从啮齿动物心脏组织中稳健地分离线粒体

摘要

线粒体的生物能量和代谢组学研究揭示了它们在许多疾病中的多方面作用，但这些细胞器的分离方法各不相同。此处详述的方法能够从多个组织来源纯化高质量的线粒体。质量由呼吸控制比率和高分辨率呼吸测定法评估的其他指标决定。

摘要

线粒体分离已经实践了几十年，遵循分子生物学和生物化学领域的先驱建立的程序来研究代谢损伤和疾病。一致的线粒体质量对于正确研究线粒体生理学和生物能量学是必要的;但是，研究人员可以使用许多不同的已发表的分离方法。尽管不同的实验策略需要不同的分离方法，但基本原理和程序是相似的。该协议详细介绍了一种能够从各种组织来源（包括小动物和细胞）中提取良好耦合的线粒体的方法。概述的步骤包括器官解剖、线粒体纯化、蛋白质定量和各种质量控制检查。用于识别高质量线粒体的主要质量控制指标是呼吸控制比率 （RCR）。RCR 是氧化磷酸化期间的呼吸频率与无 ADP 时的呼吸频率之比。讨论了其他指标。虽然使用该方案可以获得相对于其组织来源的高 RCR 值，但可以优化几个步骤以满足研究人员的个性化需求。该程序是稳健的，并且始终导致分离的线粒体在动物模型和组织来源中具有高于平均水平的 RCR 值。

引言

线粒体是亚细胞器，可建立针对特定细胞功能优化的细胞质能量条件。虽然细胞、组织和生物体水平的研究可以提供对线粒体功能的见解，但分离细胞器提供了其他方式无法实现的实验控制水平。自 1940 年代以来，一直在进行线粒体分离，从而可以对各种细胞和组织的代谢和呼吸机制进行研究 ^1,2。线粒体的历史相关性也有据可查³。作为 ATP 的主要生产者，线粒体发挥着许多关键作用，这些作用对最佳细胞和器官功能至关重要⁴。在线粒体基质中，底物被 TCA 循环氧化，产生还原当量和移动电子载体，如 NADH 和 UQH₂ ^5,6。细胞色素 C 是线粒体生化反应网络中的第三个主要移动电子载体⁷。然后，这些分子被嵌入线粒体内膜中的电子传递系统 （ETS） 的跨膜复合物氧化⁸。ETS 的氧化还原反应与质子从基质到膜间空间的易位耦合。这些过程建立了一个电化学质子梯度，用于通过 F₁F₀ ATP 合酶用 Pi 磷酸化 ADP，从而产生 ATP ^9,10。每个复合物发生的各个过程可以使用 Clark 型电极或微孔板耗氧测定法通过高分辨率呼吸测定法进行探索^11,12。此外，使用分离线粒体的疾病模型和治疗可以确定线粒体功能在某些病理进展中的影响或重要性。这在心脏病学领域已被证明是卓有成效的，其中燃料和底物输送的改变已被用于阐明线粒体功能障碍如何影响心力衰竭 13,14,15,16。线粒体还已知会影响其他疾病状态的发展，例如糖尿病、癌症、肥胖、神经系统疾病和肌病^17,18。因此，使用分离或纯化的线粒体可以对源组织中氧化代谢和 ATP 产生的机制进行研究。

由于线粒体分离方案在生物能量研究中的重要性，因此不乏线粒体分离方案。此外，还可以找到针对组织和细胞内线粒体亚群量身定制的高度特异性方法^19,20。分离方法之间的基本程序步骤相似，但可以对缓冲液组成、均质化步骤和离心离心进行更改，以提高线粒体的数量和质量。这些方面的变化基于组织的代谢需求、整体器官功能、线粒体密度和其他因素。在肝脏和骨骼肌等组织中，手持式匀浆器用于保持线粒体完整性并限制对线粒体膜的损伤²¹。然而，当从肾脏中分离时，一些方案建议使用手动驱动的均质化或商业试剂盒来产生更好的结果²²。尽管这两种方法都能产生功能性线粒体，但使用这些方案完成分离所需的额外时间可能会损害细胞器的质量。离心对于线粒体蛋白的提取也至关重要，因为它将细胞核和其他细胞器等细胞成分与线粒体分离²³。在分离过程中，存在争论是否应实施基于差异或基于密度的离心以获得更纯的分离物²⁴。虽然密度离心可以将线粒体与具有相似比重的细胞器（例如过氧化物酶体）分离，但与使用差速离心分离的线粒体相比，来自这些方法的线粒体是否能更好地代表原位细胞器功能，则尚不明确。在线粒体生理学领域，基于密度的离心是首选，并且可以很容易地改变以提高分离物的纯度。由于它们对线粒体纯化的影响，因此在实验前应考虑是否掺入 g 力、离心持续时间和离心旋转次数的变化。此外，线粒体重悬可以说是分离过程中最关键的步骤，在研究之间差异很大，使用刮擦、基于涡旋的混合或均质化 23,25,26。这些类型的机械重悬可能过于磨蚀并损害线粒体的膜完整性。因此，应进行温和的洗涤以纠正这种情况。尽管有大量的调制和建议的方法，但对啮齿动物模型具有高重现性和适应性的综合协议较少。

