Infezione dei pini in vivo e in vitro con il nematode Bursaphelenchus xylophilus e isolamento dei volatili indotti

Riepilogo

Il protocollo descrive l'infezione da nematodi di pino in vivo e in vitro di Pinus pinaster e la loro analisi dei volatilomi mediante gascromatografia (GC) e GC accoppiata a spettrometria di massa (GC-MS).

Abstract

Il nematode del pino (PWN) è un fitoparassita che causa la malattia dell'avvizzimento del pino (PWD) nelle specie di conifere. Questo nematode parassita delle piante ha contribuito pesantemente alla deforestazione dei pini nei paesi asiatici, ad esempio Giappone, Cina e Corea. Negli ultimi due decenni, in Europa, il Portogallo e la Spagna sono stati fortemente colpiti. La ricerca sui meccanismi dell'infezione da PWN e/o della progressione delle PWD nelle specie ospiti sensibili si basa sull'infezione controllata delle piantine di pino in condizioni di serra. Questa tecnica è laboriosa e mobilita ingenti risorse economiche e umane. Inoltre, può essere soggetto a variabilità che deriva dalla diversità genetica associata ad alcune specie di pino, ma anche dall'interferenza di fattori esterni. In alternativa, le co-colture in vitro di pino con PWN offrono un sistema più vantaggioso per lo studio dei cambiamenti biochimici poiché a) consentono di controllare singole variabili ambientali o nutrizionali, b) occupano meno spazio, c) richiedono meno tempo per ottenere e d) sono esenti da contaminazione o da variazione genetica dell'ospite. Il seguente protocollo descrive in dettaglio l'infezione standard in vivo da PWN di Pinus pinaster, il pino marittimo, e l'istituzione di nuove co-colture in vitro di germogli di pino con il PWN come metodologia migliorata per studiare l'influenza di questo fitoparassita sui volatili del pino. I volatili indotti dal PWN vengono estratti da pini infetti in vivo e in vitro mediante idrodistillazione e distillazione-estrazione, mentre i volatili emessi vengono catturati mediante microestrazione in fase solida (SPME), utilizzando tecniche di fibra o colonna impaccata.

Introduzione

Il nematode del pino (PWN), Bursaphelenchus xylophilus (Steiner & Bührer 1934) Nickle 1970, è un nematode parassita delle piante che parassita principalmente le specie di Pinus . Questo fitoparassita viene veicolato dagli insetti del genere Monochamus negli alberi delle specie di pino sensibili durante l'alimentazione di maturazione dell'insetto. Il PWN uccide l'albero attaccando i suoi canali di resina e riducendo il flusso di resina, e danneggiando il suo tessuto vascolare, causando interruzioni nella colonna d'acqua. La mancanza d'acqua nella chioma degli alberi induce i primi sintomi visibili della malattia dell'appassimento del pino (PWD), cioè gli aghi di pino diventano clorotici dopo la cessazione della fotosintesi e si abbassano a causa dell'essiccazione. Il pino generalmente risponde agli stress biotici e abiotici attraverso la produzione di resina e composti volatili¹. Pertanto, comprendere i meccanismi di difesa del pino è importante per determinare gli effetti specifici degli attacchi del PWN e per trovare metodi alternativi per il controllo dei parassiti².

