Infecção de Pinus In Vivo e In Vitro com o Nematóide Bursaphelenchus xylophilus e Isolamento de Voláteis Induzidos

Resumo

O protocolo descreve a infecção in vivo e in vitro do nematoide Pinus pinaster e sua análise volatilomática por meio de Cromatografia Gasosa (GC) e GC acoplada à Espectrometria de Massas (GC-MS).

Resumo

O nematoide do pinheiro (PWN) é um fitoparasita que causa a doença da murcha do pinheiro (PWD) em espécies de coníferas. Este nematóide parasita de plantas contribuiu fortemente para o desmatamento de pinheiros em países asiáticos, por exemplo, Japão, China e Coréia. Nas últimas duas décadas, na Europa, Portugal e Espanha foram muito afetados. A pesquisa sobre os mecanismos de infecção do PWN e/ou progressão da PWD em espécies hospedeiras suscetíveis baseia-se na infecção controlada de mudas de pinheiro em condições de casa de vegetação. Essa técnica é trabalhosa e mobiliza recursos econômicos e humanos substanciais. Além disso, pode ser propenso à variabilidade que resulta da diversidade genética associada a algumas espécies de pinheiros, mas também da interferência de fatores externos. Como alternativa, as coculturas in vitro de pinus com NMPs oferecem um sistema mais vantajoso para o estudo de alterações bioquímicas, uma vez que a) permitem o controle de variáveis ambientais ou nutricionais isoladas, b) ocupam menos espaço, c) requerem menos tempo para serem obtidas e d) são livres de contaminação ou de variação genética do hospedeiro. O protocolo a seguir detalha a infecção padrão in vivo do PWN de Pinus pinaster, o pinheiro marítimo, e o estabelecimento das novas co-culturas in vitro de brotos de pinheiro com o PWN como uma metodologia aprimorada para estudar a influência desse fitoparasita nos voláteis do pinheiro. Os voláteis induzidos pelo NMP são extraídos de pinheiros in vivo e in vitro infectados por hidrodestilação e destilação-extração, e os voláteis emitidos são capturados por microextração em fase sólida (SPME), utilizando técnicas de fibra ou coluna compactada.

Introdução

O nematóide da madeira do pinheiro (PWN), Bursaphelenchus xylophilus (Steiner & Bührer 1934) Nickle 1970, é um nematóide parasita de plantas que parasita principalmente espécies de Pinus . Este fitoparasita é vetorizado por insetos do gênero Monochamus em árvores de espécies suscetíveis de pinheiro durante a maturação alimentar do inseto. O NMP mata a árvore atacando seus canais de resina e reduzindo o fluxo de resina, e danificando seu tecido vascular, causando interrupções na coluna d'água. A falta de água na copa das árvores induz os primeiros sintomas visíveis da doença da murcha do pinheiro (PWD), ou seja, as agulhas do pinheiro tornam-se cloróticas após a cessação da fotossíntese e queda devido à dessecação. O pinheiro geralmente responde ao estresse biótico e abiótico por meio da produção de resina e compostos voláteis¹. Assim, entender os mecanismos de defesa do pinus é importante para determinar os efeitos específicos dos ataques do NMP e encontrar métodos alternativos para o controle de pragas².

