JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

يصف البروتوكول عدوى الديدان الخيطية لخشب الصنوبر في الجسم الحي وفي المختبر لصنوبر الصنوبر وتحليلها المتطاير من خلال كروماتوغرافيا الغاز (GC) و GC إلى جانب قياس الطيف الكتلي (GC-MS).

Abstract

الديدان الخيطية لخشب الصنوبر (PWN) هي طفيليات نباتية تسبب مرض ذبول الصنوبر (PWD) في الأنواع الصنوبرية. ساهمت هذه الديدان الخيطية الطفيلية النباتية بشكل كبير في إزالة غابات الصنوبر في البلدان الآسيوية ، على سبيل المثال ، اليابان والصين وكوريا. على مدى العقدين الماضيين ، تأثرت البرتغال وإسبانيا بشكل كبير في أوروبا. تعتمد الأبحاث حول آليات الإصابة ب PWN و / أو تطور الأشخاص ذوي الإعاقة في الأنواع المضيفة الحساسة على العدوى الخاضعة للرقابة لشتلات الصنوبر في ظل ظروف الاحتباس الحراري. هذه التقنية شاقة وتحشد موارد اقتصادية وبشرية كبيرة. بالإضافة إلى ذلك ، يمكن أن يكون عرضة للتباين الناتج عن التنوع الجيني المرتبط ببعض أنواع الصنوبر ولكن أيضا من تدخل العوامل الخارجية. كبديل ، توفر المزارع المشتركة في المختبر من الصنوبر مع PWNs نظاما أكثر فائدة لدراسة التغيرات الكيميائية الحيوية لأنها أ) تسمح بالتحكم في المتغيرات البيئية أو الغذائية الفردية ، ب) تشغل مساحة أقل ، ج) تتطلب وقتا أقل للحصول عليها ، و د) خالية من التلوث أو من التباين الجيني للمضيف. يوضح البروتوكول التالي تفاصيل المعيار في الجسم الحي لعدوى PWN من Pinus pinasster ، والصنوبر البحري ، وإنشاء الثقافات المشتركة الجديدة في المختبر لبراعم الصنوبر مع PWN كمنهجية محسنة لدراسة تأثير الطفيليات النباتية على الصنوبر المتطاير. يتم استخراج المواد المتطايرة التي يسببها PWN من الصنوبر المصابة في الجسم الحي وفي المختبر عن طريق التقطير المائي واستخراج التقطير ، ويتم التقاط المواد المتطايرة المنبعثة عن طريق الاستخراج الدقيق للطور الصلب (SPME) ، باستخدام تقنيات الألياف أو العمود المعبأ.

Introduction

نيماتودا خشب الصنوبر (PWN) ، Bursaphelenchus xylophilus (Steiner & Bührer 1934) Nickle 1970 ، هي نيماتودا طفيلية نباتية تتطفل بشكل أساسي على أنواع الصنوبر . يتم نقل هذا الطفيلي النباتي بواسطة حشرات من جنس Monochamus إلى أشجار من أنواع الصنوبر الحساسة أثناء تغذية نضج الحشرة. يقتل PWN الشجرة عن طريق مهاجمة قنوات الراتنج وتقليل تدفق الراتنج ، وإتلاف أنسجة الأوعية الدموية ، مما يتسبب في انقطاع عمود الماء. يؤدي نقص الماء في مظلة الشجرة إلى ظهور الأعراض المرئية الأولى لمرض ذبول الصنوبر (PWD) ، أي أن إبر الصنوبر تصبح مصفرة بعد توقف عملية التمثيل الضوئي والتدلي بسبب الجفاف. يستجيب الصنوبر بشكل عام للإجهاد الحيوي وغير الحيوي من خلال إنتاج الراتنج والمركبات المتطايرة1. وبالتالي ، فإن فهم آليات دفاع الصنوبر مهم لتحديد التأثيرات المحددة لهجمات PWN وإيجاد طرق بديلة لمكافحة الآفات2.

حاليا ، تعتمد التجارب في ظل الظروف الميدانية على توافر أشجار الصنوبر المصابة ، وتأكيد الإصابة ب PWN ، والظروف البيئية المتغيرة. في ظل ظروف الاحتباس الحراري ، يمكن التحكم في هذه المعلمات بسهولة أكبر ؛ ومع ذلك ، يصبح التنوع الجيني للمضيف مصدرا قويا للتباين3. على سبيل المثال ، في دراسة حول استجابة مقاومة Pinus pinaster ، ارتبط إنتاج التربين ليمونين وأحماض الراتنج بعدوى PWN4. ومع ذلك ، نظرا لقلة عدد العينات وتباين الظروف الطبيعية ، تم تسجيل التغييرات التي يمكن اكتشافها فقط لنصف العينات. في دراسة أخرى باستخدام شتلات الصنوبر المزروعة في الدفيئة ، على الرغم من أن الظروف البيئية كانت أكثر سهولة ، إلا أن التنوع الجيني الطبيعي للصنوبر تسبب في تباين كبير في المواد المتطايرة المستخرجة5. نظرا لأن متطاير الصنوبر الناجم عن المرض يمكن أن يتأثر بشكل كبير بالتباين البيئي والجيني ، فإن اللجوء إلى مزارع البراعم في المختبر يعد بديلا جيدا للدراسات حول الاستجابة الكيميائية والكيميائية الحيوية لأنسجة الصنوبر لعدوى PWN5،6. من خلال إكثار النمط الجيني النباتي في المختبر ، يمكن الحفاظ على تركيبته الجينية واستنساخها إلى أجل غير مسمى ، مما يؤدي إلى إنشاء كمية أكبر من الأفراد المتطابقين وراثيا في مساحة أقل وتحت وقت أقل من الظروف في الجسم الحي . هذه الثقافات هي نظام عمل بسيط في ظل ظروف غذائية وبيئية يسهل التلاعب بها ، لذا فهي توفر مزايا إضافية للأنظمة التقليدية في تقييم إنتاج وانبعاث المواد المتطايرة7،8. هذه الأنظمة مفيدة بشكل خاص للبحث في الأنواع الخشبية ، والتي تتطلب في معظم الأحيان موارد كبيرة ، أي أن الأشجار المستهدفة تقع أحيانا في مواقع يصعب الوصول إليها ، وتتطلب معدات باهظة الثمن ، وقوة عاملة مخصصة ، وفترات زمنية أطول من التحليل8. في المختبر ، تتيح المزارع المشتركة لأشجار الصنوبر مع PWN تقييم التفاعلات الأيضية بين الديدان الخيطية والنبات في مراحل مختلفة9. بالنسبة لتحليل المواد المتطايرة ، يعد هذا مهما للغاية لأن تقنيات التنميط أصبحت دقيقة للغاية ، ويمكن أن تؤدي الاختلافات الدقيقة في أخذ العينات إلى تغييرات جوهرية في الملامح المتطايرة. يعد كروماتوغرافيا الغاز إلى جانب قياس الطيف الكتلي (GC-MS) تقنية قوية لتحليل المواد المتطايرة وتسمح بالتنميط السريع والمبسط للمواد المتطايرة10. يصف البروتوكول المقدم هنا تقنيات إصابة شتلات الصنوبر في الجسم الحي في ظل ظروف الاحتباس الحراري ومزارع البراعم في المختبر لأشجار الصنوبر المتطابقة وراثيا المحسنة لاستخراج وتنميط المواد المتطايرة المستحثة.