Attualmente, la sperimentazione in condizioni di campo dipende dalla disponibilità di pini infetti, dalla conferma dell'infezione da PWN e dalle condizioni ambientali variabili. In condizioni di serra, questi parametri possono essere controllati più facilmente; Tuttavia, la diversità genetica dell'ospite diventa una forte fonte di variabilità³. Ad esempio, in uno studio sulla risposta di resistenza di Pinus pinaster, la produzione del terpene limonene e degli acidi resinici è stata associata all'infezione da PWN⁴. Tuttavia, a causa del numero ridotto di campioni e della variabilità delle condizioni naturali, i cambiamenti rilevabili sono stati registrati solo per la metà dei campioni. In un altro studio che ha utilizzato piantine di pino coltivate in serra, anche se le condizioni ambientali erano più facilmente controllabili, la diversità genetica naturale del pino ha indotto una grande variabilità nei volatili estratti⁵. Poiché i volatili di pino indotti da malattie possono essere fortemente influenzati dalla variazione ambientale e genetica, il ricorso a colture di germogli in vitro è una buona alternativa per gli studi sulla risposta chimica e biochimica del tessuto di pino all'infezione da PWN ^5,6. Propagando un genotipo vegetale in vitro, il suo corredo genetico può essere mantenuto e clonato indefinitamente, portando alla creazione di un numero maggiore di individui geneticamente identici in meno spazio e in meno tempo rispetto alle condizioni in vivo. Queste colture sono un semplice sistema di lavoro in condizioni nutrizionali e ambientali facilmente manipolabili, quindi offrono ulteriori vantaggi ai sistemi convenzionali nella valutazione della produzione e dell'emissione di sostanze volatili ^7,8. Questi sistemi sono particolarmente vantaggiosi per la ricerca sulle specie legnose, che il più delle volte richiedono risorse considerevoli, ad esempio gli alberi bersaglio si trovano a volte in siti difficili da raggiungere, richiedono attrezzature costose, una forza lavoro dedicata e periodi di analisi più lunghi⁸. In vitro, le co-colture di pini con il nematode del pino consentono di valutare le interazioni metaboliche tra il nematode e la pianta in diversi stadi⁹. Per l'analisi dei volatili, questo è molto importante poiché le tecniche di profilazione sono diventate estremamente accurate e piccole variazioni nel campionamento possono comportare cambiamenti sostanziali nei profili volatili. La gascromatografia accoppiata alla spettrometria di massa (GC-MS) è una potente tecnica per l'analisi dei volatili e consente una profilazione rapida e semplificata dei volatili¹⁰. Il protocollo qui presentato descrive le tecniche per infettare in vivo le piantine di pino in condizioni di serra e le colture in vitro di germogli di pini geneticamente identici ottimizzate per l'estrazione e la profilazione dei volatili indotti.

Protocollo

1. Coltivazione in vitro di nematode del pino

NOTA: I nematodi del pino vengono coltivati nutrendosi del micelio fungino di un ceppo non sporulante di Botrytis cinerea (de Bary) Whetzel¹¹.

1. Per la sottocoltura di routine, trasferire un tappo di coltura (0,5 cm di diametro) dal bordo più esterno della colonia fungina su una piastra di agar di destrosio di patate sterile (PDA) e mantenerlo a 25 ± 1 °C per 7-10 giorni, o fino a quando la colonia fungina non raggiunge il bordo della piastra.
   NOTA: Altri tipi di terreno di coltura fungina generale possono essere utilizzati per la crescita fungina.
2. Per ottenere maggiori quantità di nematode del pino, utilizzare B. cinerea coltivato in vitro su chicchi di orzo biologico certificato idratato sterilizzato a vapore (Hordeum vulgare L.). Aggiungere 15 g di cereali a 15 ml di acqua ultrapura, in fiasche di Erlenmeyer da 250 ml a collo largo coperte e sterilizzare. Successivamente, inoculare con un tappo di coltura di B. cinerea e conservare a 25 ± 1 °C per 7-10 giorni o fino a quando la superficie del cereale non è completamente colonizzata¹².
   NOTA: I nematodi a scopo di ricerca possono essere richiesti ai laboratori nazionali di riferimento per i nematodi parassiti delle piante.
3. Iniziare le colture di nematode del pino inoculando colture in vitro di B. cinerea con una sospensione acquosa di nematode del piombro, contenente un minimo di 20 maschi e 30 femmine, e mantenerle al buio nelle condizioni precedentemente descritte, per 7-10 giorni o fino a quando la colonia fungina non è completamente consumata e la popolazione di nematode del piombro, inizia ad arrampicarsi sulle pareti della piastra o del pallone (Figura 1). Sigillare le piastre o i palloni con pellicola di plastica per evitare l'essiccazione.
   NOTA: Le femmine possono essere distinte dal lembo vulvare, dal lungo sacco post-uterino e da un termine della coda generalmente rotondo; I maschi hanno un'estremità della coda appuntita curva ventralmente con spicole caratteristiche¹³. Quando si pipettano le sospensioni di PWN, striare la colonia di funghi in modo che la sospensione pipettata non formi goccioline sulla superficie fungina, intrappolando le PWN attraverso la tensione superficiale.
4. Isolare le PWN sciacquando le pareti del pallone con acqua di rubinetto, versando il contenuto su un tovagliolo di carta in un imbuto o vassoio Baermann e immergendolo in acqua¹⁴. Dopo 24-48 ore, i nematodi vivi si sarebbero trasferiti dal materiale infetto all'acqua. Recuperarli setacciandoli con un setaccio a maglie da 38 μm¹⁵. Lavare le nematode del pino accumulate in un contenitore con acqua di rubinetto.
   NOTA: Qualsiasi materiale che venga a contatto con il nematode del pino deve essere adeguatamente decontaminato in quanto si tratta di un organismo da quarantena; L'immersione in etanolo per 10-20 minuti è solitamente sufficiente. Le sospensioni acquose scartate devono essere sterilizzate o riscaldate a 60 °C per almeno 35 minuti.
5. Utilizzare immediatamente la sospensione acquosa contenente le nematode del pino o conservarla a 11 °C per un periodo di conservazione più lungo (fino a 2 mesi).