Atualmente, a experimentação em condições de campo depende da disponibilidade de pinheiros infectados, da confirmação da infecção do NMP e das condições ambientais variáveis. Em condições de estufa, esses parâmetros podem ser controlados com mais facilidade; no entanto, a diversidade genética do hospedeiro torna-se uma forte fonte de variabilidade³. Por exemplo, em um estudo sobre a resposta de resistência de Pinus pinaster, a produção do terpeno limoneno e dos ácidos resinosos foi associada à infecção pelo NMP⁴. No entanto, devido ao pequeno número de amostras e à variabilidade das condições naturais, alterações detectáveis foram registradas apenas para metade das amostras. Em outro estudo utilizando mudas de pinus cultivadas em casa de vegetação, embora as condições ambientais fossem mais facilmente controladas, a diversidade genética natural do pinus induziu uma grande variabilidade nos voláteis extraídos⁵. Uma vez que os voláteis de pinheiro induzidos por doenças podem ser muito influenciados pela variação ambiental e genética, recorrer a culturas de brotações in vitro é uma boa alternativa para estudos sobre a resposta química e bioquímica do tecido de pinheiro à infecção pelo NMP ^5,6. Ao propagar um genótipo de planta in vitro, sua composição genética pode ser mantida e clonada indefinidamente, levando ao estabelecimento de uma quantidade maior de indivíduos geneticamente idênticos em menos espaço e em menos tempo do que em condições in vivo. Essas culturas são um sistema de trabalho simples sob condições nutricionais e ambientais facilmente manipuláveis, por isso oferecem vantagens adicionais aos sistemas convencionais na avaliação da produção e emissão de voláteis ^7,8. Esses sistemas são particularmente vantajosos para a pesquisa em espécies lenhosas, que na maioria das vezes requerem recursos substanciais, ou seja, as árvores-alvo às vezes estão localizadas em locais de difícil acesso, requerem equipamentos caros, força de trabalho dedicada e períodos de análise mais longos⁸. In vitro, as coculturas de pinheiros com o NMP permitem a avaliação das interações metabólicas entre o nematoide e a planta em diferentes estágios⁹. Para a análise de voláteis, isso é muito importante, pois as técnicas de criação de perfis tornaram-se altamente precisas e variações mínimas na amostragem podem resultar em mudanças substanciais nos perfis voláteis. A cromatografia gasosa acoplada à espectrometria de massas (GC-MS) é uma técnica poderosa para a análise de voláteis e permite um perfil rápido e simplificado de voláteis¹⁰. O protocolo aqui apresentado descreve técnicas para infectar mudas de pinus in vivo em condições de casa de vegetação e culturas de brotos in vitro de pinheiros geneticamente idênticos otimizadas para a extração e perfilamento de voláteis induzidos.

Protocolo

1. Cultivo in vitro de nematóides de madeira de pinho

NOTA: Os nematóides da madeira de pinho são cultivados alimentando-se do micélio fúngico de uma cepa não esporulante de Botrytis cinerea (de Bary) Whetzel¹¹.

1. Para subcultura de rotina, transferir um tampão de cultura (0,5 cm de diâmetro) da borda mais externa da colónia fúngica para uma placa de ágar dextrose de batata estéril (PDA) e manter a 25 ± 1 °C durante 7 a 10 dias, ou até que a colónia de fungos atinja o bordo da placa.
   NOTA: Outros tipos de meio de crescimento fúngico geral podem ser usados para o crescimento fúngico.
2. Para obter maiores quantidades de NMPs, use B. cinerea cultivada in vitro em grãos de cevada orgânicos certificados hidratados esterilizados a vapor (Hordeum vulgare L.). Adicione 15 g de cereais a 15 mL de água ultrapura, em frascos Erlenmeyer cobertos de 250 mL e esterilize. Em seguida, inocular com um tampão de cultura de B. cinerea e manter a 25 ± 1 °C por 7 a 10 dias ou até que a superfície do cereal esteja totalmente colonizada¹².
   NOTA: Os nematóides para fins de pesquisa podem ser solicitados aos laboratórios nacionais de referência para nematóides parasitas de plantas.
3. Iniciar as culturas do NMP inoculando culturas in vitro de B. cinerea com uma suspensão aquosa do NMP (contendo um mínimo de 20 machos e 30 fêmeas) e mantê-las no escuro nas condições descritas anteriormente, durante 7 a 10 dias ou até que a colónia fúngica seja completamente consumida e a população do NMP comece a escalar as paredes da placa ou do frasco (figura 1). Sele as placas ou frascos com filme plástico para evitar a dessecação.
   NOTA: As fêmeas podem ser distinguidas pelo retalho vulvar, saco pós-uterino longo e um terminal de cauda geralmente redondo; Os machos têm um terminal de cauda pontiagudo ventralmente curvo com espículas características¹³. Ao pipetar suspensões de NMP, risque a colônia de fungos para que a suspensão pipetada não forme gotículas na superfície do fungo, prendendo os NMPs através da tensão superficial.
4. Isolar os nemátodo do pinheiro enxaguando as paredes do frasco com água da torneira, despejando o conteúdo em uma toalha de papel em um funil ou bandeja de Baermann e imergindo com água¹⁴. Após 24 a 48 h, os nematóides vivos teriam sido transferidos do material infectado para a água. Recupere-os peneirando com uma peneira de malha de 38 μm¹⁵. Lavar os nemátodo do pinheiro acumulados para um recipiente com água da torneira.
   NOTA: Qualquer material que entre em contacto com o nemátodo do pinheiro deve ser devidamente descontaminado, uma vez que se trata de um organismo de quarentena; A imersão em etanol por 10 a 20 min geralmente é suficiente. As suspensões aquosas rejeitadas devem ser esterilizadas ou aquecidas a 60 °C durante pelo menos 35 min.
5. Utilizar imediatamente a suspensão aquosa que contém os nemátodo do pinheiro ou mantê-la a 11 °C durante um período de armazenamento mais longo (até 2 meses).