Protocol

1. ينمو في المختبر نيماتودا خشب الصنوبر

ملاحظة: تزرع الديدان الخيطية من خشب الصنوبر عن طريق التغذية على الفطريات الفطرية لسلالة غير بوغية من Botrytis cinerea (de Bary) Whetzel11.

  1. بالنسبة للزراعة الفرعية الروتينية ، انقل سدادة مزرعة (قطرها 0.5 سم) من الحدود الخارجية للمستعمرة الفطرية إلى طبق من أجار سكر العنب المعقم للبطاطس (PDA) واحتفظ بها عند 25 ± 1 درجة مئوية لمدة 7 إلى 10 أيام ، أو حتى تصل المستعمرة الفطرية إلى حافة اللوحة.
    ملاحظة: يمكن استخدام أنواع أخرى من وسط نمو الفطريات العام لنمو الفطريات.
  2. للحصول على كميات أكبر من PWNs ، استخدم B. cinerea المزروعة في المختبر على حبوب الشعير العضوية المعتمدة والمعقمة بالبخار (Hordeum vulgare L.). أضف 15 جم من الحبوب إلى 15 مل من الماء فائق النقاء ، في قوارير Erlenmeyer المغطاة ذات العنق العريض سعة 250 مل وتعقيمها. بعد ذلك ، قم بالتلقيح باستخدام B. cinerea قابس الثقافة واحتفظ به في 25 ± 1 درجة مئوية لمدة 7 إلى 10 أيام أو حتى يتم استعمار سطح الحبوببالكامل 12.
    ملاحظة: يمكن طلب الديدان الخيطية لأغراض البحث من المختبرات المرجعية الوطنية للديدان الخيطية الطفيلية النباتية.
  3. ابدأ مزارع PWN عن طريق تلقيح B. cinerea في المزارع المختبرية بتعليق مائي PWN (يحتوي على ما لا يقل عن 20 ذكرا و 30 أنثى) وحافظ عليه في الظلام في الظروف الموصوفة سابقا ، لمدة 7 إلى 10 أيام أو حتى يتم استهلاك المستعمرة الفطرية بالكامل ويبدأ سكان PWN في تسلق جدران الصفيحة أو القارورة (الشكل 1). أغلق الألواح أو القوارير بغشاء بلاستيكي لتجنب الجفاف.
    ملاحظة: يمكن تمييز الإناث بالرفرف الفرجي ، وكيس طويل بعد الرحم ، ونهاية الذيل المستديرة بشكل عام. الذكور لديهم طرف ذيل مدبب منحني بطنيا مع شويكات مميزة13. عند سحب معلقات PWN ، قم بربط مستعمرة الفطريات بحيث لا يشكل التعليق الماصة قطرات على السطح الفطري ، مما يؤدي إلى محاصرة PWNs من خلال التوتر السطحي.
  4. اعزل PWNs عن طريق شطف جدران القارورة بماء الصنبور ، وصب المحتويات على منشفة ورقية في قمع أو صينية Baermann ، والغمر بالماء14. بعد 24 إلى 48 ساعة ، كانت الديدان الخيطية الحية قد انتقلت من المادة المصابة إلى الماء. استعادتها عن طريق الغربلة باستخدام منخل شبكي 38 ميكرومتر15. اغسل PWNs المتراكمة في وعاء به ماء الصنبور.
    ملاحظة: يجب تطهير أي مادة تتلامس مع PWN بشكل صحيح لأنها كائن حجري ؛ عادة ما يكون الغمر في الإيثانول لمدة 10 إلى 20 دقيقة كافيا. يجب تعقيم المعلقات المائية المرفوضة أو تسخينها إلى 60 درجة مئوية لمدة 35 دقيقة على الأقل.
  5. استخدم المعلق المائي الذي يحتوي على PWNs على الفور أو احتفظ به عند 11 درجة مئوية لفترة تخزين أطول (تصل إلى شهرين).

2. تعقيم الديدان الخيطية المختلطة في مرحلة الحياة

  1. في غطاء التدفق، قم بوضع ماصة حجما من معلق PWN يحتوي على حوالي 5000 PWN في منخل شبكي معقم 38 ميكرومتر وغسلها بالماء المعقم.
    ملاحظة: عد الديدان الخيطية تحت مجهر مجهر (40x).
  2. اغمر النصف السفلي من المنخل الذي يحتوي على PWNs في محلول بيروكسيد الهيدروجين بنسبة 20٪ (H2O2) ، واخلطه يدويا لمدة 15 دقيقة.
  3. اغسل PWNs المعقمة عن طريق توزيع الماء المعقم من خلال المنخل. كرر هذه الخطوة 3x. في الغسيل الأخير ، قم بإمالة المنخل بحيث تتجمع PWNs عند حدود الغربال. استرجع تعليق الديدان الخيطية المعقمة عن طريق سحب 1 مل من الماء المعقم في حدود الغربال ، وقم بتخزينه في درجة حرارة 11 درجة مئوية أو استخدمه على الفور.
    ملاحظة: يمكن تقييم نجاح التعقيم عن طريق طلاء 100 ميكرولتر من تعليق PWN في وسط المساعد الشخصي الرقمي والمراقبة المنتظمة للتلوث لمدة أسبوع تقريبا.