2. Sterilizzazione di nematodi di pino misti in fase di vita

1. In una cappa a flusso, pipettare un volume di sospensione di PWN contenente circa 5000 PWN in un setaccio sterile a maglie da 38 μm e lavare con acqua sterile.
   NOTA: Contare i nematodi al microscopio binoculare (40x).
2. Immergere la metà inferiore del setaccio contenente le PWN in una soluzione di perossido di idrogeno al 20% (H₂O₂) e mescolare manualmente per 15 minuti.
3. Lavare le PWN sterili erogando acqua sterile attraverso il setaccio. Ripeti questo passaggio 3 volte. Nell'ultimo lavaggio inclinare il setaccio in modo che le nematode del peso si raccolgano sul bordo del setaccio. Recuperare la sospensione sterile di nematodi pipettando 1 mL di acqua sterile nel bordo del setaccio e conservarla a 11 °C o utilizzarla immediatamente.
   NOTA: Il successo della sterilizzazione può essere valutato placcando un'aliquota di 100 μL della sospensione PWN in un mezzo PDA e monitorando regolarmente le contaminazioni per circa 1 settimana.

3. Infezione di piantine in vivo di Pinus pinaster

NOTA: Le prove di inoculazione vengono eseguite in piantine ≥ di P. pinaster di 2 anni. Gli alberi possono essere acquistati da rivenditori commerciali certificati, ma possono anche essere coltivati in serra da semi certificati.

1. Ottenere l'inoculo di PWN come descritto nella fase 1 e impostare le sospensioni di PWN in fase di vita mista a 1000 PWN/mL aggiungendo acqua alla sospensione o attendendo che i nematodi si depositino (circa 60 minuti) e abbassando il volume travasando l'acqua superficiale. Eseguire il conteggio a temperatura ambiente in un vetrino concavo al microscopio binoculare a 40x.
2. Per iniziare l'inoculazione, rimuovere manualmente gli aghi da una sezione al di sotto dei 5 cm superiori del gambo di pino e praticare un'incisione longitudinale superficiale (da 0,5 a 1 cm di lunghezza) con un bisturi sterilizzato¹⁶.
   NOTA: L'incisione viene eseguita per consentire al nematode di accedere ai tessuti interni del pino.
3. Nella zona della ferita, posizionare un pezzo di cotone sterilizzato in modo da contenere 0,5 ml di sospensione pipettata di PWN e fissarlo con una striscia trasparente per mantenere l'umidità.
   NOTA: Mescolare energicamente la sospensione di PWN tra ogni inoculazione perché i nematodi si depositeranno rapidamente. Se la sospensione si asciuga nel sito di inoculazione, l'infezione da nematodi può non avere successo, quindi coprire adeguatamente il cotone umido.
4. Per i pini di controllo, sostituire la sospensione PWN con acqua sterile.
5. Seguire regolarmente la progressione della PWD e valutare la sintomatologia quantificando la percentuale di aghi scoloriti e appassiti. Punteggio 0 per assenza di sintomi esterni, 1 per uno scolorimento dell'ago fino al 25%, 2 per uno scolorimento dell'ago compreso tra il 25% e il 50%, 3 per un periodo compreso tra il 50% e il 75% dello scolorimento dell'ago e 4 per pini con aghi completamente marroni (Figura 2).
6. Mantenere la serra in condizioni di umidità (60%-80%) e annaffiare frequentemente (mantenere al 70% della capacità massima di ritenzione idrica del suolo), evitando temperature estreme poiché i nematodi diventano metabolicamente inattivi al di sotto dei 10 °C e lo sviluppo può essere influenzato al di sopra dei 30 °C.
7. A 20 giorni dall'inoculazione, raccogliere il materiale vegetale per l'estrazione dei volatili tagliando le piantine alla base del fusto e congelandole (-20 °C) in sacchetti di carta marrone. Per i volatili emessi (fibre SMPE o tubi impaccati), campionare immediatamente le piantine di pino, a temperatura ambiente ^5,17.