2. Esterilização de nematóides mistos de madeira de pinho em estágio de vida

1. Numa capela de fluxo, pipetar um volume de suspensão de NMP contendo cerca de 5000 NMP para um peneiro de malha estéril de 38 μm e lavar com água estéril.
   NOTA: Conte os nematóides sob um microscópio binocular (40x).
2. Mergulhar a metade inferior do crivo que contém os NMP numa solução de peróxido de hidrogénio (H₂O₂) a 20% e misturar manualmente durante 15 min.
3. Lave os nemáculos do pinheiro estéreis distribuindo água estéril pela peneira. Repita esta etapa 3x. Na última lavagem, incline o crivo de modo a que os nemátodo do pinheiro se recolham na borda do crivo. Recuperar a suspensão estéril de nemátodes pipetando 1 ml de água estéril no bordo do crivão e conservar a 11 °C ou utilizar imediatamente.
   NOTA: O sucesso da esterilização pode ser avaliado plaqueando uma alíquota de 100 μL da suspensão do NMP em um meio PDA e monitorando regularmente a presença de contaminações por cerca de 1 semana.

3. Infecção de mudas in vivo de Pinus pinaster

NOTA: Os testes de inoculação são realizados em ≥ mudas de P. pinaster de 2 anos de idade. As árvores podem ser adquiridas de varejistas comerciais certificados, mas também podem ser cultivadas em estufa a partir de sementes certificadas.

1. Obter o inóculo do NMP conforme descrito na etapa 1 e definir suspensões de NMPs mistos em estágio de vida para 1000 NMPs/mL adicionando água à suspensão ou esperando que os nematóides assentem (cerca de 60 min) e diminuindo o volume decantando a água superficial. Realizar a contagem à temperatura ambiente numa lâmina côncava ao microscópio binocular a 40x.
2. Para iniciar a inoculação, remova manualmente as agulhas de uma seção abaixo dos 5 cm superiores do caule do pinheiro e faça uma incisão longitudinal superficial (0,5 a 1 cm de comprimento) com bisturi^{esterilizado 16}.
   NOTA: A incisão é realizada para dar ao nematóide acesso aos tecidos internos do pinheiro.
3. Na zona de ferimento, coloque um pedaço de algodão esterilizado para conter 0,5 mL da suspensão PWN pipetada e fixe-o com uma tira transparente para manter a umidade.
   NOTA: Misture vigorosamente a suspensão do NMP entre cada inoculação, pois os nematóides se assentam rapidamente. Se a suspensão secar no local da inoculação, a infecção do nematóide pode não ser bem-sucedida, portanto, cubra o algodão úmido adequadamente.
4. Para os pinheiros de controlo, substitua a suspensão do NMP por água estéril.
5. Acompanhe a progressão da PWD regularmente e pontue a sintomatologia quantificando a porcentagem de agulhas descoloridas e murchas. Pontuação 0 para nenhum sintoma externo, 1 para até 25% de descoloração da agulha, 2 para entre 25% e 50% de descoloração da agulha, 3 para 50% a 75% de descoloração da agulha e 4 para pinheiros com agulhas completamente marrons (Figura 2).
6. Manter a estufa em condições húmidas (60%-80%) e regar frequentemente (manter a 70% da capacidade máxima de retenção de água do solo), evitando temperaturas extremas, uma vez que os nemátodes se tornam metabolicamente inativos abaixo de 10 °C e o desenvolvimento pode ser afetado acima de 30 °C.
7. Aos 20 dias após a inoculação, colher material vegetal para extração de voláteis, cortando as plântulas na base do caule e congelando (-20 °C) em sacos de papel pardo. Para voláteis emitidos (fibras SMPE ou tubos compactados), amostrar mudas de pinheiro imediatamente, à temperatura ambiente ^5,17.