3. إصابة شتلات الصنوبر الصنوبر في الجسم الحي

ملاحظة: يتم إجراء تجارب التلقيح في ≥ من شتلات P. pinaster البالغة من العمر عامين. يمكن الحصول على الأشجار من تجار التجزئة التجاريين المعتمدين ولكن يمكن أيضا زراعتها في دفيئة من البذور المعتمدة.

  1. احصل على لقاح PWN كما هو موضح في الخطوة 1 واضبط تعليق PWNs في مرحلة الحياة المختلطة على 1000 PWNs / مل عن طريق إضافة الماء إلى المعلق أو انتظار استقرار الديدان الخيطية (حوالي 60 دقيقة) وخفض الحجم عن طريق صب المياه السطحية. قم بإجراء العد في درجة حرارة الغرفة في شريحة مقعرة تحت المجهر المجهر عند 40x.
  2. لبدء التلقيح ، قم بإزالة الإبر يدويا من قسم أقل من الجزء العلوي 5 سم من جذع الصنوبر وقم بعمل شق طولي سطحي (بطول 0.5 إلى 1 سم) بمشرط معقم16.
    ملاحظة: يتم إجراء الشق لمنح الديدان الخيطية إمكانية الوصول إلى أنسجة الصنوبر الداخلية.
  3. في منطقة الجرح ، ضع قطعة من القطن المعقم لاستيعاب 0.5 مل من تعليق PWN الماصة وقم بإصلاحه بشريط شفاف للحفاظ على الرطوبة.
    ملاحظة: امزج تعليق PWN بقوة بين كل تلقيح لأن الديدان الخيطية ستستقر بسرعة. إذا جف المعلق في موقع التلقيح ، فقد تكون عدوى الديدان الخيطية غير ناجحة ، لذا قم بتغطية القطن الرطب بشكل كاف.
  4. بالنسبة لأشجار الصنوبر للتحكم ، استبدل تعليق PWN بالماء المعقم.
  5. اتبع تطور الأشخاص ذوي الإعاقة بانتظام وسجل الأعراض عن طريق تحديد النسبة المئوية للإبر المتغيرة اللون والذابلة. الدرجة 0 لعدم وجود أعراض خارجية ، 1 لتغير لون الإبرة بنسبة تصل إلى 25٪ ، 2 لما بين 25٪ و 50٪ من تغير لون الإبرة ، 3 ل 50٪ إلى 75٪ من تغير لون الإبرة ، و 4 لأشجار الصنوبر ذات الإبر البنية بالكامل (الشكل 2).
  6. الحفاظ على الدفيئة في ظروف رطبة (60٪ -80٪) والمياه بشكل متكرر (حافظ على 70٪ من الحد الأقصى لسعة الاحتفاظ بالمياه في التربة) ، وتجنب درجات الحرارة القصوى لأن الديدان الخيطية تصبح غير نشطة من الناحية الأيضية أقل من 10 درجات مئوية ويمكن أن يتأثر النمو فوق 30 درجة مئوية.
  7. بعد 20 يوما من التلقيح ، قم بحصاد المواد النباتية لاستخراج المواد المتطايرة عن طريق قطع الشتلات في قاعدة الساق والتجميد (-20 درجة مئوية) في أكياس ورقية بنية. بالنسبة للمواد المتطايرة المنبعثة (ألياف SMPE أو الأنابيب المعبأة) ، قم بأخذ عينات من شتلات الصنوبر على الفور ، في درجة حرارة الغرفة 5,17.