本文描述的方法概述了一种详细、稳健且高度可重复的方案，该方案从小动物心脏组织中产生纯化的、良耦合的线粒体。如前所述，该方法可以很容易地适应每个实验和/或实验室环境的特定需求，以便从肾脏、肝脏和培养细胞中分离线粒体。可以进行进一步的修改以从此处未列出的组织和其他动物中分离线粒体。提供了用于所有分离的缓冲液配方，并可根据需要进行修改。与其他已发布的方案类似，实施了电动均质化和差速离心;但是，根据分离源的不同，对剪切时间和样品离心力进行了调整，以始终如一地提供高质量的线粒体分离物。值得注意的是，该方案与其他方案的不同之处在于， 通过 移液使用温和洗涤来重悬沉淀的线粒体，这有助于保持线粒体膜的完整性并维持细胞器的整体功能。线粒体蛋白通过总蛋白测定或测量柠檬酸盐合酶活性进行定量。这种分离方法的实用性和广泛适用性得到了在各种生物体和组织来源中实现的呼吸控制比率 （RCR） 值的进一步支持。

研究方案

所有脊椎动物的使用和治疗均按照密歇根州立大学机构动物护理和使用委员会 （IACUC） 审查和接受的批准方案进行。该方案是使用雄性和雌性 Hartley 白化豚鼠和 Sprague Dawley （SD） 大鼠设计的。为了从豚鼠中分离心脏线粒体，在 4-6 周龄 （300-450 g） 时处死动物。在 10-13 周龄 （250-400 g） 之间获得两性 SD 大鼠的心脏线粒体。缓冲液的配方如 表 1 所述，应提前准备。本研究中使用的试剂和设备的详细信息列在 材料表中。

1. 实验准备

1. 在开始分离之前，将两个 50 mL 离心管标记为"Spin 1 和 2"和"Spin 3"。
2. 将试管、新鲜解冻的分离缓冲液 （IB）、锋利的切碎剪刀、组装好的均质探针和 5 mL 烧杯或同等大小的容器放在冰上。
3. 将新鲜解冻的呼吸缓冲液 （RB） 放入培养箱中加热，以便进行后续的呼吸检测。
4. 将冷冻离心机预冷至 4 °C。
5. 确保所有设备都已布置好，并且已将 20 μL 来自 地衣芽孢杆菌 的 7-15 U/mg 蛋白酶添加到标有"旋转 1 和 2"的试管中。
6. 使用心脏停搏缓冲液（CB，表 1）、玻璃套管和附有旋塞阀的塑料管，设置一个重力依赖性压力系统，用于通过插管进行灌注。
7. 安排手术工具，并包括用于心脏解剖和插管的适当剪刀和镊子。
   注意:所有水应为纯水质 （18.2 MΩ·cm）