4. Estabelecimento e infecção de culturas de brotos de pinheiro in vitro

1. Antes da esterilização da superfície, lave as sementes certificadas de P. pinaster em água corrente da torneira para remover os maiores detritos e, em seguida, com uma solução detergente comum (1 gota por 40 mL de água), com agitação vigorosa, para lavar os detritos mais finos.
2. Em uma capela de fluxo, inicie a esterilização da superfície da semente adicionando uma solução de alvejante comercial (1:4, alvejante comercial em água da torneira) até que as sementes lavadas estejam cobertas e misture vigorosamente por 15 min. Descarte a solução de alvejante e enxágue as sementes 3x com água da torneira esterilizada.
3. Mergulhe as sementes em uma solução de etanol (80%, v/v) por 15 min com agitação vigorosa, descarte o etanol e lave 3x com água ultrapura esterilizada.
4. Para a germinação do pinheiro, quebre os tegumentos esterilizados com um torno mecânico estéril em uma capela de fluxo, isole os pinhões e coloque-os em um recipiente fechado com papel de filtro úmido esterilizado para hidratar os pinhões durante a noite⁶.
5. Estratificar os pinhões hidratados a 4 °C durante 7 dias, para quebrar a dormência e sincronizar a germinação, e depois mantê-los escuros a 25 °C até à germinação.
   NOTA: A etapa de estratificação é opcional.
6. Transferir os pinheiros germinados assépticos, no recipiente fechado, para um fotoperíodo de luz de 16 h, a 24 °C/ 18 °C termoperíodo e manter por 2 semanas ou até que o caule principal comece a se desenvolver.
7. Na capela de fluxo, cortar a porção aérea da plântula acima da raiz com bisturi e transferir para meio de cultura esterilizado de Schenk e Hildebrandt (SH)¹⁸ (pH = 5,8) suplementado com 30 g/L de sacarose, 8 g/L de ágar, 0,5 mg/L de 6-benzilaminopurina (BAP, uma citocinina) e 0,1 mg/L de ácido indol-3-butírico (IBA, uma auxina)⁶, para induzir a multiplicação de microbrotos. Manter as culturas nas condições acima descritas numa câmara de crescimento de culturas in vitro .
8. Na capela de fluxo, subcultive periodicamente (cerca de 4 semanas) cortando o tecido caloso na base do broto (porção em contato com o meio de cultura) com um bisturi estéril e transferindo o cacho de brotos com pinças estéreis para um meio de cultura de multiplicação fresco.
9. Para alongamento do caule, transfira os microbrotos para o meio de cultura SH descrito acima, mas contendo 3 g/L de carvão ativado em vez de fitohormônios.
   NOTA: O carvão ativado adsorve tóxicos e evita o acúmulo excessivo de fitohormônios induzidos no tecido seccionado¹⁹.
10. Para a infecção por NMP, transfira brotos alongados para meio de cultura SH sem fitohormônios ou carvão ativado e adicione 100-150 NMPs esterilizados em estágio de vida misto na parte inferior do microbroto. Manter nas condições descritas acima até que os sintomas da PCD comecem a ser perceptíveis (Figura 3)⁶.
11. Para colher material vegetal para extração de voláteis, use explantes in vitro imediatamente ou congele (-20 °C) até a análise. Para voláteis emitidos (fibras SMPE ou tubos compactados), analise as caixas de microshoot imediatamente.

