マツノザイセンチュウ Bursaphelenchus xylophilus によるIn vivoおよびIn vitroマツの感染と誘導揮発性物質の単離

要約

このプロトコルは、Pinus pinasterのin vivoおよびin vitroのマツノイセンチュウ感染と、ガスクロマトグラフィー(GC)および質量分析(GC-MS)に結合されたGCによるそれらの揮発性分析について説明しています。

要約

マツノボブセンチュウ(PWN)は、針葉樹にマツ材萎凋病(PWD)を引き起こす植物寄生虫です。この植物寄生性線虫は、日本、中国、韓国などのアジア諸国のマツの森林破壊に大きく貢献しています。過去20年間、ヨーロッパでは、ポルトガルとスペインが大きな影響を受けてきました。感受性宿主種におけるPWN感染および/またはPWDの進行のメカニズムに関する研究は、温室条件下でのマツの苗木の制御された感染に依存しています。この手法は手間がかかり、かなりの経済的および人的資源を動員します。さらに、一部のマツ種に関連する遺伝的多様性だけでなく、外部要因の干渉からも生じる変動性が発生しやすい場合があります。別の方法として、マツとPWNのin vitro共培養は、a)単一の環境変数または栄養変数を制御でき、b)占有スペースが少なく、c)取得に必要な時間が短く、d)汚染や宿主の遺伝的変異がないため、生化学的変化を研究するためのより有利なシステムを提供します。以下のプロトコルでは、マツの揮発性物質に対するこの植物寄生虫の影響を研究するための改良された方法論として、マツマツ、ピナスター、マツ、マツ、ピナツ、ピナツ、マツ、ボラチオ、マツの揮発性物質に対する影響を研究するための改良された方法論の標準的なin vivo PWN感染を詳述しています。PWN誘導性揮発性物質は、in vivoおよびin vitroで感染したマツから水化蒸留および蒸留抽出によって抽出され、放出された揮発性物質は、繊維またはパックドカラム技術を用いた固相マイクロ抽出(SPME)によって捕捉されます。

概要

マツノボイセンチュウ(PWN)、 Bursaphelenchus xylophilus (Steiner & Bührer 1934) Nickle 1970は、主に マツ 類に寄生する植物寄生性線虫です。この植物寄生虫は、昆虫の成熟摂食中に 、Monochamus 属の昆虫によって感受性の高いマツ種の樹木に誘導されます。PWNは、樹脂管を攻撃して樹脂の流れを減らし、血管組織を損傷して水柱を中断させることで、樹木を殺します。樹冠の水不足は、松枯れ病(PWD)の最初の目に見える症状、すなわち、光合成の停止後に松葉がクロロティックになり、乾燥により垂れ下がる原因となります。マツは一般に、樹脂と揮発性化合物の生成を通じて生物的および非生物的ストレスに反応します¹。したがって、マツの防御メカニズムを理解することは、PWN攻撃の特定の影響を決定し、害虫駆除の代替方法を見つけるために重要です²。

現在、野外条件下での実験は、感染したマツの利用可能性、PWN感染の確認、およびさまざまな環境条件に依存しています。温室条件下では、これらのパラメータをより簡単に制御できます。しかし、宿主の遺伝的多様性は、多様性の強力な原因となります³。例えば、Pinus pinasterの耐性応答に関する研究では、テルペンリモネンと樹脂酸の生成がPWN感染と関連していました⁴。しかし、サンプル数が少ないことや自然条件のばらつきにより、検出可能な変化は半数のサンプルにしか登録されませんでした。温室栽培のマツの苗木を使用した別の研究では、環境条件がより簡単に制御されたにもかかわらず、自然のマツの遺伝的多様性が抽出された揮発性物質に大きな変動を引き起こしました⁵。病気によって誘発されるマツの揮発性物質は、環境的および遺伝的変異によって大きく影響を受ける可能性があるため、PWN感染に対するマツ組織の化学的および生化学的応答を研究するには、in vitroシュート培養に頼ることが良い代替手段です^5,6。植物の遺伝子型をin vitroで増殖させることにより、その遺伝子構成を無期限に維持およびクローニングすることができ、in vivo条件よりも少ないスペースと短い時間で、より多くの遺伝的に同一の個体を確立することができます。これらの培養物は、容易に操作できる栄養および環境条件下での単純な作業システムであるため、揮発性物質^7,8の生成および排出の評価において、従来のシステムにさらなる利点を提供します。これらのシステムは、ほとんどの場合、かなりのリソースを必要とする、すなわち、対象樹木が手の届きにくい場所にあることがあり、高価な機器、専任の労働力、^{およびより長い}分析期間を必要とする木本種の研究に特に有利である8。In vitroでは、PWNとマツの共培養により、線虫と植物との間の異なる段階での代謝相互作用の評価が可能になります⁹。揮発性物質の分析では、プロファイリング技術が非常に正確になり、サンプリングのわずかな変動が揮発性プロファイルに大きな変化をもたらす可能性があるため、これは非常に重要です。質量分析と組み合わせたガスクロマトグラフィー(GC-MS)は、揮発性物質の分析のための強力な技術であり、揮発性物質の迅速かつ合理的なプロファイリングを可能にします¹⁰。ここで紹介するプロトコルは、温室条件下でのin vivoマツ苗木および誘発揮発性物質の抽出およびプロファイリングに最適化された遺伝的に同一のマツのin vitroシュート培養物に感染させる技術について説明しています。