2. 组织解剖

1. 以 500 U/kg 的剂量腹膜内注射无菌硫酸肝素给动物。
2. 肝素给药后，让动物在诱导室中坐 15 分钟。在此期间，提供 2 L/min 的纯 O₂ 气体，以充分充氧，使动物平静下来，并最大限度地减少可能对感兴趣组织产生不利影响的任何压力。
3. 通过连续流出 0.5% 的异氟醚开始麻醉诱导。1 分钟后，增加到 1%。继续每分钟增加 1%，直到达到 5%。一旦达到 5%，等待 1 分钟并监测动物的呼吸模式。
4. 一旦呼吸减慢并变得费力（大约在 6.5 分钟标记处），关闭异氟醚和氧气流动。
5. 快速将动物从诱导室中取出，并通过挤压爪子并检查角膜反射来检查适当的麻醉深度。如果动物对任一刺激有反应，则将其放回诱导室，重新施用麻醉，并重复麻醉深度检查。
6. 一旦达到适当的麻醉深度，用断头台迅速斩首以严重治疗颈椎，并将俯卧的身体放在冰上。
7. 从锁骨上做两个平行的垂直切口，沿着外侧肋骨沿着胸部的长度向下延伸。确保切口足够深以切开侧胸上的肋骨，但要避免损坏胸腔内结构，例如心脏或大血管。
   注意:垂直切口的大小取决于所使用的动物。如果使用豚鼠和大鼠，切开到隔膜（大鼠约 6.35 厘米，豚鼠约 11 厘米）。如果使用小鼠，请进行标准的开胸术²⁷。
8. 使用止血钳暴露心脏以移位前胸，并用冰填充暴露的胸腔。此步骤最大限度地减少了热缺血时间并增强了分离细胞器的活力。
9. 用镊子钝头解剖胸腺和心包，充分露出心脏。
10. 使用镊子，对心脏施加轻柔的下牵引，以暴露和识别主动脉。主动脉是从心脏底部分支出来的最厚的大血管。其他大血管，例如肺静脉，明显比主动脉更透明。
11. 在主动脉根部上方但颈动脉分支点下方约 4-6 毫米处切开主动脉。
12. 使用重力依赖性压力头将主动脉插管并用冰冷的心脏停搏 （CB） 溶液灌注心脏^28,29，直到冠状动脉清除血液并且器官看起来发白。
    注意:对于大型啮齿动物，1.8-2.2 毫米的套管直径效果很好，而对于较小的啮齿动物，建议使用 1.4-1.8 毫米的直径范围。后灌注应不超过 15-30 秒，冠状动脉血管清除血液。
13. 通过解剖心房、软骨瓣膜组织和脂肪组织来分离心室心肌。
14. 将心室放入预冷的 10 mL 烧杯中，其中含有 0.1-0.2 mL 冰冷的 IB。
15. 用锋利的手术剪刀切碎组织，直到碎片约为 1 毫米³。

3. 线粒体纯化和蛋白质定量

1. 将切碎的组织转移到标有"Spins 1 和 2"的预冷离心管中，离心管中含有蛋白酶溶液。
2. 加入冰冷的 IB 至最终体积为 25 mL。
3. 使用电动手持式转子定子匀浆器，将组织以 18,000 rpm 的速度分散在冰上 20-25 秒。
4. 在 4 °C 下以 8,000 x g 的速度将标有"Spins 1 和 2"的试管中的匀浆组织离心 10 分钟。
5. 将上清液（含有蛋白酶）倒入废大瓶中，丢弃上清液，然后用 5 mL IB 轻轻冲洗沉淀以去除残留的蛋白酶。
6. 丢弃冲洗液后，通过轻轻涡旋，用新鲜的冰冷 IB 重悬沉淀至最终体积为 25 mL。
7. 在 4 °C 下以 800 x g 离心 10 分钟。
8. 将上清液（含有线粒体）轻轻倒入标有"Spin 3"的预冷 50 mL 试管中，去除上清液（含有线粒体）。倾倒时，注意避免滑落颗粒松散的上部。作为替代方案，可以使用移液管或条纹来收集上清液。
9. 将上清液在 4 °C 下以 8000 x g 离心 10 分钟。
10. 弃去所得上清液并保留含线粒体的沉淀。
11. 使用无绒擦拭布从管内壁吸收多余的上清液，注意避免干扰沉淀。尽可能将沉淀保持在 4 °C 的冰上。
12. 要重悬线粒体，请在试管底部加入 80 μL 冰冷的 IB。通过在沉淀上反复洗涤 IB 轻轻重悬沉淀。
13. 为避免产生气泡，请将微量移液器设置为吸出并输送 40-60 μL 体积。
14. 随着线粒体沉淀分散，增加微量移液器体积以有效地重悬沉淀的线粒体。避免用移液器吸头接触沉淀，并避免产生气泡。
15. 重悬后，将线粒体转移到预冷的微量离心管中，并将其标记为线粒体原液。记下总重悬液体积。
16. 为了确定样品中的线粒体蛋白浓度，请使用制造商说明定义的众所周知的 BCA 或 Bradford 蛋白测定进行总蛋白测定。
    注:评估产量的替代或补充策略是确定柠檬酸盐合酶活性。作为参考，线粒体含量可以按照 Vinnakota 等人 ³⁰ 中描述的方案进行定量。