4. Insediamento e infezione di colture in vitro di germogli di pino

1. Prima della sterilizzazione superficiale, lavare i semi certificati di P. pinaster in acqua corrente del rubinetto per rimuovere i detriti più grandi, e poi con una soluzione detergente comune (1 goccia per 40 ml di acqua), agitando vigorosamente, per lavare i detriti più fini.
2. In una cappa di flusso, iniziare la sterilizzazione della superficie del seme aggiungendo una soluzione di candeggina commerciale (1:4, candeggina commerciale in acqua di rubinetto) fino a coprire i semi lavati e mescolare energicamente per 15 minuti. Smaltire la soluzione di candeggina e sciacquare i semi 3 volte con acqua di rubinetto sterilizzata.
3. Immergere i semi in una soluzione di etanolo (80%, v/v) per 15 minuti agitando vigorosamente, smaltire l'etanolo e lavare 3 volte con acqua ultrapura sterilizzata.
4. Per la germinazione dei pini, rompere i rivestimenti dei semi sterilizzati con un tornio meccanico sterile in una cappa a flusso, isolare i pinoli e metterli in un contenitore chiuso con carta da filtro bagnata sterilizzata per idratare i pinoli durante la notte⁶.
5. Stratificare i pinoli idrati a 4 °C per 7 giorni, per interrompere la dormienza e sincronizzare la germinazione, quindi mantenere al buio a 25 °C fino alla germinazione.
   NOTA: La fase di stratificazione è facoltativa.
6. Trasferire i pini germinati asettici, nel contenitore chiuso, in un fotoperiodo leggero di 16 ore, a 24 °C/ 18 °C e conservare per 2 settimane o fino a quando il fusto principale inizia a svilupparsi.
7. Nella cappa di flusso, tagliare la parte aerea della piantina sopra la radice con un bisturi e trasferirla in terreno di coltura sterilizzato Schenk e Hildebrandt (SH)¹⁸ (pH = 5,8) integrato con 30 g/L di saccarosio, 8 g/L di agar, 0,5 mg/L di 6-benzilamminopurina (BAP, una citochinina) e 0,1 mg/L di acido indolo-3-butirrico (IBA, un'auxina)⁶, per indurre la moltiplicazione dei microgermogli. Conservare le colture nelle condizioni sopra descritte in una camera di crescita per colture in vitro .
8. Nella cappa di flusso, sottocoltura periodica (circa 4 settimane) tagliando il tessuto calloso alla base del germoglio (parte a contatto con il terreno di coltura) con un bisturi sterile e trasferendo il grappolo di germogli con una pinzetta sterile in un terreno di coltura di moltiplicazione fresco.
9. Per l'allungamento del microstelo, trasferire i microgermogli nel terreno di coltura SH sopra descritto ma contenente 3 g/L di carbone attivo al posto dei fitormoni.
   NOTA: Il carbone attivo assorbe le sostanze tossiche e previene l'eccessivo accumulo indotto di fitormoni sul tessuto sezionato¹⁹.
10. Per l'infezione da PWN, trasferire i germogli allungati nel terreno di coltura SH senza fitormoni o carbone attivo e aggiungere 100-150 PWN sterilizzati in fase di vita mista sul fondo del microgermoglio. Mantenere nelle condizioni sopra descritte fino a quando i sintomi della PWD iniziano a essere evidenti (Figura 3)⁶.
11. Per raccogliere materiale vegetale per l'estrazione di sostanze volatili, utilizzare immediatamente espianti in vitro o congelare (-20 °C) fino all'analisi. Per i volatili emessi (fibre SMPE o tubi impaccati), analizzare immediatamente le scatole microshoot.

5. Isolamento di composti volatili

NOTA: L'isolamento dei volatili può essere eseguito attraverso diverse tecniche. Qui, l'estrazione volatile viene effettuata mediante idrodistillazione, utilizzando un apparato di Clevenger²⁰, distillazione-estrazione, utilizzando un apparato di Likens-Nickerson²¹, e intrappolamento di volatili dello spazio di testa attraverso la microestrazione in fase solida (SPME) utilizzando fibre rivestite o tubi impaccati (sorbente polimerico poroso)²².