プロトコル

1. インビトロ マツノイセンチュウの育成

注:マツノイセンチュウは、Botrytis cinerea(de Bary)Whetzel¹¹の非胞子性株の真菌菌糸体を餌にして成長します。

1. 日常的な継代培養では、菌類コロニーの最も外側の境界から培養プラグ(直径0.5 cm)を滅菌ジャガイモデキストロース寒天(PDA)のプレートに移し、25±〜1°Cで7〜10日間、または真菌コロニーがプレートの端に達するまで保持します。
   注:他の種類の一般的な真菌増殖培地は、真菌の増殖に使用できます。
2. 大量のPWNを得るには、水蒸気滅菌した認証有機大麦粒(Hordeum vulgare L.)でin vitroで成長させたB.cinereaを使用します。15 mLの超純水に15 gのシリアルを加え、蓋付きのワイドネック250 mLの三角フラスコに入れて滅菌します。.続いて、B. cinerea培養プラグを接種し、25±1°Cで7〜10日間、または穀物の表面が完全にコロニーを形成するまで保持する¹²。
   注:研究目的の線虫は、植物寄生性線虫の国立参照研究所から要求することができる。
3. B. cinereaをin vitro培養物にPWN水性懸濁液(最低20匹の雄と30匹の雌を含む)を接種してPWN培養を開始し、前述の条件で7〜10日間、または真菌コロニーが完全に消費され、PWN集団がプレートまたはフラスコの壁を登り始めるまで、暗所で維持します(図1)。プレートまたはフラスコをプラスチックフィルムで密封して、乾燥を防ぎます。
   注:女性は、外陰部フラップ、長い子宮後嚢、および一般的に丸い尾の末端によって区別できます。オスは、特徴的な棘のある腹側に湾曲した尖った尾の末端を持っています¹³。PWN懸濁液をピペッティングするときは、ピペッティングされた懸濁液が真菌表面に液滴を形成しないように菌類コロニーに線を通し、表面張力によってPWNをトラップします。
4. フラスコの壁を水道水ですすぎ、内容物をBaermann漏斗またはトレイのペーパータオルに注ぎ、水¹⁴に浸すことにより、PWNを分離します。24時間から48時間後、生きている線虫は感染した物質から水中に移動したであろう。38μmメッシュのふるい¹⁵を使用してふるいにかけることにより、それらを回収します。溜まったPWNを水道水の入った容器に洗います。
   注:PWNと接触する物質は、検疫生物であるため、適切に除染する必要があります。通常、エタノールに10〜20分間浸漬するだけで十分です。拒否された水性懸濁液は、滅菌するか、少なくとも35分間60°Cに加熱する必要があります。
5. PWNを含む水性懸濁液をすぐに使用するか、11°Cで長期間(最大2か月)保管してください。

