali sono state diluite a 40 mg/mL per consentire concentrazioni di lavoro di 0,1 mg/mL in 2 mL di RB per tutti i test respirometrici utilizzando mitocondri cardiaci isolati. La respirazione è stata alimentata da 5 mM di piruvato ...

Discussione

L'adesione ai metodi descritti in modo conciso in questo protocollo garantirà l'isolamento di mitocondri ben accoppiati dal tessuto cardiaco di piccoli roditori, oltre ad altri tipi di tessuto e fonti. Nel complesso, il processo dovrebbe durare un totale di 3-3,5 ore, durante le quali tutti i tessuti, i campioni e gli isolati animali dovrebbero rimanere in ghiaccio a 4 °C il più possibile per limitare la degradazione. Questa procedura è robusta e può essere modificata in diversi mod...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
1.7 mL microcentrifuge tubes
10 mL glass beaker			For organ disection and mincing
50 mL centrifuge tubes			Centrifugation
Adenosine 5'-diphosphate monopotassium salt dihydrate	Sigma	A5285	Respirometry assays
BSA Protein Assay Kit	Thermo Scentific	PI23225	Mitochondrial protein quantification
Dextrose	Sigma	DX0145	For buffer (CB)
Ethylene glycol-bis(2-amino-ethylether)-N,N,N',N'-tetraacetic acid	Sigma	E4378	For buffers (CB and IB) and respirometry assays
Glass cannula	Radnoti		Guinea pig and rat heart perfusion
Heparin sodium porcine mucosa	Sigma	SRE0027-250KU	Animal IP injection
High-resolution respirometer			Clark-type electrode; oxygraph with 2 mL chambers
Induction chamber
Isoflurane	Sigma	792632	Anesthetic
L-malic acid	Sigma	02288-50G	Respirometry assays
Magnesium chloride hexahydrate	Sigma	M9272	For buffer (RB)
Mannitol	Sigma	MX0214	For buffer (IB)
Microliter syringes			Sizes ranging from 5–50 µL
Microplate reader			Must be able to incubate at 37 °C
MOPS	Sigma	475898	For all buffers
O2 tank
OMNI THQ Homogenizer	OMNI International	12-500	Similar rotor stator homogenizers will work
pipettes			Volumes of  2–20 µL; 20–200 µL; 200–1000 µL
Potassium chloride	Sigma	P3911	For buffers (RB and CB)
Potassium phosphate dibasic	Sigma	795496	For buffers (IB and RB)
Protease from Bacillus licheniformis	Sigma	P5459
Sodium chloride	Sigma	S9888	For buffer (CB)
Sodium pyruvate	Fisher bioreagents	BP356-100	Respirometry assays
Sucrose	Sigma	8510-OP	For buffer (IB)
Surgical dissection kit			Depends on animal and tissue source
Tabletop centrifuge			Must cool to 4 °C