1. Idrodistillazione
   1. Utilizzare un apparecchio Clevenger per l'isolamento degli oli essenziali. Il sistema di distillazione è composto da a) l'apparecchio Clevenger, b) un pallone a fondo tondo o un Erlenmeyer per contenere l'acqua e il materiale di pino, c) un'adeguata apparecchiatura di riscaldamento e d) un telaio di supporto per tenere il sistema in posizione (Figura 4A).
   2. Pulire accuratamente la vetreria prima dell'uso. Utilizzare i morsetti del telaio da laboratorio per fissare l'apparato Clevenger al telaio a traliccio. Refrigerare il condensatore del sistema facendo circolare l'acqua o utilizzare un circolatore refrigerato, se disponibile.
   3. Registrare il peso del germoglio di pino e metterlo nel pallone a fondo tondo o nell'Erlenmeyer. Regolare la quantità di acqua per assicurarsi che il contenitore non sia pieno più della metà.
   4. Posizionare l'apparecchiatura di riscaldamento sotto il pallone, verificare l'assenza di perdite e assicurarsi che tutte le parti dell'impianto siano nella posizione corretta e fissate al telaio di supporto.
      NOTA: Le parti di collegamento in vetro smerigliato del Clevenger e del pallone devono essere accuratamente pulite, sgrassate e asciugate prima del collegamento. A tale scopo, utilizzare un pezzo di carta da filtro leggermente inumidito con acetone. Il grasso non deve essere utilizzato in queste parti.
   5. Introdurre l'acqua attraverso l'imbuto di riempimento, situato nel tubo diagonale di ritorno nella parte centrale dell'apparato Clevenger. Regolare la posizione del rubinetto a tre vie in modo che l'acqua scorra uniformemente nei due tubi (quello diagonale e quello graduato) fino al riempimento del pallone, appena prima di scendere dal tubo diagonale di ritorno al suo interno (vedere la Figura 4).
   6. Accendere la fonte di calore e regolarla per portare l'acqua a ebollizione a una velocità di distillazione di 2 - 3 ml/min.
   7. Iniziare il tempo di distillazione quando la prima goccia di acqua distillata cade nel tubo graduato sul lato destro dell'apparecchio di Clevenger. Il tempo medio di distillazione è di 3 ore^{e 23} ore, ma è possibile utilizzare periodi di distillazione più brevi o più lunghi a seconda delle esigenze specifiche. Gli oli essenziali si trovano tipicamente nel liquido surnatante poiché di solito sono più leggeri dell'acqua aromatica distillata sottostante (idrolato).
      ATTENZIONE: Quando la distillazione è in corso, l'apparecchio Clevenger sarà caldo al tatto.
   8. Una volta terminato il tempo di distillazione, spegnere il riscaldamento e lasciarlo riposare per circa 10 minuti per consentire l'arresto della distillazione e dell'ebollizione. Dopo 10 minuti, aprire il rubinetto in senso orario per far defluire l'idrolato fino a quando l'olio essenziale raggiunge la parte graduata. Leggi il volume di olio essenziale isolato. Calcolare la resa in mL/g (peso fresco o secco), espressa in percentuale (%, v/p).
   9. Nel caso di oli essenziali con volume inferiore a 0,05 mL, la graduazione più bassa nella provetta graduata, la resa non può essere determinata. Per recuperare l'olio essenziale, utilizzare n-pentano distillato per sciacquare l'apparato di Clevenger.
   10. Per recuperare l'olio essenziale utilizzando l'n-pentano distillato, una volta terminata la distillazione, attendere circa 10-15 minuti e aprire il rubinetto a tre vie in senso antiorario in modo che l'idrolato fuoriesca dal tubo diagonale di ritorno fino a poco sotto l'imbuto di riempimento. Con un contagocce pulito, introdurre l'n-pentano distillato nell'imbuto di riempimento fino al lato superiore sinistro del tubo diagonale di ritorno. Evitare di toccare l'imbuto di riempimento per evitare la contaminazione incrociata.
   11. Con un flacone di acqua distillata, introdurre l'acqua nell'imbuto di riempimento. L'n-pentano scorrerà fino al pallone di distillazione ed evaporerà con il calore residuo dell'acqua del decotto. In questo modo, attraverserà il sistema, dissolverà e trascinerà i volatili sulla superficie dell'idrolato, nel tubo graduato. Aprire il rubinetto a tre direzioni in senso orario fino alla sua posizione normale.
