إصابة الصنوبر في الجسم الحي والمختبري بالديدان الخيطية الخشبية الخزفية Bursaphelenchus xylophilus وعزل المواد المتطايرة المستحثة

Summary

يصف البروتوكول عدوى الديدان الخيطية لخشب الصنوبر في الجسم الحي وفي المختبر لصنوبر الصنوبر وتحليلها المتطاير من خلال كروماتوغرافيا الغاز (GC) و GC إلى جانب قياس الطيف الكتلي (GC-MS).

Abstract

الديدان الخيطية لخشب الصنوبر (PWN) هي طفيليات نباتية تسبب مرض ذبول الصنوبر (PWD) في الأنواع الصنوبرية. ساهمت هذه الديدان الخيطية الطفيلية النباتية بشكل كبير في إزالة غابات الصنوبر في البلدان الآسيوية ، على سبيل المثال ، اليابان والصين وكوريا. على مدى العقدين الماضيين ، تأثرت البرتغال وإسبانيا بشكل كبير في أوروبا. تعتمد الأبحاث حول آليات الإصابة ب PWN و / أو تطور الأشخاص ذوي الإعاقة في الأنواع المضيفة الحساسة على العدوى الخاضعة للرقابة لشتلات الصنوبر في ظل ظروف الاحتباس الحراري. هذه التقنية شاقة وتحشد موارد اقتصادية وبشرية كبيرة. بالإضافة إلى ذلك ، يمكن أن يكون عرضة للتباين الناتج عن التنوع الجيني المرتبط ببعض أنواع الصنوبر ولكن أيضا من تدخل العوامل الخارجية. كبديل ، توفر المزارع المشتركة في المختبر من الصنوبر مع PWNs نظاما أكثر فائدة لدراسة التغيرات الكيميائية الحيوية لأنها أ) تسمح بالتحكم في المتغيرات البيئية أو الغذائية الفردية ، ب) تشغل مساحة أقل ، ج) تتطلب وقتا أقل للحصول عليها ، و د) خالية من التلوث أو من التباين الجيني للمضيف. يوضح البروتوكول التالي تفاصيل المعيار في الجسم الحي لعدوى PWN من Pinus pinasster ، والصنوبر البحري ، وإنشاء الثقافات المشتركة الجديدة في المختبر لبراعم الصنوبر مع PWN كمنهجية محسنة لدراسة تأثير الطفيليات النباتية على الصنوبر المتطاير. يتم استخراج المواد المتطايرة التي يسببها PWN من الصنوبر المصابة في الجسم الحي وفي المختبر عن طريق التقطير المائي واستخراج التقطير ، ويتم التقاط المواد المتطايرة المنبعثة عن طريق الاستخراج الدقيق للطور الصلب (SPME) ، باستخدام تقنيات الألياف أو العمود المعبأ.

Introduction

نيماتودا خشب الصنوبر (PWN) ، Bursaphelenchus xylophilus (Steiner & Bührer 1934) Nickle 1970 ، هي نيماتودا طفيلية نباتية تتطفل بشكل أساسي على أنواع الصنوبر . يتم نقل هذا الطفيلي النباتي بواسطة حشرات من جنس Monochamus إلى أشجار من أنواع الصنوبر الحساسة أثناء تغذية نضج الحشرة. يقتل PWN الشجرة عن طريق مهاجمة قنوات الراتنج وتقليل تدفق الراتنج ، وإتلاف أنسجة الأوعية الدموية ، مما يتسبب في انقطاع عمود الماء. يؤدي نقص الماء في مظلة الشجرة إلى ظهور الأعراض المرئية الأولى لمرض ذبول الصنوبر (PWD) ، أي أن إبر الصنوبر تصبح مصفرة بعد توقف عملية التمثيل الضوئي والتدلي بسبب الجفاف. يستجيب الصنوبر بشكل عام للإجهاد الحيوي وغي....

Protocol

1. ينمو في المختبر نيماتودا خشب الصنوبر

ملاحظة: تزرع الديدان الخيطية من خشب الصنوبر عن طريق التغذية على الفطريات الفطرية لسلالة غير بوغية من Botrytis cinerea (de Bary) Whetzel¹¹.

1. بالنسبة للزراعة الفرعية الروتينية ، انقل سدادة مزرعة (قطرها 0.5 سم) من الحدود الخارجية للمستعمرة الفطرية إلى طبق من أجار سكر العنب المعقم للبطاطس (PDA) واحتفظ بها عند 25 ± 1 درجة مئوية لمدة 7 إلى 10 أيام ، أو حتى تصل المستعمرة الفطرية إلى حافة اللوحة.
   ملاحظة: يمكن استخدام أنواع أخرى من وسط نمو الفطريات العام لنمو الفطريات.
2. للحصول على كميات أك....

النتائج

يتكاثر PWN بسرعة في ظل الظروف المثلى ، ويمكن أن تصل أوقات التوليد إلى 4 أيام ، حيث تكذب كل أنثى حوالي 80 بيضة خلال حياتها²⁸. باستخدام المنهجية الموضحة أعلاه ، يمكن الحصول على كميات كبيرة من PWNs اعتمادا على نمو الفطريات. خلال فترة نمو مدتها 8 أيام ، يمكن أن يكون لدى PW.......

Discussion

يحدد البروتوكول المقدم هنا منهجية محسنة لتحليل المركبات المتطايرة في الصنوبر البحري المصاب ب PWN ، حيث يتم تقليل التباين البيئي والجيني ولا يؤثر على النتائج. باستخدام خطوط نقية من الأنماط الجينية للصنوبر البحري في المختبر ، يمكن تحليل المواد المتطايرة المستخرجة وا?.......

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
38 mesh test sieve	Retsch	60.131.000038
6-Benzylaminopurine (6-BAP)	Duchefa Biochemie	B0904
Charcoal activated	Duchefa Biochemie	C1302
Clevenger apparatus	WINZER Laborglastechnik	25-000-02
Hydrogen peroxide solution	Sigma-Aldrich	H1009-500ML
Indole-3-butyric acid (IBA)	Duchefa Biochemie	I0902
Likens-Nickerson apparatus	VitriLab LDA.	c/IN29/32
Microbox round containers	Sac O2	O118/80+OD118
n-Pentane	Sigma-Aldrich	1.00882
PARAFILM M sealing film	BRAND	HS234526B-1EA
Phyto agar	Duchefa Biochemie	P1003
Potato Dextrose Agar	BD DIFCO	213400
Scalpel blade no. 24	Romed Holland	BLADE24
Schenk & Hildebrandt Basal salt medium	Duchefa Biochemie	S0225
Schenk & Hildebrandt vitamin mixture	Duchefa Biochemie	S0411
SPME fiber assembly Polydimethylsiloxane (PDMS)	Supelco	57300-U
SPME Fiber Holder	Supelco	57330-U
Sucrose	Duchefa Biochemie	S0809
Tenax TA- stainless steel tubes- conditioned + capped	Markes International	C1-AAXX-5003