4. إنشاء وإصابة مزارع براعم الصنوبر في المختبر

  1. قبل التعقيم السطحي ، اغسل بذور P. pinaster المعتمدة في ماء الصنبور الجاري لإزالة أكبر الحطام ، ثم بمحلول منظف شائع (قطرة واحدة لكل 40 مل من الماء) ، مع تحريك قوي ، لغسل الحطام الدقيق.
  2. في غطاء التدفق ، ابدأ بتعقيم سطح البذور عن طريق إضافة محلول مبيض تجاري (1: 4 ، مبيض تجاري في ماء الصنبور) حتى يتم تغطية البذور المغسولة ، واخلطها بقوة لمدة 15 دقيقة. تخلص من محلول التبييض واشطف البذور 3 مرات بماء الصنبور المعقم.
  3. اغمر البذور في محلول الإيثانول (80٪ ، حجم / حجم) لمدة 15 دقيقة مع تحريض قوي ، وتخلص من الإيثانول ، واغسل 3 مرات بماء معقم فائق النقاء.
  4. لإنبات الصنوبر ، قم بكسر طبقات البذور المعقمة بمخرطة ميكانيكية معقمة في غطاء التدفق ، وعزل الصنوبر ، وضعه في وعاء مغلق بورق ترشيح مبلل معقم لترطيب الصنوبر طوال الليل6.
  5. قم بتقسيم الصنوبر الرطب إلى طبقات عند 4 درجات مئوية لمدة 7 أيام ، لكسر السكون ومزامنة الإنبات ، ثم الحفاظ عليه في الظلام عند 25 درجة مئوية حتى الإنبات.
    ملاحظة: خطوة التقسيم الطبقي اختيارية.
  6. انقل أشجار الصنوبر النابتة المعقمة ، في الحاوية المغلقة ، إلى فترة ضوئية ضوئية مدتها 16 ساعة ، عند 24 درجة مئوية / 18 درجة مئوية لفترة حرارية واحتفظ بها لمدة أسبوعين أو حتى يبدأ الجذع الرئيسي في النمو.
  7. في غطاء التدفق ، قم بقطع الجزء الجوي من الشتلات فوق الجذر بمشرط ونقله إلى وسط استزراع Schenk و Hildebrandt (SH) 18 المعقم (الرقم الهيدروجيني = 5.8) مع استكمال 30 جم / لتر من السكروز ، و 8 جم / لتر من أجار ، و 0.5 مجم / لتر من 6-بنزيلامينوبورين (BAP ، السيتوكينين) ، و 0.1 مجم / لتر من حمض الإندول -3-الزبد (IBA ، أوكسين)6 ، للحث على مضاعفة microshoot. احتفظ بالثقافات في الظروف الموضحة أعلاه في غرفة نمو الثقافة في المختبر .
  8. في غطاء التدفق ، يتم الاستزراع الفرعي بشكل دوري (حوالي 4 أسابيع) عن طريق قطع نسيج الكالس في قاعدة اللقطة (الجزء الملامس لوسط الاستزراع) بمشرط معقم ونقل مجموعة البراعم باستخدام ملاقط معقمة إلى وسط ثقافة الضرب الجديد.
  9. من أجل استطالة الجذع المجهري ، انقل البراعم الدقيقة إلى وسط ثقافة SH الموصوف أعلاه ولكنها تحتوي على 3 جم / لتر من الفحم المنشط بدلا من الهرمونات النباتية.
    ملاحظة: يمتص الفحم المنشط المواد السامة ويمنع تراكم الهرمونات النباتية المستحث بشكل مفرط على الأنسجة المقطعة19.
  10. بالنسبة لعدوى PWN ، انقل البراعم الممدودة إلى وسط ثقافة SH بدون هرمونات نباتية أو فحم منشط وأضف 100-150 PWNs معقمة مختلطة في مرحلة الحياة في الجزء السفلي من microshoot. حافظ على الظروف الموضحة أعلاه حتى تبدأ أعراض الأشخاص ذوي الإعاقة في الظهور (الشكل 3) 6.
  11. لحصاد المواد النباتية لاستخراج المواد المتطايرة ، استخدم في المختبر على الفور أو قم بالتجميد (-20 درجة مئوية) حتى التحليل. بالنسبة للمواد المتطايرة المنبعثة (ألياف SMPE أو الأنابيب المعبأة) ، قم بتحليل صناديق التصوير الدقيق على الفور.

5. عزل المركبات المتطايرة

ملاحظة: يمكن إجراء عزل المواد المتطايرة من خلال عدة تقنيات. هنا ، يتم الاستخراج المتطاير عن طريق التقطير المائي ، باستخدام جهاز Clevenger20 ، واستخراج التقطير ، باستخدام جهاز Likens-Nickerson21 ، ومحاصرة المواد المتطايرة في الرأس من خلال الاستخراج الدقيق للطور الصلب (SPME) باستخدام ألياف مغلفة أو أنابيب معبأة (مادة ماصة بوليمر مسامية) 22.

