从啮齿动物心脏组织中稳健地分离线粒体

摘要

线粒体的生物能量和代谢组学研究揭示了它们在许多疾病中的多方面作用，但这些细胞器的分离方法各不相同。此处详述的方法能够从多个组织来源纯化高质量的线粒体。质量由呼吸控制比率和高分辨率呼吸测定法评估的其他指标决定。

摘要

线粒体分离已经实践了几十年，遵循分子生物学和生物化学领域的先驱建立的程序来研究代谢损伤和疾病。一致的线粒体质量对于正确研究线粒体生理学和生物能量学是必要的;但是，研究人员可以使用许多不同的已发表的分离方法。尽管不同的实验策略需要不同的分离方法，但基本原理和程序是相似的。该协议详细介绍了一种能够从各种组织来源（包括小动物和细胞）中提取良好耦合的线粒体的方法。概述的步骤包括器官解剖、线粒体纯化、蛋白质定量和各种质量控制检查。用于识别高质量线粒体的主要质量控制指标是呼吸控制比率 （RCR）。RCR 是氧化磷酸化期间的呼吸频率与无 ADP 时的呼吸频率之比。讨论了其他指标。虽然使用该方案可以获得相对于其组织来源的高 RCR 值，但可以优化几个步骤以满足研究人员的个性化需求。该程序是稳健的，并且始终导致分离的线粒体在动物模型和组织来源中具有高于平均水平的 RCR 值。

引言

线粒体是亚细胞器，可建立针对特定细胞功能优化的细胞质能量条件。虽然细胞、组织和生物体水平的研究可以提供对线粒体功能的见解，但分离细胞器提供了其他方式无法实现的实验控制水平。自 1940 年代以来，一直在进行线粒体分离，从而可以对各种细胞和组织的代谢和呼吸机制进行研究 ^1,2。线粒体的历史相关性也有据可查³。作为 ATP 的主要生产者，线粒体发挥着许多关键作用，这些作用对最佳细胞和器官功能至关重要⁴。在线粒体基质中，底物被 TCA 循环氧化，产生还原当量和移动电子载体，如 NADH 和 UQH₂ ^5,6。细胞色素 C 是线粒体生化反应网络中的第三个主要移动电子载体⁷。然后，这些分子被嵌入线粒体内膜中的电子传递系统 （ETS） 的跨膜复合物氧化⁸。ETS 的氧化还原反应与质子从基质到膜间空间的易位耦合。这些过程建立了一个电化学质子梯度，用于通过 F₁F₀ ATP 合酶用 Pi 磷酸化....

研究方案

所有脊椎动物的使用和治疗均按照密歇根州立大学机构动物护理和使用委员会 （IACUC） 审查和接受的批准方案进行。该方案是使用雄性和雌性 Hartley 白化豚鼠和 Sprague Dawley （SD） 大鼠设计的。为了从豚鼠中分离心脏线粒体，在 4-6 周龄 （300-450 g） 时处死动物。在 10-13 周龄 （250-400 g） 之间获得两性 SD 大鼠的心脏线粒体。缓冲液的配方如 表 1 所述，应提前准备。本研究中使用的试剂和设备的详细信息列在 材料表中。

1. 实验准备

1. 在开始分离之前，将两个 50 mL 离心管标记为“Spin 1 和 2”和“Spin 3”。
2. 将试管、新鲜解冻的分离缓冲液 （IB）、锋利的切碎剪刀、组装好的均质探针和 5 mL 烧杯或同等大小的容器放在冰上。
3. 将新鲜解冻的呼吸缓冲液 （RB） 放入培养箱中加热，以便进行后续的呼吸检测。
4. 将冷冻离心机预冷至 4 °C。
5. 确保所有设备都已布置好，并且已将 20 μL 来自 地衣芽孢杆菌 的 7-15 U/mg 蛋白酶添加到标有“旋转 1 和 2”的试管中。
6. 使用心脏停搏缓冲液（CB，

讨论

坚持本协议中简要描述的方法将确保从小型啮齿动物的心脏组织中分离出良耦合的线粒体，以及其他组织类型和来源。总体而言，该过程总共需要 3-3.5 小时，在此期间，所有动物组织、样品和分离物应尽可能保持在 4 °C 的冰上，以限制降解。该程序是稳健的，可以通过多种方式进行更改，以更好地适应实验目标和所使用的模型。在组织解剖过程中可以进行的一种调节是?.......

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
1.7 mL microcentrifuge tubes
10 mL glass beaker			For organ disection and mincing
50 mL centrifuge tubes			Centrifugation
Adenosine 5'-diphosphate monopotassium salt dihydrate	Sigma	A5285	Respirometry assays
BSA Protein Assay Kit	Thermo Scentific	PI23225	Mitochondrial protein quantification
Dextrose	Sigma	DX0145	For buffer (CB)
Ethylene glycol-bis(2-amino-ethylether)-N,N,N',N'-tetraacetic acid	Sigma	E4378	For buffers (CB and IB) and respirometry assays
Glass cannula	Radnoti		Guinea pig and rat heart perfusion
Heparin sodium porcine mucosa	Sigma	SRE0027-250KU	Animal IP injection
High-resolution respirometer			Clark-type electrode; oxygraph with 2 mL chambers
Induction chamber
Isoflurane	Sigma	792632	Anesthetic
L-malic acid	Sigma	02288-50G	Respirometry assays
Magnesium chloride hexahydrate	Sigma	M9272	For buffer (RB)
Mannitol	Sigma	MX0214	For buffer (IB)
Microliter syringes			Sizes ranging from 5–50 µL
Microplate reader			Must be able to incubate at 37 °C
MOPS	Sigma	475898	For all buffers
O2 tank
OMNI THQ Homogenizer	OMNI International	12-500	Similar rotor stator homogenizers will work
pipettes			Volumes of  2–20 µL; 20–200 µL; 200–1000 µL
Potassium chloride	Sigma	P3911	For buffers (RB and CB)
Potassium phosphate dibasic	Sigma	795496	For buffers (IB and RB)
Protease from Bacillus licheniformis	Sigma	P5459
Sodium chloride	Sigma	S9888	For buffer (CB)
Sodium pyruvate	Fisher bioreagents	BP356-100	Respirometry assays
Sucrose	Sigma	8510-OP	For buffer (IB)
Surgical dissection kit			Depends on animal and tissue source
Tabletop centrifuge			Must cool to 4 °C