   12. Procedere come al punto 5.1.8. per raccogliere l'olio essenziale disciolto in n-pentano.
   13. Concentrare la miscela di olio essenziale e n-pentano fino a un volume minimo di circa 100 μl a temperatura ambiente sotto flusso di azoto utilizzando un sistema di evaporazione a spurgo. Conservarlo a -20 °C fino all'analisi.
       NOTA: Non concentrare sulla secchezza per evitare la perdita di composti volatili.
2. Distillazione-estrazione
   1. Usa l'apparato di Likens-Nickerson per estrarre sostanze volatili dalle piante. Il sistema di distillazione-estrazione è composto da a) l'apparecchio Likens-Nickerson, b) un pallone a fondo tondo per contenere l'acqua e il materiale di pino (braccio laterale destro dell'unità di distillazione) e un altro per contenere un solvente organico immiscibile, come l'n-pentano distillato (braccio laterale sinistro dell'unità di distillazione), c) due dispositivi di riscaldamento adeguati, d) un condensatore, ed e) un telaio di supporto per sostenere il sistema (Figura 4B).
      NOTA: Utilizzare n-pentano distillato in laboratorio per evitare la contaminazione del campione con stabilizzanti aggiunti di solvente.
   2. Iniziare facendo circolare l'acqua nel condensatore protetto o utilizzare un circolatore refrigerato, se disponibile.
   3. Utilizzare i morsetti del telaio da laboratorio per fissare l'unità di distillazione-estrazione al telaio a traliccio. Caricare il pallone a fondo tondo con il materiale di pino da estrarre e aggiungere acqua fino a metà della capacità. Il pallone più piccolo a fondo tondo da 100 ml deve essere pieno per metà di n-pentano distillato.
      NOTA: Prima del collegamento, le parti di collegamento in vetro smerigliato dei componenti in vetro devono essere ben pulite, sgrassate e asciugate. Per la pulizia è possibile utilizzare un pezzo di carta da filtro che è stato brevemente bagnato con acetone.
   4. Posizionare i mantelli riscaldanti sotto ogni pallone. Verificare che non vi siano perdite e che ogni componente del sistema sia correttamente posizionato e fissato al telaio reticolare del laboratorio. Accendere le fonti di calore e regolarle ai rispettivi punti di ebollizione. L'acqua dovrebbe bollire a una velocità di distillazione di 2-3 ml/min.
      ATTENZIONE: Durante il processo di distillazione-estrazione, l'apparecchio Likens-Nickerson risulterà caldo al tatto.
   5. Una volta terminato il tempo di distillazione, interrompere il riscaldamento dal pallone con materiale di pino e lasciare distillare l'n-pentano da solo per 10 minuti. Dopo che l'n-pentano si è trasformato in un liquido trasparente, interrompere il riscaldamento e lasciarlo riposare per circa 10 minuti. Il cambiamento di colore indica che il distillato è ora nel pallone con n-pentano.
   6. Concentrare l'estratto di n-pentano a pressione ridotta (70 - 73 mmHg) su un evaporatore rotante a temperatura ambiente. Trasferire l'estratto parzialmente concentrato in una fiala e concentrarlo a ≈100 μl sotto un flusso di azoto in un evaporatore a spurgo a temperatura ambiente. Dopo l'estrazione, conservare i campioni a -20 °C fino all'analisi.
      NOTA: L'estratto non deve essere concentrato fino a secchezza in quanto ciò indurrebbe la perdita di composti volatili.
3. Campionamento dello spazio di testa con una fibra rivestita
   1. La configurazione di microestrazione in fase solida (SPME) prevede a) un supporto SPME azionato manualmente, b) fibra rivestita e c) un supporto appropriato per supportare il supporto SPME (Figura 4C). Per il presente protocollo, utilizzare un sistema manuale nello spazio di testa SPME in fiala con fibra rivestita di polidimetilsilossano (PDMS) da 100 μM per intrappolare i volatili.
      NOTA: Altre fibre disponibili in commercio hanno rivestimenti con caratteristiche chimiche diverse e devono essere scelte in base all'effetto desiderato.
   2. Condizionare termicamente ciascuna fibra SPME per un massimo di 20 minuti a 250 °C prima dell'uso, secondo le raccomandazioni del produttore.