  1. التقطير المائي
    1. استخدم جهاز Clevenger لعزل الزيوت الأساسية. يتكون نظام التقطير من أ) جهاز Clevenger ، ب) قارورة مستديرة القاع أو Erlenmeyer للاحتفاظ بالماء ومادة الصنوبر ، ج) معدات تدفئة مناسبة ، و د) إطار دعم لتثبيت النظام في مكانه (الشكل 4 أ).
    2. نظف الأواني الزجاجية جيدا قبل الاستخدام. استخدم مشابك إطار المختبر لتأمين جهاز Clevenger بالإطار الشبكي. قم بتبريد مكثف النظام عن طريق تدوير الماء أو استخدم دائريا مبردا إذا كان متاحا.
    3. سجل وزن نبتة الصنوبر وضعه في القارورة ذات القاع المستدير أو Erlenmeyer. اضبط كمية الماء للتأكد من أن الحاوية لا تزيد عن نصفها ممتلئة.
    4. ضع معدات التدفئة أسفل القارورة ، وتحقق من عدم وجود تسرب ، وتأكد من أن جميع أجزاء النظام في الموضع الصحيح ومثبتة في إطار الدعم.
      ملاحظة: يجب تنظيف الأجزاء التي تربط الزجاج الأرضي من Clevenger والقارورة جيدا وإزالة الشحوم منها وتجفيفها قبل التوصيل. لهذا الغرض ، استخدم قطعة من ورق الترشيح مبللة قليلا بالأسيتون. لا ينبغي استخدام الشحوم في هذه الأجزاء.
    5. أدخل الماء من خلال قمع التعبئة ، الموجود في الأنبوب القطري للإرجاع في الجزء الأوسط من جهاز Clevenger. اضبط موضع الصنبور ثلاثي الاتجاهات بحيث يتدفق الماء بالتساوي في الأنبوبين (القطري والمتدرج) حتى يملأ القارورة ، قبل التدفق لأسفل من أنبوب قطر الإرجاع إليه (انظر الشكل 4).
    6. قم بتشغيل مصدر الحرارة واضبطه حتى يغلي الماء بمعدل تقطير 2-3 مل / دقيقة.
    7. ابدأ وقت التقطير عندما تسقط أول قطرة من الماء المقطر في الأنبوب المتدرج على الجانب الأيمن من جهاز Clevenger. متوسط وقت التقطير هو 3 ساعات23 ، ولكن يمكن استخدام فترات التقطير الأقصر أو الأطول وفقا للمتطلبات المحددة. عادة ما تكون الزيوت الأساسية في السائل الطافي لأنها عادة ما تكون أخف من الماء العطري المقطر أدناه (هيدراليت).
      تنبيه: عند تشغيل التقطير ، سيكون جهاز Clevenger ساخنا عند لمسه.
    8. بمجرد انتهاء وقت التقطير ، أوقف التسخين واتركه لمدة 10 دقائق تقريبا للسماح بالتقطير والغليان بالتوقف. بعد 10 دقائق ، افتح الصنبور في اتجاه عقارب الساعة للسماح للهيدراليت بالتدفق حتى يصل الزيت العطري إلى الجزء المتدرج. اقرأ حجم الزيت العطري المعزول. احسب العائد على أنه مل / غرام (الوزن الطازج أو الجاف) ، معبرا عنه كنسبة مئوية (٪ ، الحجم / الوزن).
    9. في حالة الزيوت الأساسية التي يقل حجمها عن 0.05 مل ، وهي أدنى تخرج في الأنبوب المتدرج ، لا يمكن تحديد المحصول. لاستعادة الزيت العطري ، استخدم n-pentane المقطر لشطف جهاز Clevenger.
    10. لاستعادة الزيت العطري باستخدام n-pentane المقطر ، بمجرد انتهاء التقطير ، انتظر حوالي 10 إلى 15 دقيقة وافتح الصنبور ثلاثي الاتجاهات عكس اتجاه عقارب الساعة حتى يتدفق الهيدراليت من الأنبوب القطري للإرجاع حتى أسفل قمع التعبئة. باستخدام قطارة نظيفة ، أدخل n-pentane المقطر في قمع التعبئة حتى الجانب العلوي الأيسر من أنبوب الرجوع القطري. تجنب لمس قمع التعبئة لمنع التلوث المتبادل.
    11. باستخدام زجاجة غسيل بالماء المقطر ، أدخل الماء في قمع التعبئة. سوف يتدفق n-Pentane إلى قارورة التقطير ويتبخر مع الحرارة المتبقية لماء المغلي. بهذه الطريقة ، سوف يمر عبر النظام ، ويذوب ، ويسحب المواد المتطايرة إلى سطح الهيدرولات ، في الأنبوب المتدرج. افتح الصنبور ثلاثي الاتجاهات في اتجاه عقارب الساعة إلى موضعه المعتاد.
    12. تابع كما هو موضح في 5.1.8. لجمع الزيت العطري المذاب في N-Pentan.
    13. ركز خليط الزيت العطري و n-pentane على حجم لا يقل عن 100 ميكرولتر في درجة حرارة الغرفة تحت تدفق النيتروجين باستخدام نظام مبخر النفخ. احتفظ بها عند -20 درجة مئوية حتى التحليل.
      ملاحظة: لا تركز على الجفاف لتجنب فقدان المركبات المتطايرة.
  2. استخراج التقطير
    1. استخدم جهاز Likens-Nickerson لاستخراج المواد المتطايرة من النباتات. يتكون نظام استخراج التقطير من أ) جهاز Likens-Nickerson ، ب) قارورة مستديرة القاع لحمل الماء ومادة الصنوبر (الذراع الأيمن لوحدة التقطير) ، وأخرى لحمل مذيب عضوي غير قابل للامتزاج ، مثل n-pentane المقطر (الذراع الأيسر لوحدة التقطير) ، ج) جهازان مناسبان للتدفئة ، د) مكثف ، و ه) إطار دعم لتثبيت النظام (الشكل 4 ب).
      ملاحظة: استخدم n-pentane المقطر في المختبر لتجنب تلوث العينة بمثبتات مضافة بالمذيبات.
    2. ابدأ بتدوير الماء في المكثف الآمن أو استخدم جهاز تدوير مبرد إن وجد.
    3. استخدم مشابك إطار المختبر لتأمين وحدة استخراج التقطير بالإطار الشبكي. قم بتحميل القارورة ذات القاع المستدير بمادة الصنوبر المراد استخراجها وأضف الماء إلى نصف السعة الكاملة. يجب أن تكون القارورة المستديرة القاع الأصغر سعة 100 مل نصف ممتلئة ب n-pentane المقطر.
      ملاحظة: قبل التوصيل ، يجب تنظيف الأجزاء المتصلة بالزجاج الأرضي من مكونات الزجاج جيدا وإزالة الشحوم وتجفيفها. يمكن استخدام قطعة من ورق الترشيح مبللة لفترة وجيزة بالأسيتون للتنظيف.
    4. ضع عباءات التسخين أسفل كل قارورة. تحقق من عدم وجود تسريبات وأن كل مكون من مكونات النظام تم وضعه بشكل صحيح وتثبيته على إطار شبكة المختبر. قم بتشغيل مصادر الحرارة واضبطها على نقاط الغليان الخاصة بها. يجب أن يغلي الماء بمعدل تقطير 2-3 مل / دقيقة.