2.混合ライフステージのマツノイセンチュウの滅菌

1. フローフードで、約5000個のPWNを含む大量のPWN懸濁液を滅菌38μmメッシュのふるいにピペットで移し、滅菌水で洗浄します。
   注:双眼顕微鏡(40倍)で線虫を数えます。
2. PWNを含むふるいの下半分を20%過酸化水素(H₂O₂)溶液に浸し、手動で15分間混合します。
3. 滅菌水に滅菌水をふるいを通して分注することにより、滅菌PWNを洗浄します。この手順を3回繰り返します。最後の洗浄では、PWNがふるいの境界に集まるようにふるいを傾けます。ふるい境界に滅菌水1mLをピペッティングして滅菌線虫懸濁液を回収し、11°Cで保存するか、すぐに使用してください。
   注:滅菌の成功は、PWN懸濁液の100μLアリコートをPDA培地に播種し、約1週間にわたって定期的に汚染を監視することで評価できます。

3. in vivo Pinus pinaster苗の感染

注:接種試験は、2歳の P.pinaster 苗≥で行われます。樹木は認定された商業小売業者から入手できますが、認定された種子から温室で育てることもできます。

1. ステップ1で説明したようにPWN接種物を取得し、懸濁液に水を加えるか、線虫が沈殿するのを待つ(約60分)ことにより、混合ライフステージPWNの懸濁液を1000 PWN / mLに設定し、表層水をデカントして容量を減らします。双眼顕微鏡の下の凹型スライドで室温で40倍でカウントします。
2. 接種を開始するには、松の茎の上部5 cmの下の部分から針を手動で取り外し、滅菌したメス¹⁶で表面的な縦切開(0.5〜1 cmの長さ)を行います。
   注:切開は、線虫が内側の松組織にアクセスできるようにするために行われます。
3. 巻線ゾーンに、ピペットで固定したPWN懸濁液0.5mLを保持するために滅菌した綿を置き、湿度を維持するために透明なストリップで固定します。
   注:線虫はすぐに沈降するため、各接種の間にPWN懸濁液を激しく混合します。懸濁液が接種部位で乾燥すると、線虫感染に失敗する可能性があるため、湿った綿に十分に覆ってください。
4. 防除用マツは、PWN懸濁液を滅菌水と交換します。
5. PWDの進行を定期的に追跡し、変色した針やしおれた針の割合を定量化することで症状をスコアリングします。外的症状がない場合は0、針の変色が最大25%の場合は1、針の変色の25%から50%の場合は2、針の変色の50%から75%の場合は3、針が完全に茶色の針を持つ松の場合は4のスコアを付けます(図2)。
6. 温室を湿度の高い条件(60%-80%)で頻繁に維持し(土壌の最大保水能力の70%に保つ)、線虫が10°C未満で代謝的に不活性になり、30°C以上で発達が影響を受ける可能性があるため、極端な温度を避けます。
7. 接種後20日後、茎の付け根で苗を切断し、茶色の紙袋で凍結(-20°C)することにより、揮発性物質抽出用の植物材料を収穫します。放出された揮発性物質(SMPE繊維または充填チューブ)の場合は、室温^5,17ですぐに松の苗をサンプリングします。

4. in vitro マツノコ培養物の樹立と感染

1. 表面滅菌の前に、認定された P.pinaster の種子を流水で洗って最大の破片を取り除き、次に一般的な洗剤溶液(水40mLあたり1滴)で激しく攪拌して、細かい破片を洗います。
2. フローフードで、洗浄した種子が覆われるまで市販の漂白剤溶液(1:4、水道水に市販の漂白剤)を追加して種子表面の滅菌を開始し、15分間激しく混合します。漂白剤溶液を廃棄し、滅菌した水道水で種子を3回すすいでください。
3. 種子をエタノール溶液(80%、v / v)に激しく攪拌しながら15分間浸し、エタノールを処分し、滅菌した超純水で3回洗浄します。
4. マツの発芽には、フローフード内の滅菌機械式旋盤で滅菌したシードコートを破り、マツの実を隔離し、滅菌した湿った濾紙を入れた密閉容器にセットして、マツの実を一晩水和させます⁶。
5. 水和松の実を4°Cで7日間成層化し、休眠状態を破って発芽を同期させ、発芽するまで25°Cの暗所で維持します。
   注: 階層化手順はオプションです。
6. 密閉容器内の無菌発芽マツを、24°C/18°Cの熱周期で16時間の光日長に移し、2週間または主茎が成長し始めるまで維持します。
7. フローフードで、根の上の苗の地上部をメスで切り取り、滅菌したシェンクおよびヒルデブラント(SH)¹⁸ 培地(pH = 5.8)に移し、30 g / Lのショ糖、8 g / Lの寒天、0.5 mg / Lの6-ベンジルアミノプリン(BAP、サイトカイニン)、および0.1 mg / Lのインドール-3-酪酸(IBA、 A Auxin)⁶、マイクロシュート増殖を誘導する。上記の条件で培養物を in vitro 培養増殖チャンバーに保管してください。
8. フローフード内で、シュートの基部(培地と接触する部分)の カルス 組織を滅菌メスで切断し、滅菌ピンセットでシュートクラスターを新鮮な増殖培地に移すことにより、定期的(約4週間)に継代培養します。
9. マイクロステムの伸長のためには、マイクロシュートを上記のSH培地に移しますが、植物ホルモンの代わりに3 g/Lの活性炭が含まれています。
   注:活性炭は毒物を吸着し、切片組織¹⁹に誘発される過剰な植物ホルモンの蓄積を防ぎます。
10. PWN感染の場合は、細長いシュートを植物ホルモンや活性炭を含まないSH培地に移し、マイクロシュートの底に100〜150個の混合ライフステージ滅菌PWNを追加します。PWDの症状が顕著になり始めるまで、上記の条件を維持します(図3)⁶。
11. 揮発性物質抽出用の植物材料を採取するには、 in vitro 外植片をすぐに使用するか、分析まで凍結(-20°C)します。放出された揮発性物質(SMPEファイバーまたはパックチューブ)の場合は、マイクロシュートボックスをすぐに分析してください。