5. Isolamento de compostos voláteis

NOTA: O isolamento de voláteis pode ser realizado por meio de várias técnicas. Aqui, a extração volátil é feita por hidrodestilação, usando um aparelho de Clevenger²⁰, destilação-extração, usando um aparelho de Likens-Nickerson²¹, e aprisionamento de voláteis do headspace por meio de microextração em fase sólida (SPME) usando fibras revestidas ou tubos compactados (sorvente de polímero poroso) ²² .

1. Hidrodestilação
   1. Use um aparelho de Clevenger para o isolamento de óleos essenciais. O sistema de destilação é composto por a) o aparelho de Clevenger, b) um balão de fundo redondo ou um Erlenmeyer para reter a água e o material do pinho, c) equipamento de aquecimento adequado e d) uma estrutura de suporte para manter o sistema no lugar (Figura 4A).
   2. Limpe bem os copos antes de usar. Use a estrutura de laboratório clamps para prender o aparelho Clevenger à estrutura da treliça. Refrigere o condensador do sistema circulando água ou use um circulador refrigerado, se disponível.
   3. Registar o peso dos rebentos de pinheiro e colocá-lo no balão de fundo redondo ou no Erlenmeyer. Ajuste a quantidade de água para garantir que o recipiente não esteja mais do que meio cheio.
   4. Posicione o equipamento de aquecimento sob o frasco, verifique a ausência de vazamentos e certifique-se de que todas as partes do sistema estejam na posição correta e presas à estrutura de suporte.
      NOTA: As peças de conexão do vidro fosco do Clevenger e do frasco devem ser completamente limpas, desengorduradas e secas antes da conexão. Para isso, use um pedaço de papel de filtro levemente umedecido com acetona. A graxa não deve ser usada nessas peças.
   5. Introduzir água através do funil de enchimento, localizado no tubo diagonal de retorno na parte central do aparelho de Clevenger. Ajustar a posição da torneira de três vias de modo a que a água flua igualmente nos dois tubos (diagonal e graduado) até encher o balão, imediatamente antes de fluir do tubo diagonal de retorno para dentro dele (ver figura 4).
   6. Ligue a fonte de calor e ajuste-a para ferver a água a uma taxa de destilação de 2 - 3 mL / min.
   7. Inicie o tempo de destilação quando a primeira gota de água destilada cair no tubo graduado do lado direito do aparelho de Clevenger. O tempo médio de destilação é de 3 h²³, mas períodos de destilação mais curtos ou mais longos podem ser usados de acordo com os requisitos específicos. Os óleos essenciais estão tipicamente no líquido sobrenadante, pois geralmente são mais leves do que a água aromática destilada abaixo (hidrolato).
      CUIDADO: Quando a destilação estiver em andamento, o aparelho Clevenger estará quente ao toque.
   8. Terminado o tempo de destilação, pare o aquecimento e deixe repousar por cerca de 10 min para permitir que a destilação e a fervura parem. Após 10 min, abra a torneira no sentido horário para deixar o hidrolato escorrer até que o óleo essencial atinja a parte graduada. Leia o volume de óleo essencial isolado. Calcular o rendimento em ml/g (peso fresco ou seco), expresso em percentagem (%, v/m).
   9. No caso de óleos essenciais com volume abaixo de 0,05 mL, a menor graduação no tubo graduado, o rendimento não pode ser determinado. Para recuperar o óleo essencial, use n-pentano destilado para enxaguar o aparelho de Clevenger.
   10. Para recuperar o óleo essencial usando n-pentano destilado, uma vez terminada a destilação, espere cerca de 10 a 15 min e abra a torneira de três vias no sentido anti-horário para que o hidrolato flua para fora do tubo diagonal de retorno até um pouco abaixo do funil de enchimento. Com um conta-gotas limpo, introduza n-pentano destilado no funil de enchimento até o lado superior esquerdo do tubo diagonal de retorno. Evite tocar no funil de enchimento para evitar contaminação cruzada.