      تنبيه: أثناء عملية استخراج التقطير ، سيكون جهاز Likens-Nickerson ساخنا عند لمسه.
    5. بمجرد انتهاء وقت التقطير ، أوقف التسخين من القارورة بمادة الصنوبر واترك n-pentane بالتقطير بمفرده لمدة 10 دقائق. بعد أن يتغير n-pentane إلى سائل شفاف ، أوقف التسخين واتركه لمدة 10 دقائق تقريبا. يشير تغير اللون إلى أن نواتج التقطير موجودة الآن في القارورة مع n-pentane.
    6. ركز مستخلص n-pentane تحت ضغط منخفض (70 - 73 مم زئبق) على مبخر دوار في درجة حرارة الغرفة. انقل المستخلص المركز جزئيا إلى قارورة وركزه إلى ≈100 ميكرولتر تحت تيار من النيتروجين في مبخر منفخ في درجة حرارة الغرفة. بعد الاستخراج ، احتفظ بالعينات المخزنة عند -20 درجة مئوية حتى التحليل.
      ملاحظة: لا ينبغي أن يتركز المستخلص على الجفاف لأن هذا سوف يؤدي إلى فقدان المركبات المتطايرة.
  3. أخذ عينات من مسافة الرأس بألياف مطلية
    1. يتضمن إعداد الاستخراج الدقيق للطور الصلب (SPME) أ) حامل SPME يعمل يدويا ، ب) ألياف مطلية ، و ج) حامل مناسب لدعم حامل SPME (الشكل 4C). بالنسبة للبروتوكول الحالي ، استخدم نظاما يدويا داخل القارورة SPME-headspace مع ألياف مطلية ب 100 ميكرومتر من بولي ثنائي ميثيل سيلوكسان (PDMS) لاحتجاز المواد المتطايرة.
      ملاحظة: تحتوي الألياف الأخرى المتوفرة تجاريا على طلاءات ذات خصائص كيميائية مختلفة ويجب اختيارها وفقا للتأثير المطلوب.
    2. قم بتكييف كل ألياف SPME حراريا لمدة تصل إلى 20 دقيقة عند 250 درجة مئوية قبل الاستخدام ، وفقا لتوصيات الشركة المصنعة.
    3. أدخل مادة الصنوبر ، أو جزء الصنوبر ، في قارورة زجاجية شفافة وأغلقها بغطاء لولبي ثقب ببطانة بولي تترافلورو إيثيلين (PTFE) (الحاجز). يجب أن تكون المادة على بعد 2 إلى 3 سم على الأقل من أعلى القارورة ، حتى لا تلمس الألياف العينة.
    4. قم بإجراء تجارب التحكم في وقت واحد باستخدام ألياف SPME عن طريق أخذ عينات من القوارير الفارغة لتحديد ملوثات النظام ، أو لتأكيد عدم وجود ترحيل من الاستخدام المتكرر لألياف SPME.
    5. احتفظ بمادة الصنوبر داخل القارورة لمدة 1 ساعة قبل جمع المواد المتطايرة لتوازن الغلاف الجوي.
      ملاحظة: يمكن إجراء المقايسات باستخدام SPME في درجة حرارة الغرفة أو عند درجة حرارة قابلة للتعديل عن طريق استيعاب القوارير في رف دعم وإدخالها في حمام باين ماري.
    6. اضبط عمق إبرة ثقب الحاجز من حامل SPME لاختراق الحاجز ولكن لا تتلامس مع المادة عند تعرض الألياف.
    7. مع سحب الألياف ، أدخل إبرة الحامل من خلال بطانة PTFE. ادفع المكبس لأسفل لفضح الألياف. قم بتدوير المكبس في اتجاه عقارب الساعة وأمسك برغي التثبيت على الجانب الأيسر الأفقي من فتحة Z24. كشف الألياف لمدة 1 ساعة.
    8. اسحب الألياف عن طريق تدوير المكبس عكس اتجاه عقارب الساعة حتى يصل المكبس إلى أعلى فتحة Z. المواد المتطايرة التي تم جمعها جاهزة الآن للتحليل المباشر ل GC و / أو GC-MS.
      ملاحظة: إذا لزم الأمر ، يمكن تخزين الألياف في درجة حرارة الغرفة قبل التحليل ، ولكن ليس أكثر من أسبوع.
  4. محاصرة مساحة الرأس مع أنابيب معبأة
    1. قم بإعداد إعداد لمحاصرة المواد المتطايرة في مساحة الرأس باستخدام مصائد معبأة من الفولاذ المقاوم للصدأ تتكون من أ) نظام ضخ التدفق الشامل ، ب) أنابيب PTFE ، ج) مرشحات هواء الفحم المنشط ، د) أنابيب معبأة ببوليمر راتنج مسامي ، و ه) أكياس الأواني الزجاجية أو البولي إيثيلين تيريفثاليت (PET) (أكياس الطهي) (الشكل 4 د) 25.
    2. احتفظ بمادة الصنوبر في الأواني الزجاجية المغطاة أو داخل أكياس PET لتجميع المواد المتطايرة في الرأس.
      ملاحظة: اعلم أن المواد المتطايرة من البلاستيك الشائع وفيرة ويمكن اكتشافها بكميات كبيرة من خلال GC-MS.
    3. بالنسبة لنظام الحلقة المغلقة ، قم بتوصيل الدائرة على النحو التالي: أ) مخرج المضخة بأنبوب PTFE ، ب) أنبوب PTFE لمرشحات هواء الفحم المنشط ، ج) من فلاتر الهواء إلى الأنابيب الإضافية المتصلة بالأواني الزجاجية أو أكياس PET بمادة الصنوبر ، د) الأنبوب المعبأ بالأواني الزجاجية أو مخرج كيس PET ، ه) أنابيب PTFE إضافية من مخرج أنبوب الفولاذ المقاوم للصدأ إلى مدخل مضخة التدفقالشامل 22.
      ملاحظة: يجب تكييف أنابيب الفولاذ المقاوم للصدأ المعبأة بالبوليمر المسامي حراريا في وحدة الامتصاص الحراري وفقا لتوصيات الشركة المصنعة ، على سبيل المثال ، حتى 15 دقيقة عند 100 درجة مئوية ، قبل الاستخدام. احذر من أن الأنابيب لها اتجاه تدفق يجب احترامه.
    4. اجمع المواد المتطايرة عن طريق ضخ 100 لتر من الهواء المفلتر عبر نظام الصنوبر بمعدل 0.6 لتر في الدقيقة ، باستخدام مضخة التدفق الكتلي للتحكم في كمية ومعدل الهواء المصفى.
      ملاحظة: يمكن أن تؤثر كمية و / أو تدفق هواء فراغ الرأس الذي يتدفق عبر العمود على كمية المواد المتطايرة المحاصرة ، وبالتالي على الكروماتوجرام الذي تم الحصول عليه.
    5. بعد جمع المواد المتطايرة ، أغلق الأنابيب المعبأة في كلا الطرفين بأغطية تخزين محكمة الإغلاق. يخزن في درجة حرارة الغرفة (لمدة أقصاها أسبوع واحد) ويحلل في أسرع وقت ممكن ، حيث يمكن أن تتحلل المواد المتطايرة أو تهرب.
    6. للغسيل ، اشطف جميع أنابيب PTFE والأواني الزجاجية بنسبة 70٪ من الإيثانول وقم بتسخينها في فرن على حرارة 230 درجة مئوية لمدة 2 ساعةعلى الأقل 25.