5. 揮発性化合物の単離

注:揮発性物質の単離は、いくつかの手法で実行できます。ここで、揮発性物質の抽出は、Clevenger装置²⁰を用いた水蒸留、Likens-Nickerson装置²¹を用いた蒸留抽出、および被覆繊維または充填チューブ(多孔質ポリマー吸着剤)²²を用いた固相マイクロ抽出(SPME)によるヘッドスペース揮発性物質の捕捉によって行われる。

1. 水蒸留
   1. エッセンシャルオイルの分離にはClevenger装置を使用してください。蒸留システムは、a)クレベンジャー装置、b)水と松材を保持するための丸底フラスコまたは三角、c)適切な加熱装置、およびd)システムを所定の位置に保持するための支持フレームで構成されています(図4A)。
   2. 使用前にガラス器具を徹底的に清掃してください。実験室のフレームクランプを使用して、Clevenger装置を格子フレームに固定します。システムを循環させてシステムコンデンサーを冷蔵するか、可能な場合は冷蔵サーキュレーターを使用します。
   3. 松の芽の重量を登録し、丸底のフラスコまたは三角に入れます。水の量を調整して、コンテナが半分以上満たされていないことを確認します。
   4. 加熱装置をフラスコの下に置き、漏れがないことを確認し、システムのすべての部品が正しい位置にいて、サポートフレームに固定されていることを確認します。
      注意: Clevengerとフラスコのすりガラス接続部分は、接続する前に完全に洗浄、脱脂、乾燥させる必要があります。この目的のために、アセトンで少し湿らせた濾紙を使用してください。これらの部品にはグリースを使用しないでください。
   5. Clevenger装置の中央部にあるリターンダイアゴナルチューブにある充填漏斗を通して水を導入します。水がフラスコを満たすまで、リターンダイアゴナルチューブからフラスコに流れ落ちる直前に、水が2つのチューブ(対角線と目盛り付き)に等しく流れるように、三方向タップの位置を調整します( 図4を参照)。
   6. 熱源をオンにして調整し、水が2〜3mL / minの蒸留速度で沸騰するようにします。
   7. 蒸留水の最初の一滴がClevenger装置の右側にある目盛り付きチューブに落ちたら、蒸留時間を開始します。平均蒸留時間は3時間²³分ですが、特定の要件に応じて、より短いまたはより長い蒸留期間を使用することができます。エッセンシャルオイルは、通常、下の蒸留芳香水(ハイドロレート)よりも軽いため、上澄み液に含まれています。
      注意:蒸留が実行中のとき、Clevenger装置は触ると熱くなります。
   8. 蒸留時間が終了したら、加熱を停止し、約10分間放置して蒸留と沸騰を停止させます。10分後、蛇口を時計回りに開けて、エッセンシャルオイルが目盛り部分に到達するまでハイドロレートを流出させます。分離されたエッセンシャルオイルの量を読んでください。収量をmL/g(新鮮重量または乾燥重量)として計算し、パーセンテージ(%、v/w)で表します。
   9. 容量が0.05 mL未満(目盛り付きチューブ内の最も低い目盛り)のエッセンシャルオイルの場合、収率を決定できません。エッセンシャルオイルを回収するには、蒸留 したn-ペンタンを使用してクレベンジャー装置をすすぎます。
   10. 蒸留 n-ペンタンを使用してエッセンシャルオイルを回収するには、蒸留が終了したら、約10〜15分待ってから三方向タップを反時計回りに開き、ハイドロレートが戻り斜めチューブから充填漏斗のすぐ下まで流出するようにします。きれいなスポイトで、蒸留 したn-ペンタンを充填漏斗に入れ、戻り対角線チューブの左上まで導入します。クロスコンタミネーションを防ぐために、充填漏斗に触れないでください。
   11. 蒸留水洗浄ボトルを使用して、充填漏斗に水を導入します。 n-ペンタンは蒸留フラスコに流れ落ち、煎じ水の余熱で蒸発します。このようにして、システムを通過し、溶解し、揮発性物質を目盛り付きチューブ内のハイドロレートの表面に引きずり込みます。時計回りに3方向タップを通常の位置まで開きます。
   12. 5.1.8 と同様に進めます。 N-ペンタンに溶解したエッセンシャルオイルを回収します。
   13. エッセンシャルオイルと n-ペンタンの混合物を、ブローダウンエバポレーターシステムを使用して、窒素フラックス下で室温で最小容量約100μLまで濃縮します。分析まで-20°Cに保ちます。
       注意: 揮発性化合物の損失を避けるために、乾燥するまで濃縮しないでください。
2. 蒸留抽出
   1. Likens-Nickerson装置を使用して、植物から揮発性物質を抽出します。蒸留抽出システムは、a)Likens−Nickerson装置、b)水とマツ材料を保持するための丸底フラスコ(蒸留ユニットの右側アーム)、および蒸留 n-ペンタンなどの非混和性有機溶媒を保持するための別のもの(蒸留ユニットの左側アーム)、c)2つの適切な加熱装置、d)コンデンサー、 e)システムを保持するためのサポートフレーム(図4B)。
      注:溶媒添加安定剤によるサンプルの汚染を避けるために、ラボ内で蒸留した n-ペンタンを使用してください。
   2. 固定されたコンデンサーで水を循環させることから始めるか、利用可能な場合は冷蔵サーキュレーターを使用します。
   3. 実験室のフレームクランプを使用して、蒸留抽出ユニットを格子フレームに固定します。丸底のフラスコに抽出する松材を入れ、容量の半分まで水を加えます。小さい方の100mLの丸底フラスコは、蒸留 したn-ペンタンを半分含んでいる必要があります。
      注意: 接続する前に、ガラス部品のすりガラス接続部分を十分に洗浄し、脱脂し、乾燥させる必要があります。アセトンで短時間濡らした濾紙は、クリーニングに使用できます。
   4. 各フラスコの下に加熱マントルを配置します。漏れがないこと、およびシステムのすべてのコンポーネントが正しく配置され、ラボの格子フレームに固定されていることを確認します。熱源をオンにし、それぞれの沸点に調整します。水は2〜3mL /分の蒸留速度で沸騰する必要があります。
      注意: 蒸留抽出の過程で、Likens-Nickerson装置は触ると熱くなります。
   5. 蒸留時間が終了したら、松材でフラスコからの加熱を停止し、 n-ペンタンを単独で10分間蒸留します。 n-ペンタンが透明な液体に変化した後、加熱を止めて約10分間放置します。色の変化は、留出物が n-ペンタンと共にフラスコ内にあることを示しています。
   6. n-ペンタン抽出物を減圧(70〜73 mmHg)下で室温のロータリーエバポレーターに濃縮します。部分的に濃縮された抽出物をバイアルに移し、室温のブローダウン蒸発器で窒素の流れの下で≈100μLに濃縮します。抽出後、サンプルは分析まで-20°Cで保存してください。
      注:抽出物は、揮発性化合物の損失を誘発するため、乾燥するまで濃縮しないでください。
3. コーティングされたファイバーによるヘッドスペースサンプリング
   1. 固相マイクロ抽出(SPME)のセットアップには、a)手動操作のSPMEホルダー、b)コーティングされたファイバー、およびc)SPMEホルダーをサポートするための適切なスタンドが含まれます(図4C)。現在のプロトコルでは、揮発性物質をトラップするために、100 μM ポリジメチルシロキサン (PDMS) コーティングされたファイバーを備えた手動のインバイアル SPME ヘッドスペース システムを使用します。
      注:他の市販の繊維には、異なる化学的特性のコーティングが施されており、目的の効果に応じて選択する必要があります。
   2. 各SPMEファイバーは、使用前に250°Cで最大20分間、メーカーの推奨に従って熱的にコンディショニングしてください。
   3. 松材または松の部分を透明なガラスバイアルに挿入し、ポリテトラフルオロエチレン(PTFE)ライナー(セプタム)付きの穴付きスクリューキャップで密封します。材料は、繊維がサンプルに触れないように、バイアルの上部から少なくとも2〜3cm離れている必要があります。
   4. 空のバイアルをサンプリングしてSPMEファイバーを同時に使用し、システムの汚染物質を特定したり、SPMEファイバーの繰り返し使用によるキャリーオーバーがないことを確認したりして、制御実験を同時に実行します。
   5. 大気平衡のために揮発性物質を収集する前に、松の材料をバイアル内に1時間保管してください。
      注:SPMEによるアッセイは、室温で、またはバイアルをサポートラックに収容し、Bain Marieバスに挿入することで調整可能な温度で実行できます。
   6. SPMEホルダーからのセプタムピアス針の深さを調整して、セプタムをピアスしますが、ファイバーが露出したときに材料に接触しないようにします。
   7. ファイバーを引き抜いた状態で、ホルダーニードルをPTFEライナーに挿入します。プランジャーを押し下げて繊維を露出させます。プランジャーを時計回りに回転させ、Zスロット²⁴の水平左側に固定ネジを持ちます。ファイバーを1時間さらします。
   8. プランジャーがZスロットの上部に達するまでプランジャーを反時計回りに回して、ファイバーを引っ込めます。収集された揮発性物質は、GCおよび/またはGC-MS直接分析の準備が整いました。
      注:必要に応じて、繊維は分析前に室温で保存できますが、1週間以内に保存できます。
4. パックチューブによるヘッドスペーストラップ
   1. a)マスフローポンプシステム、b)PTFEチューブ、c)活性炭エアフィルター、d)多孔質樹脂ポリマー充填チューブ、およびe)ガラス製品またはポリエチレンテレフタレート(PET)バッグ(調理バッグ)で構成される充填ステンレス鋼トラップを使用して、ヘッドスペース揮発性物質をトラップするためのセットアップを準備します(図4D)²⁵。
   2. パイン材を覆われたガラス器具またはPETバッグの内側にセットして、ヘッドスペースの揮発性物質を蓄積してください。
      注:一般的なプラスチックからの揮発性物質は豊富に存在し、GC-MSによって大量に検出される可能性があることに注意してください。
   3. 閉ループシステムの場合、回路を次のように接続します:a)ポンプ出口をPTFEチューブに、b)PTFEチューブを活性炭エアフィルターに、c)エアフィルターから、松材でガラス製品またはPETバッグに接続する追加のチューブに、d)パックされたチューブをガラス製品またはPETバッグの出口に接続します。 e)ステンレス鋼管出口からマスフローポンプ入口²²への追加のPTFEチューブ。
      注:多孔質ポリマー充填ステンレス鋼管は、使用前に、メーカーの推奨に従って、たとえば100°Cで最大15分間、熱脱着ユニットで熱調整する必要があります。チューブには尊重すべき流れ方向があることに注意してください。
   4. 100 Lのろ過された空気を松のシステムを通して0.6 L/分でポンプで送り、マスフローポンプを使用してろ過された空気の量と速度を制御することにより、揮発性物質を収集します。
      注:カラムを流れるヘッドスペース空気の量および/または流量は、トラップされた揮発性物質の量、ひいては得られるクロマトグラムに影響を与える可能性があります。
   5. 揮発性物質の収集後、両端に詰められたチューブを気密保管キャップで閉じます。室温(最大1週間)で保存し、揮発性物質が劣化または逃げる可能性があるため、できるだけ早く分析してください。
   6. 洗浄するには、すべてのPTFEチューブとガラス器具を70%エタノールですすぎ、230°Cのオーブンで少なくとも2時間²⁵分加熱します。

6. 揮発性プロファイルの解析

1. ガスクロマトグラフィー-質量分析(GC-MS)による揮発性プロファイルの分析、または水素炎イオン化検出機能付きガスクロマトグラフィー(GC-FID)による日常的な分析を行い、以前に同定された揮発性物質の定量化を行います。
   注:GC-FIDおよびGC-MSによる分析方法の説明は広範であり、本研究の目的を超えています。読者は、ISO 7609²⁶ などのラボ内の手順または標準を使用して、個々の成分の定量に関する関連する操作条件と²⁷ つの分析方法の比較に関する文献データを使用することをお勧めします。
2. n -ペンタンや n-ヘキサンなどの純粋な分析物または溶媒中で運ばれ、SPMEなどの繊維に直接注入または吸着され、クロマトグラフインジェクターに直接脱着される分析物を使用するか、GCユニットにリンクされた熱脱着(TD)ユニットを使用します。
   注:キャピラリーカラムは、感度が高く、分離能が高く、分析時間が短いにもかかわらず、サンプル容量が小さくなっています。したがって、ほとんどすべての操作条件は類似していても、分析物の種類(純粋、溶媒中、SPMEなど)によって、異なるスプリット/スプリットレス注入手順が必要になる場合があります。
3. ISO 7609 に準拠して評価された揮発性成分の保持指数を、RI、GC-MS ^{、および 13}C-NMR によって成分の同一性が確立された参照サンプル、実験室で合成および単離された化合物、および市販の標準、または市販の質量スペクトルライブラリを使用してラボで作成されたライブラリの GC-MS スペクトルと比較することにより、揮発性成分の同定を行います。
4. グラフ表現(クロマトグラム)と、サンプル中に同定されたすべての化合物の相対量をリストアップしたクロマトグラフィープロファイルを使用して結果を表現し、それらの溶出順序は、使用した適切なカラムの保持インデックスによって示されます。
5. サンプル数が多い場合は、化学組成に基づいて適切な統計分析評価を行い、サンプルの配置(グループ化および/または分離)を解釈します。

結果

PWNは最適な条件下で迅速に繁殖し、生成時間は4日と短くなることがあり、各メスは生涯で約80個の卵を産みます²⁸。上記の方法論を使用すると、真菌の増殖に応じて大量のPWNを取得できます。8 日間の成長期間内に、PWN の人口数は 100 倍に増加する可能性があります(図 1)。PWNの量の一貫性を高めるには、未知の細菌や真菌によ?...

ディスカッション

ここで紹介するプロトコルは、PWNに感染した海産マツの揮発性化合物を分析するための強化された方法論を概説しており、環境的および遺伝的変動が減少し、結果に影響を与えません。 in vitro 海産マツ遺伝子型の純粋な系統を使用して、抽出および放出された揮発性物質を、マツ林に対する最も有害な生物的脅威の1つに対する宿主応答として分析できます。<...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
38 mesh test sieve	Retsch	60.131.000038
6-Benzylaminopurine (6-BAP)	Duchefa Biochemie	B0904
Charcoal activated	Duchefa Biochemie	C1302
Clevenger apparatus	WINZER Laborglastechnik	25-000-02
Hydrogen peroxide solution	Sigma-Aldrich	H1009-500ML
Indole-3-butyric acid (IBA)	Duchefa Biochemie	I0902
Likens-Nickerson apparatus	VitriLab LDA.	c/IN29/32
Microbox round containers	Sac O2	O118/80+OD118
n-Pentane	Sigma-Aldrich	1.00882
PARAFILM M sealing film	BRAND	HS234526B-1EA
Phyto agar	Duchefa Biochemie	P1003
Potato Dextrose Agar	BD DIFCO	213400
Scalpel blade no. 24	Romed Holland	BLADE24
Schenk & Hildebrandt Basal salt medium	Duchefa Biochemie	S0225
Schenk & Hildebrandt vitamin mixture	Duchefa Biochemie	S0411
SPME fiber assembly Polydimethylsiloxane (PDMS)	Supelco	57300-U
SPME Fiber Holder	Supelco	57330-U
Sucrose	Duchefa Biochemie	S0809
Tenax TA- stainless steel tubes- conditioned + capped	Markes International	C1-AAXX-5003