   3. Inserire il materiale di pino, o la parte di pino, in una fiala di vetro trasparente e sigillarla con un tappo a vite forato con un rivestimento in politetrafluoroetilene (PTFE) (setto). Il materiale deve trovarsi ad almeno 2 o 3 cm dalla parte superiore della fiala, in modo che la fibra non tocchi il campione.
   4. Eseguire esperimenti di controllo simultaneamente utilizzando le fibre SPME campionando le fiale vuote per identificare i contaminanti del sistema o per confermare l'assenza di carry-over dall'uso ripetuto delle fibre SPME.
   5. Conservare il materiale di pino all'interno della fiala per 1 ora prima della raccolta dei volatili per l'equilibrio dell'atmosfera.
      NOTA: I saggi con SPME possono essere eseguiti a temperatura ambiente o a temperatura regolabile sistemando le fiale in un rack di supporto e inserendole in un bagno a bagnomaria.
   6. Regolare la profondità dell'ago per piercing al setto dal supporto SPME per perforare il setto ma non entrare in contatto con il materiale quando la fibra è esposta.
   7. Con la fibra ritirata, inserire l'ago di supporto attraverso il rivestimento in PTFE. Spingere verso il basso lo stantuffo per esporre la fibra. Ruotare lo stantuffo in senso orario e tenere la vite di fissaggio sul lato orizzontale sinistro della scanalatura a Z²⁴. Esporre la fibra per 1 ora.
   8. Ritrarre la fibra ruotando lo stantuffo in senso antiorario fino a quando lo stantuffo raggiunge la parte superiore della scanalatura a Z. I volatili raccolti sono ora pronti per l'analisi diretta GC e/o GC-MS.
      NOTA: Se necessario, le fibre possono essere conservate a temperatura ambiente prima dell'analisi, ma non più di una settimana.
4. Intrappolamento dello spazio di testa con tubi impaccati
   1. Preparare una configurazione per l'intrappolamento dei volatili dello spazio di testa con trappole in acciaio inossidabile impaccate costituite da a) un sistema di pompaggio del flusso di massa, b) tubi in PTFE, c) filtri dell'aria a carboni attivi, d) tubi impacchettati in polimero di resina porosa ed e) sacchetti di vetreria o polietilene tereftalato (PET) (sacchetti da cucina) (Figura 4D)²⁵.
   2. Conservare il materiale di pino in vetreria coperta o all'interno di sacchetti in PET per accumulare sostanze volatili dello spazio di testa.
      NOTA: Tenere presente che i volatili della plastica comune sono abbondanti e possono essere rilevati in grandi quantità attraverso la GC-MS.
   3. Per un sistema a circuito chiuso, collegare il circuito come segue: a) l'uscita della pompa al tubo in PTFE, b) il tubo in PTFE ai filtri dell'aria a carboni attivi, c) dai filtri dell'aria al tubo aggiuntivo che si collega alla vetreria o ai sacchetti in PET con il materiale in pino, d) il tubo imballato all'uscita della vetreria o del sacchetto in PET, e) tubo aggiuntivo in PTFE dall'uscita del tubo in acciaio inossidabile all'ingresso della pompa di portata massica²².
      NOTA: I tubi in acciaio inossidabile impacchettati in polimero poroso devono essere condizionati termicamente nell'unità di desorbimento termico secondo le raccomandazioni del produttore, ad esempio fino a 15 minuti a 100 °C, prima dell'uso. Attenzione che i tubi hanno una direzione del flusso che deve essere rispettata.
   4. Raccogli i volatili pompando 100 L di aria filtrata attraverso il sistema a pino a 0,6 L al minuto, utilizzando la pompa a flusso di massa per controllare la quantità e la velocità di aria filtrata.
      NOTA: La quantità e/o il flusso d'aria nello spazio di testa che scorre attraverso la colonna può influenzare la quantità di volatili intrappolati e, successivamente, il cromatogramma ottenuto.
   5. Dopo la raccolta dei volatili, chiudere i tubi imballati su entrambe le estremità con tappi ermetici. Conservare a temperatura ambiente (per un massimo di 1 settimana) e analizzare il prima possibile, poiché i volatili possono degradarsi o fuoriuscire.
   6. Per il lavaggio, sciacquare tutti i tubi in PTFE e la vetreria con etanolo al 70% e riscaldare in forno a 230 °C per almeno 2 ore^{e 25} minuti.