6. تحليل الملامح المتقلبة

  1. إجراء تحليل للملامح المتطايرة من خلال قياس الطيف الكتلي الكروماتوغرافيا الغازية (GC-MS) ، أو بشكل روتيني من خلال كروماتوغرافيا الغاز مع الكشف عن تأين اللهب (GC-FID) للقياس الكمي للمواد المتطايرة المحددة مسبقا.
    ملاحظة: وصف طرائق التحليل بواسطة GC-FID و GC-MS واسع النطاق ويتجاوز هدف العمل الحالي. ينصح القارئ باستخدام الإجراءات أو المعايير داخل المختبر ، مثل ISO 760926 ، التي توفر ظروف التشغيل ذات الصلة بشأن القياس الكمي للمكونات الفردية وبيانات الأدبيات حول المقارنة بين طريقتين تحليليتين27.
  2. استخدم التحليلات النقية أو المحمولة في مذيب ، على سبيل المثال ، n-pentane أو n-hexane ، ويتم حقنها أو امتصاصها مباشرة في ألياف ، على سبيل المثال ، SPME ويتم امتصاصها مباشرة في حاقن الكروماتوجراف أو باستخدام وحدة الامتصاص الحراري (TD) المرتبطة بوحدة GC.
    ملاحظة: على الرغم من حساسيتها الأكبر ودقتها العالية ووقت التحليل الأقصر ، إلا أن الأعمدة الشعرية لها سعة عينة منخفضة. وبالتالي ، على الرغم من أن جميع ظروف التشغيل تقريبا يمكن أن تكون متشابهة ، إلا أن نوع المادة التحليلية (نقية ، في مذيب ، SPME ، إلخ) قد تتطلب إجراءات حقن مختلفة أقل انقسام.
  3. إجراء تحديد المكونات المتطايرة من خلال مقارنة مؤشرات الاحتفاظ بها، التي تم تقييمها وفقا لمعيار ISO 7609، مع أطياف GC-MS من مكتبة تم إنشاؤها في المختبر باستخدام عينات مرجعية تم تحديد هوية مكوناتها بواسطة RI و GC-MS و 13C-NMR والمركبات المركبة والمعزولة المختبرية والمعايير المتاحة تجاريا ، أو في حالة عدم وجودها ، مكتبات الأطياف الكتلية المتاحة تجاريا.
  4. عبر عن النتائج باستخدام تمثيل رسومي (كروماتوجرام) وملف تعريف كروماتوغرافي يسرد الكميات النسبية لجميع المركبات المحددة في العينة ، مع ترتيب شطفها المشار إليه بمؤشرات الاحتفاظ بها في العمود المناسب المستخدم.
  5. بالنسبة لعدد كبير من العينات، قم بإجراء تقييم تحليل إحصائي مناسب بناء على التركيب الكيميائي لتفسير ترتيب العينة (التجميعات و/أو الفصل).

النتائج

يتكاثر PWN بسرعة في ظل الظروف المثلى ، ويمكن أن تصل أوقات التوليد إلى 4 أيام ، حيث تكذب كل أنثى حوالي 80 بيضة خلال حياتها28. باستخدام المنهجية الموضحة أعلاه ، يمكن الحصول على كميات كبيرة من PWNs اعتمادا على نمو الفطريات. خلال فترة نمو مدتها 8 أيام ، يمكن أن يكون لدى PW...

Discussion

يحدد البروتوكول المقدم هنا منهجية محسنة لتحليل المركبات المتطايرة في الصنوبر البحري المصاب ب PWN ، حيث يتم تقليل التباين البيئي والجيني ولا يؤثر على النتائج. باستخدام خطوط نقية من الأنماط الجينية للصنوبر البحري في المختبر ، يمكن تحليل المواد المتطايرة المستخرجة وا?...

Disclosures

ليس لدينا ما نفصح عنه.

Acknowledgements

تم تمويل هذا البحث جزئيا من قبل الاتحاد الأوروبي في إطار مشروع PurPest من خلال 101060634 اتفاقية المنح ، ومن قبل Fundação para a Ciência e a Tecnologia (FCT) ، من خلال مشاريع NemACT, DOI 10.54499/2022.00359.CEECIND/CP1737/CT0002; NemaWAARS ، DOI 10.54499 / PTDC / ASP-PLA / 1108 / 2021 ؛ CESAM UIDP / 50017/2020 + UIDB / 50017/2020+ LA / P / 0094/2020 ؛ CE3C ، DOI 10.54499 / UIDB / 00329 / 2020 ؛ GREEN-IT ، DOI 10.54499 / UIDB / 04551 / 2020 و 10.54499 / UIDP / 04551 / 2020.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
38 mesh test sieveRetsch60.131.000038
6-Benzylaminopurine (6-BAP)Duchefa BiochemieB0904
Charcoal activatedDuchefa BiochemieC1302
Clevenger apparatusWINZER Laborglastechnik25-000-02
Hydrogen peroxide solutionSigma-AldrichH1009-500ML
Indole-3-butyric acid (IBA)Duchefa BiochemieI0902
Likens-Nickerson apparatusVitriLab LDA.c/IN29/32
Microbox round containersSac O2O118/80+OD118
n-PentaneSigma-Aldrich1.00882
PARAFILM M sealing filmBRANDHS234526B-1EA
Phyto agarDuchefa BiochemieP1003
Potato Dextrose AgarBD DIFCO213400
Scalpel blade no. 24Romed HollandBLADE24
Schenk & Hildebrandt Basal salt mediumDuchefa BiochemieS0225
Schenk & Hildebrandt vitamin mixtureDuchefa BiochemieS0411
SPME fiber assembly Polydimethylsiloxane (PDMS)Supelco57300-U
SPME Fiber HolderSupelco57330-U
SucroseDuchefa BiochemieS0809
Tenax TA- stainless steel tubes- conditioned + cappedMarkes InternationalC1-AAXX-5003