4. 质量控制检查

1. 在预冷的微量离心管中，用 IB 将线粒体原液稀释至所需的工作浓度。
   注:当使用来自心脏组织的分离物时，将线粒体原液稀释至 40 mg/mL，以 0.1 mg/mL 的最终浓度进行呼吸测定。
2. 在用于呼吸测定测定之前，用蒸馏水冲洗氧合仪室、塞子和微升注射器 10 次以清洁它们。
3. 为了测试线粒体分离株的活力和质量，将 2.3 mL 呼吸缓冲液 （RB） 加载到氧合仪室中，并让耗氧量信号在 37 °C 下平衡约 10 分钟或当速率接近 0 时。
4. 信号平衡后，向下推塞子并吸出从塞子毛细管中流出的多余缓冲液。
5. 使用微升注射器添加 1 mM EGTA，以螯合缓冲液或线粒体样品中的任何残留钙。
6. 为了促进呼吸，添加 5 mM 丙酮酸钠和 1 mM L-苹果酸钠。
7. 添加底物后，加入一团稀释的线粒体以达到工作浓度并允许呼吸发生 5 分钟。这个时期被称为 LEAK 或状态 2 呼吸。
8. 在 5 分钟处，加入 500 μM ADP 推注以启动状态 3 呼吸，也称为 OXHPOS，并让线粒体呼吸直至缺氧。
9. 通过将状态 3 期间的最大耗氧率除以在状态 2 中添加 ADP 之前的耗氧率来计算呼吸控制率 （RCR）（见 图 1）。
   注意:1 - 1/RCR 的替代 RCR 表达式也可以用作质量指标，其范围在 0 和 1 之间;但是，当 RCR > 10 时，使用此指标很难区分质量（参见 图 2）。
10. 用纯水冲洗腔室和塞子 10 次，以清洁氧合仪以进行后续分析。如果呼吸测定完成，用 70% 乙醇填充腔室，并在腔室中放置塞子，直到下次使用。

结果

线粒体分离完成后，应 通过使用 高分辨率呼吸测定法量化耗氧率 （J_{O 2} ） 来测试分离株的质量和功能。为此，将线粒体原液稀释至 40 mg/mL，以便在使用离体心脏线粒体的所有呼吸测定测定中，在 2 mL RB 中允许 0.1 mg/mL 的工作浓度。在 1 mM EGTA（一种钙螯合剂）存在下，由 5 mM 丙酮酸钠和 1 mM L-苹果酸以呼吸为燃料，并使其平衡 5 分钟以建立状态 2 呼吸。在?...

讨论

坚持本协议中简要描述的方法将确保从小型啮齿动物的心脏组织中分离出良耦合的线粒体，以及其他组织类型和来源。总体而言，该过程总共需要 3-3.5 小时，在此期间，所有动物组织、样品和分离物应尽可能保持在 4 °C 的冰上，以限制降解。该程序是稳健的，可以通过多种方式进行更改，以更好地适应实验目标和所使用的模型。在组织解剖过程中可以进行的一种调节是?...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
1.7 mL microcentrifuge tubes
10 mL glass beaker			For organ disection and mincing
50 mL centrifuge tubes			Centrifugation
Adenosine 5'-diphosphate monopotassium salt dihydrate	Sigma	A5285	Respirometry assays
BSA Protein Assay Kit	Thermo Scentific	PI23225	Mitochondrial protein quantification
Dextrose	Sigma	DX0145	For buffer (CB)
Ethylene glycol-bis(2-amino-ethylether)-N,N,N',N'-tetraacetic acid	Sigma	E4378	For buffers (CB and IB) and respirometry assays
Glass cannula	Radnoti		Guinea pig and rat heart perfusion
Heparin sodium porcine mucosa	Sigma	SRE0027-250KU	Animal IP injection
High-resolution respirometer			Clark-type electrode; oxygraph with 2 mL chambers
Induction chamber
Isoflurane	Sigma	792632	Anesthetic
L-malic acid	Sigma	02288-50G	Respirometry assays
Magnesium chloride hexahydrate	Sigma	M9272	For buffer (RB)
Mannitol	Sigma	MX0214	For buffer (IB)
Microliter syringes			Sizes ranging from 5–50 µL
Microplate reader			Must be able to incubate at 37 °C
MOPS	Sigma	475898	For all buffers
O2 tank
OMNI THQ Homogenizer	OMNI International	12-500	Similar rotor stator homogenizers will work
pipettes			Volumes of  2–20 µL; 20–200 µL; 200–1000 µL
Potassium chloride	Sigma	P3911	For buffers (RB and CB)
Potassium phosphate dibasic	Sigma	795496	For buffers (IB and RB)
Protease from Bacillus licheniformis	Sigma	P5459
Sodium chloride	Sigma	S9888	For buffer (CB)
Sodium pyruvate	Fisher bioreagents	BP356-100	Respirometry assays
Sucrose	Sigma	8510-OP	For buffer (IB)
Surgical dissection kit			Depends on animal and tissue source
Tabletop centrifuge			Must cool to 4 °C