   11. Com uma garrafa de lavagem com água destilada, introduza água no funil de enchimento. O n-pentano fluirá para o frasco de destilação e evaporará com o calor residual da água de decocção. Dessa forma, ele percorrerá o sistema, dissolverá e arrastará os voláteis para a superfície do hidrolato, no tubo graduado. Abra a torneira de três vias no sentido horário para sua posição normal.
   12. Proceder como indicado no ponto 5.1.8. para coletar o óleo essencial dissolvido em n-pentano.
   13. Concentrar a mistura de óleo essencial e n-pentano a um volume mínimo de cerca de 100 μL à temperatura ambiente sob fluxo de nitrogênio usando um sistema de evaporação de purga. Manter a -20 °C até à análise.
       NOTA: Não se concentre até a secura para evitar a perda de compostos voláteis.
2. Destilação-extração
   1. Use o aparelho de Likens-Nickerson para extrair voláteis de plantas. O sistema de destilação-extracção é composto por a) o aparelho de Likens-Nickerson, b) um balão de fundo redondo para armazenar a água e o material de pinho (braço do lado direito da unidade de destilação) e outro para conter um solvente orgânico imiscível, como o n-pentano destilado (braço do lado esquerdo da unidade de destilação), c) dois dispositivos de aquecimento adequados, d) um condensador, e e) uma estrutura de suporte para segurar o sistema (Figura 4B).
      NOTA: Use n-pentano destilado em laboratório para evitar a contaminação da amostra com estabilizadores adicionados de solvente.
   2. Comece circulando água no condensador seguro ou use um circulador refrigerado, se disponível.
   3. Use grampos de estrutura de laboratório para prender a unidade de extração de destilação à estrutura de treliça. Carregar o balão de fundo redondo com o material de pinho a extrair e adicionar água até metade da capacidade. O balão menor de fundo redondo de 100 mL deve estar meio cheio de n-pentano destilado.
      NOTA: Antes de conectar, as peças de conexão do vidro fosco dos componentes de vidro precisam ser bem limpas, desengorduradas e secas. Um pedaço de papel de filtro que foi brevemente molhado com acetona pode ser usado para limpeza.
   4. Posicionar as mantas de aquecimento por baixo de cada balão. Verifique se não há vazamentos e se todos os componentes do sistema estão posicionados corretamente e fixados à estrutura da treliça do laboratório. Ligue as fontes de calor e ajuste-as aos seus respectivos pontos de ebulição. A água deve ferver a uma taxa de destilação de 2-3 mL / min.
      CUIDADO: Durante o processo de destilação-extração, o aparelho Likens-Nickerson estará quente ao toque.
   5. Terminado o tempo de destilação, pare o aquecimento do balão com material de pinho e deixe o n-pentano destilar sozinho por 10 min. Depois que o n-pentano mudar para um líquido transparente, pare o aquecimento e deixe repousar por cerca de 10 min. A mudança de cor indica que o destilado está agora no frasco com n-pentano.
   6. Concentrar o extracto de n-pentano sob pressão reduzida (70-73 mmHg) num evaporador rotativo à temperatura ambiente. Transferir o extracto parcialmente concentrado para um frasco para injectáveis e concentrar-se a ≈100 μL sob uma corrente de azoto num evaporador de purga à temperatura ambiente. Após a extração, manter as amostras armazenadas a -20 °C até à análise.
      NOTA: O extrato não deve ser concentrado até a secura, pois isso induzirá a perda de compostos voláteis.
3. Amostragem de headspace com uma fibra revestida
   1. A configuração de microextração em fase sólida (SPME) envolve a) um suporte de SPME operado manualmente, b) fibra revestida e c) um suporte apropriado para suportar o suporte de SPME ( Figura 4C ). Para o presente protocolo, use um sistema de headspace SPME manual no frasco com fibra revestida com polidimetilsiloxano (PDMS) de 100 μM para capturar voláteis.
      NOTA: Outras fibras disponíveis comercialmente possuem revestimentos com características químicas diferentes e devem ser escolhidas de acordo com o efeito desejado.