References

  1. Back, M. A., Bonifácio, L., Inácio, M. L., Mota, M., Boa, E. Pine wilt disease: A global threat to forestry. Plant Pathol. 73 (5), 1026-1041 (2024).
  2. Mumm, R., Hilker, M. Direct and indirect chemical defence of pine against folivorous insects. Trend Plant Sci. 11 (7), 351-358 (2006).
  3. Carrasquinho, I., Lisboa, A., Inácio, M. L., Gonçalves, E. Genetic variation in susceptibility to pine wilt disease of maritime pine (Pinus pinaster Aiton) half-sib families. Annals Forest Sci. 75 (3), 85 (2018).
  4. Gaspar, M. C., et al. Impact of the pinewood nematode on naturally-emitted volatiles and scCO2 extracts from Pinus pinaster branches: a comparison with P. pinea. J Supercritical Fluids. 159, 104784 (2020).
  5. Rodrigues, A. M., et al. Pinus halepensis, Pinus pinaster, Pinus pinea and Pinus sylvestris essential oils chemotypes and monoterpene hydrocarbon enantiomers, before and after inoculation with the pinewood nematode Bursaphelenchus xylophilus. Chem Biodiver. 14 (1), e1600153 (2017).
  6. Faria, J. M. S., et al. In vitro co-cultures of Pinus pinaster with Bursaphelenchus xylophilus: a biotechnological approach to study pine wilt disease. Planta. 241 (6), 1325-1336 (2015).
  7. Espinosa-Leal, C. A., Puente-Garza, C. A., García-Lara, S. In vitro plant tissue culture: means for production of biological active compounds. Planta. 248 (1), 1-18 (2018).
  8. Bonga, J. M., von Aderkas, P. . In Vitro Culture of Trees. , (1992).
  9. Faria, J. M. S., et al. Nematotoxic and phytotoxic activity of Satureja montana and Ruta graveolens essential oils on Pinus pinaster shoot cultures and P. pinaster with Bursaphelenchus xylophilus in vitro co-cultures. Indus Crops Prod. 77, 59-65 (2015).
  10. Vallarino, J. G., et al. Acquisition of volatile compounds by gas chromatography-mass spectrometry (GC-MS). Plant Metabol. Meth Mol Biol. , 225-239 (2018).
  11. Kikuchi, T., Aikawa, T., Oeda, Y., Karim, N., Kanzaki, N. A rapid and precise diagnostic method for detecting the pinewood nematode Bursaphelenchus xylophilus by loop-mediated isothermal amplification. Phytopathology. 99 (12), 1365-1369 (2009).
  12. Faria, J. M. S., Barbosa, P., Bennett, R. N., Mota, M., Figueiredo, A. C. Bioactivity against Bursaphelenchus xylophilus: Nematotoxics from essential oils, essential oils fractions and decoction waters. Phytochemistry. 94, 220-228 (2013).
  13. Nickle, W. R., Golden, A. M., Mamiya, Y., Wergin, W. P. On the taxonomy and morphology of the pine wood nematode, Bursaphelenchus xylophilus (Steiner &Buhrer 1934) Nickle 1970. J Nematol. 13 (3), 385-392 (1981).
  14. Viglierchio, D. R., Schmitt, R. V. On the methodology of nematode extraction from field samples: baermann funnel modifications. J Nematol. 15 (3), 438-444 (1983).
  15. IPPC. . DP 10: Bursaphelenchus xylophilus.Diagnostic protocols, International standard for phytosanitary measures.. 27, 1 (2016).
  16. Rodrigues, A. M., Carrasquinho, I., António, C. Primary metabolite adjustments associated with pinewood nematode Resistance in Pinus pinaster. Front Plant Sci. 12, (2021).
  17. Gonçalves, E., et al. Effect of Monochamus galloprovincialis feeding on Pinus pinaster and Pinus pinea, oleoresin and insect volatiles. Phytochemistry. 169 (September 2019), 112159 (2020).
  18. Schenk, R. U., Hildebrandt, A. C. Medium and techniques for induction and growth of monocotyledonous and dicotyledonous plant cell cultures. Canadian J Botany. 50 (1), 199-204 (1972).
  19. Tereso, S., et al. Improved axillary and adventitious bud regeneration from Portuguese genotypes of Pinus pinaster AIT. Propag Ornam Plants. 6 (1), 24-33 (2006).
  20. Council of Europe European Directorate for the Quality of Medicines. . European Pharmacopoeia. , 241 (2010).
  21. Likens, S. T., Nickerson, G. B. Detection of certain hop oil constituents in brewing products. Proc Ann Meet - Am Soc Brewing Chem. 22 (1), 5-13 (1964).
  22. Karimi, A., Gross, J. Development and validation of an innovative headspace collection technique: volatile organic compound patterns emitted by different developmental stages of Halyomorpha halys. Front Horti. 3, (2024).
  23. Koedam, A., Scheffer, J. J. C., Baerheim Svendsen, A. Comparison of isolation procedures for essential oils II. Ajowan, Caraway, Coriander and Cumin. Zeitschrift für Lebensmittel-Untersuchung und -Forschung. 168 (2), 106-111 (1979).
  24. Abdulra'uf, L. B., Hammed, W. A., Tan, G. H. SPME fibers for the analysis of pesticide residues in fruits and vegetables: A review. Crit Rev Anal Chem. 42 (2), 152-161 (2012).
  25. Gross, J., Gallinger, J., Rid, M. Collection, identification, and statistical analysis of volatile organic compound patterns emitted by phytoplasma infected plants. Methods Mol Biol. 1875, 333-343 (2019).
  26. . . ISO 7609:1985 Essential Oils-Analysis by Gas Chromatography on Capillary Columns-General Method. , (1985).
  27. Rubiolo, P., Sgorbini, B., Liberto, E., Cordero, C., Bicchi, C. Essential oils and volatiles: Sample preparation and analysis. A review. Flav Fragr J. 25 (5), 282-290 (2010).
  28. Fielding, N. J., Evans, H. F. The pine wood nematode Bursaphelenchus xylophilus (Steiner and Buhrer) nickle (= B. lignicolus Mamiya and Kiyohara): An assessment of the current position. Forestry. 69 (1), 34-46 (1996).
  29. Faria, J. M. S., et al. First report on the synergistic interaction between essential oils against the pinewood nematode Bursaphelenchus xylophilus. Plants. 12 (13), 2438 (2023).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

211

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved