マツノザイセンチュウ Bursaphelenchus xylophilus によるIn vivoおよびIn vitroマツの感染と誘導揮発性物質の単離

要約

このプロトコルは、Pinus pinasterのin vivoおよびin vitroのマツノイセンチュウ感染と、ガスクロマトグラフィー(GC)および質量分析(GC-MS)に結合されたGCによるそれらの揮発性分析について説明しています。

要約

マツノボブセンチュウ(PWN)は、針葉樹にマツ材萎凋病(PWD)を引き起こす植物寄生虫です。この植物寄生性線虫は、日本、中国、韓国などのアジア諸国のマツの森林破壊に大きく貢献しています。過去20年間、ヨーロッパでは、ポルトガルとスペインが大きな影響を受けてきました。感受性宿主種におけるPWN感染および/またはPWDの進行のメカニズムに関する研究は、温室条件下でのマツの苗木の制御された感染に依存しています。この手法は手間がかかり、かなりの経済的および人的資源を動員します。さらに、一部のマツ種に関連する遺伝的多様性だけでなく、外部要因の干渉からも生じる変動性が発生しやすい場合があります。別の方法として、マツとPWNのin vitro共培養は、a)単一の環境変数または栄養変数を制御でき、b)占有スペースが少なく、c)取得に必要な時間が短く、d)汚染や宿主の遺伝的変異がないため、生化学的変化を研究するためのより有利なシステムを提供します。以下のプロトコルでは、マツの揮発性物質に対するこの植物寄生虫の影響を研究するための改良された方法論として、マツマツ、ピナスター、マツ、マツ、ピナツ、ピナツ、マツ、ボラチオ、マツの揮発性物質に対する影響を研究するための改良された方法論の標準的なin vivo PWN感染を詳述しています。PWN誘導性揮発性物質は、in vivoおよびin vitroで感染したマツから水化蒸留および蒸留抽出によって抽出され、放出された揮発性物質は、繊維またはパックドカラム技術を用いた固相マイクロ抽出(SPME)によって捕捉されます。

概要

マツノボイセンチュウ(PWN)、 Bursaphelenchus xylophilus (Steiner & Bührer 1934) Nickle 1970は、主に マツ 類に寄生する植物寄生性線虫です。この植物寄生虫は、昆虫の成熟摂食中に 、Monochamus 属の昆虫によって感受性の高いマツ種の樹木に誘導されます。PWNは、樹脂管を攻撃して樹脂の流れを減らし、血管組織を損傷して水柱を中断させることで、樹木を殺します。樹冠の水不足は、松枯れ病(PWD)の最初の目に見える症状、すなわち、光合成の停止後に松葉がクロロティックになり、乾燥により垂れ下がる原因となります。マツは一般に、樹脂と揮発性化合物の生成を通じて生物的および非生物的ストレスに反応します¹。したがって、マツの防御メカニズムを理解することは、PWN攻撃の特定の影響を決定し、害虫駆除の代替方法を見つけるために重要です²。

現在、野外条件下での実験は、感染したマツの利用可能性、PWN感染の確認、およびさまざまな環境条件に依存しています。温室条件下では、これらのパラメータをより簡単に制御できます。しかし、宿主の遺伝的多様性は、多様性の強力な原因となります³....

プロトコル

1. インビトロ マツノイセンチュウの育成

注:マツノイセンチュウは、Botrytis cinerea(de Bary)Whetzel¹¹の非胞子性株の真菌菌糸体を餌にして成長します。

1. 日常的な継代培養では、菌類コロニーの最も外側の境界から培養プラグ(直径0.5 cm)を滅菌ジャガイモデキストロース寒天(PDA)のプレートに移し、25±〜1°Cで7〜10日間、または真菌コロニーがプレートの端に達するまで保持します。
   注:他の種類の一般的な真菌増殖培地は、真菌の増殖に使用できます。
2. 大量のPWNを得るには、水蒸気滅菌した認証有機大麦粒(Hordeum vulgare L.)でin vitroで成長させたB.cinereaを使用します。15 mLの超純水に15 gのシリアルを加え、蓋付きのワイドネック250 mLの三角フラスコに入れて滅菌します。.続いて、B. cinerea培養プラグを接種し、25±1°Cで7〜10日間、または穀物の表面が完全にコロニーを形成するまで保持する¹²。
   注:研究目的の線虫は、植物寄....

ディスカッション

ここで紹介するプロトコルは、PWNに感染した海産マツの揮発性化合物を分析するための強化された方法論を概説しており、環境的および遺伝的変動が減少し、結果に影響を与えません。 in vitro 海産マツ遺伝子型の純粋な系統を使用して、抽出および放出された揮発性物質を、マツ林に対する最も有害な生物的脅威の1つに対する宿主応答として分析できます。<.......

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
38 mesh test sieve	Retsch	60.131.000038
6-Benzylaminopurine (6-BAP)	Duchefa Biochemie	B0904
Charcoal activated	Duchefa Biochemie	C1302
Clevenger apparatus	WINZER Laborglastechnik	25-000-02
Hydrogen peroxide solution	Sigma-Aldrich	H1009-500ML
Indole-3-butyric acid (IBA)	Duchefa Biochemie	I0902
Likens-Nickerson apparatus	VitriLab LDA.	c/IN29/32
Microbox round containers	Sac O2	O118/80+OD118
n-Pentane	Sigma-Aldrich	1.00882
PARAFILM M sealing film	BRAND	HS234526B-1EA
Phyto agar	Duchefa Biochemie	P1003
Potato Dextrose Agar	BD DIFCO	213400
Scalpel blade no. 24	Romed Holland	BLADE24
Schenk & Hildebrandt Basal salt medium	Duchefa Biochemie	S0225
Schenk & Hildebrandt vitamin mixture	Duchefa Biochemie	S0411
SPME fiber assembly Polydimethylsiloxane (PDMS)	Supelco	57300-U
SPME Fiber Holder	Supelco	57330-U
Sucrose	Duchefa Biochemie	S0809
Tenax TA- stainless steel tubes- conditioned + capped	Markes International	C1-AAXX-5003