Infecção de Pinus In Vivo e In Vitro com o Nematóide Bursaphelenchus xylophilus e Isolamento de Voláteis Induzidos

Resumo

O protocolo descreve a infecção in vivo e in vitro do nematoide Pinus pinaster e sua análise volatilomática por meio de Cromatografia Gasosa (GC) e GC acoplada à Espectrometria de Massas (GC-MS).

Resumo

O nematoide do pinheiro (PWN) é um fitoparasita que causa a doença da murcha do pinheiro (PWD) em espécies de coníferas. Este nematóide parasita de plantas contribuiu fortemente para o desmatamento de pinheiros em países asiáticos, por exemplo, Japão, China e Coréia. Nas últimas duas décadas, na Europa, Portugal e Espanha foram muito afetados. A pesquisa sobre os mecanismos de infecção do PWN e/ou progressão da PWD em espécies hospedeiras suscetíveis baseia-se na infecção controlada de mudas de pinheiro em condições de casa de vegetação. Essa técnica é trabalhosa e mobiliza recursos econômicos e humanos substanciais. Além disso, pode ser propenso à variabilidade que resulta da diversidade genética associada a algumas espécies de pinheiros, mas também da interferência de fatores externos. Como alternativa, as coculturas in vitro de pinus com NMPs oferecem um sistema mais vantajoso para o estudo de alterações bioquímicas, uma vez que a) permitem o controle de variáveis ambientais ou nutricionais isoladas, b) ocupam menos espaço, c) requerem menos tempo para serem obtidas e d) são livres de contaminação ou de variação genética do hospedeiro. O protocolo a seguir detalha a infecção padrão in vivo do PWN de Pinus pinaster, o pinheiro marítimo, e o estabelecimento das novas co-culturas in vitro de brotos de pinheiro com o PWN como uma metodologia aprimorada para estudar a influência desse fitoparasita nos voláteis do pinheiro. Os voláteis induzidos pelo NMP são extraídos de pinheiros in vivo e in vitro infectados por hidrodestilação e destilação-extração, e os voláteis emitidos são capturados por microextração em fase sólida (SPME), utilizando técnicas de fibra ou coluna compactada.

Introdução

O nematóide da madeira do pinheiro (PWN), Bursaphelenchus xylophilus (Steiner & Bührer 1934) Nickle 1970, é um nematóide parasita de plantas que parasita principalmente espécies de Pinus . Este fitoparasita é vetorizado por insetos do gênero Monochamus em árvores de espécies suscetíveis de pinheiro durante a maturação alimentar do inseto. O NMP mata a árvore atacando seus canais de resina e reduzindo o fluxo de resina, e danificando seu tecido vascular, causando interrupções na coluna d'água. A falta de água na copa das árvores induz os primeiros sintomas visíveis da doença da murcha do pinheiro (PWD), ou se....

Protocolo

1. Cultivo in vitro de nematóides de madeira de pinho

NOTA: Os nematóides da madeira de pinho são cultivados alimentando-se do micélio fúngico de uma cepa não esporulante de Botrytis cinerea (de Bary) Whetzel¹¹.

1. Para subcultura de rotina, transferir um tampão de cultura (0,5 cm de diâmetro) da borda mais externa da colónia fúngica para uma placa de ágar dextrose de batata estéril (PDA) e manter a 25 ± 1 °C durante 7 a 10 dias, ou até que a colónia de fungos atinja o bordo da placa.
   NOTA: Outros tipos de meio de crescimento fúng....

Discussão

O protocolo aqui apresentado descreve uma metodologia aprimorada para analisar compostos voláteis em pinheiro-bravo infectado pelo NMP, onde a variabilidade ambiental e genética é reduzida e não influencia os resultados. Utilizando linhagens puras de genótipos de pinheiro-bravo in vitro , os voláteis extraídos e emitidos podem ser analisados como resposta do hospedeiro a uma das ameaças bióticas mais prejudiciais às florestas de pinus.

A man.......

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
38 mesh test sieve	Retsch	60.131.000038
6-Benzylaminopurine (6-BAP)	Duchefa Biochemie	B0904
Charcoal activated	Duchefa Biochemie	C1302
Clevenger apparatus	WINZER Laborglastechnik	25-000-02
Hydrogen peroxide solution	Sigma-Aldrich	H1009-500ML
Indole-3-butyric acid (IBA)	Duchefa Biochemie	I0902
Likens-Nickerson apparatus	VitriLab LDA.	c/IN29/32
Microbox round containers	Sac O2	O118/80+OD118
n-Pentane	Sigma-Aldrich	1.00882
PARAFILM M sealing film	BRAND	HS234526B-1EA
Phyto agar	Duchefa Biochemie	P1003
Potato Dextrose Agar	BD DIFCO	213400
Scalpel blade no. 24	Romed Holland	BLADE24
Schenk & Hildebrandt Basal salt medium	Duchefa Biochemie	S0225
Schenk & Hildebrandt vitamin mixture	Duchefa Biochemie	S0411
SPME fiber assembly Polydimethylsiloxane (PDMS)	Supelco	57300-U
SPME Fiber Holder	Supelco	57330-U
Sucrose	Duchefa Biochemie	S0809
Tenax TA- stainless steel tubes- conditioned + capped	Markes International	C1-AAXX-5003