6. Analisi dei profili volatili

1. Eseguire l'analisi dei profili volatili attraverso la gascromatografia-spettrometria di massa (GC-MS), o di routine attraverso la gascromatografia con rilevamento a ionizzazione di fiamma (GC-FID) per la quantificazione di volatili precedentemente identificati.
   NOTA: La descrizione dei metodi di analisi da parte di GC-FID e GC-MS è ampia e va oltre l'obiettivo del presente lavoro. Si consiglia al lettore di utilizzare procedure o standard in laboratorio, come ISO 7609²⁶, che forniscono condizioni operative rilevanti sulla quantificazione dei singoli costituenti e dati di letteratura sul confronto di due metodi analitici²⁷.
2. Utilizzare analiti puri o contenuti in un solvente, ad esempio n-pentano o n-esano, e direttamente iniettati o adsorbiti in una fibra, ad esempio SPME e desorbiti direttamente nell'iniettore del cromatografo o utilizzando un'unità di desorbimento termico (TD) collegata all'unità GC.
   NOTA: Nonostante la maggiore sensibilità, la risoluzione più elevata e il tempo di analisi più breve, le colonne capillari hanno una bassa capacità di campionamento. Pertanto, sebbene quasi tutte le condizioni operative possano essere simili, il tipo di analita (puro, in solvente, SPME, ecc.) può richiedere diverse procedure di iniezione split/split less.
3. Effettuare l'identificazione dei componenti volatili confrontando i loro indici di ritenzione, valutati in conformità alla norma ISO 7609, con gli spettri GC-MS provenienti da una libreria creata in laboratorio utilizzando campioni di riferimento la cui identità dei componenti è stata stabilita da RI, GC-MS e ¹³C-NMR, composti sintetizzati e isolati in laboratorio e standard disponibili in commercio o, in mancanza di questi, librerie di spettri di massa disponibili in commercio.
4. Esprimere i risultati utilizzando una rappresentazione grafica (cromatogramma) e un profilo cromatografico che elenca le quantità relative di tutti i composti identificati nel campione, con il loro ordine di eluizione indicato dai loro indici di ritenzione nell'apposita colonna utilizzata.
5. Per un numero elevato di campioni, eseguire un'adeguata valutazione dell'analisi statistica basata sulla composizione chimica per l'interpretazione della disposizione dei campioni (raggruppamenti e/o separazioni).

Risultati

Il nematode del pino si riproduce rapidamente in condizioni ottimali e i tempi di generazione possono essere di soli 4 giorni, con ogni femmina che depone circa 80 uova durante la sua vita²⁸. Utilizzando la metodologia sopra descritta, è possibile ottenere grandi quantità di PWN a seconda della crescita fungina. Entro un periodo di crescita di 8 giorni, le nematodi del pino possono avere un aumento di 100 volte del numero di popolazione (Fig...

Discussione

Il protocollo qui presentato delinea una metodologia avanzata per analizzare i composti volatili nel pino marittimo infettato dal PWN, dove la variabilità ambientale e genetica è ridotta e non influenza i risultati. Utilizzando linee pure di genotipi di pino marittimo in vitro , i volatili estratti ed emessi possono essere analizzati come risposta ospite a una delle minacce biotiche più dannose per le pinete.

Il mantenimento delle colture di riferi...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
38 mesh test sieve	Retsch	60.131.000038
6-Benzylaminopurine (6-BAP)	Duchefa Biochemie	B0904
Charcoal activated	Duchefa Biochemie	C1302
Clevenger apparatus	WINZER Laborglastechnik	25-000-02
Hydrogen peroxide solution	Sigma-Aldrich	H1009-500ML
Indole-3-butyric acid (IBA)	Duchefa Biochemie	I0902
Likens-Nickerson apparatus	VitriLab LDA.	c/IN29/32
Microbox round containers	Sac O2	O118/80+OD118
n-Pentane	Sigma-Aldrich	1.00882
PARAFILM M sealing film	BRAND	HS234526B-1EA
Phyto agar	Duchefa Biochemie	P1003
Potato Dextrose Agar	BD DIFCO	213400
Scalpel blade no. 24	Romed Holland	BLADE24
Schenk & Hildebrandt Basal salt medium	Duchefa Biochemie	S0225
Schenk & Hildebrandt vitamin mixture	Duchefa Biochemie	S0411
SPME fiber assembly Polydimethylsiloxane (PDMS)	Supelco	57300-U
SPME Fiber Holder	Supelco	57330-U
Sucrose	Duchefa Biochemie	S0809
Tenax TA- stainless steel tubes- conditioned + capped	Markes International	C1-AAXX-5003