   2. Condicione cada fibra SPME termicamente por até 20 min a 250 °C antes de usar, de acordo com as recomendações do fabricante.
   3. Insira o material de pinho, ou parte de pinho, em um frasco de vidro transparente e feche-o com uma tampa de rosca com um revestimento de politetrafluoretileno (PTFE) (septo). O material deve estar a pelo menos 2 a 3 cm do topo do frasco, para que a fibra não toque na amostra.
   4. Realize experimentos de controle simultaneamente usando fibras SPME, amostrando frascos vazios para identificar contaminantes do sistema ou para confirmar a ausência de transferência do uso repetido das fibras SPME.
   5. Mantenha o material de pinho dentro do frasco para injetáveis por 1 h antes da coleta de voláteis para o equilíbrio da atmosfera.
      NOTA: Os ensaios com SPME podem ser executados à temperatura ambiente ou a uma temperatura ajustável, acomodando os frascos em um rack de suporte e inserindo-os em uma banheira de banho-maria.
   6. Ajuste a profundidade da agulha de perfuração do septo do suporte SPME para perfurar o septo, mas não para entrar em contato com o material quando a fibra estiver exposta.
   7. Com a fibra retirada, insira a agulha porta-suporte através do revestimento de PTFE. Empurre o êmbolo para baixo para expor a fibra. Gire o êmbolo no sentido horário e segure o parafuso de retenção no lado esquerdo horizontal da ranhura Z²⁴. Exponha a fibra por 1 h.
   8. Retraia a fibra girando o êmbolo no sentido anti-horário até que o êmbolo atinja o topo da ranhura Z. Os voláteis coletados estão agora prontos para análise direta de GC e/ou GC-MS.
      NOTA: Se necessário, as fibras podem ser armazenadas em temperatura ambiente antes da análise, mas não mais do que uma semana.
4. Captura de headspace com tubos compactados
   1. Prepare uma configuração para aprisionamento de voláteis de headspace com armadilhas de aço inoxidável embaladas consistindo em a) um sistema de bombeamento de fluxo de massa, b) tubulação de PTFE, c) filtros de ar de carvão ativado, d) tubos embalados de polímero de resina porosa e e) sacos de vidro ou tereftalato de polietileno (PET) (sacos de cozimento) (Figura 4D) ²⁵.
   2. Mantenha o material de pinho em copos cobertos ou dentro de sacos PET para acumular voláteis de headspace.
      NOTA: Esteja ciente de que os voláteis do plástico comum são abundantes e podem ser detectados em grandes quantidades através do GC-MS.
   3. Para um sistema de circuito fechado, conecte o circuito da seguinte forma: a) a saída da bomba à tubulação de PTFE, b) a tubulação de PTFE aos filtros de ar de carvão ativado, c) dos filtros de ar à tubulação adicional conectada aos vidros ou sacos PET com o material de pinho, d) o tubo embalado à saída do saco de vidro ou PET, e) tubulação adicional de PTFE da saída do tubo de aço inoxidável para a entrada da bomba de fluxo de massa²².
      NOTA: Os tubos de aço inoxidável embalados com polímero poroso devem ser condicionados termicamente na unidade de dessorção térmica de acordo com as recomendações do fabricante, por exemplo, até 15 min a 100 °C, antes do uso. Cuidado com o fato de que os tubos têm uma direção de fluxo que deve ser respeitada.
   4. Colete voláteis bombeando 100 L de ar filtrado através do sistema de pinho a 0,6 L por minuto, usando a bomba de fluxo de massa para controlar a quantidade e a taxa de ar filtrado.
      NOTA: A quantidade e/ou fluxo de ar do headspace que flui através da coluna pode influenciar a quantidade de voláteis retidos e, subsequentemente, o cromatograma obtido.
   5. Após a coleta de voláteis, feche os tubos embalados em ambas as extremidades com tampas de armazenamento herméticas. Armazene em temperatura ambiente (por no máximo 1 semana) e analise o mais rápido possível, pois os voláteis podem se degradar ou escapar.
   6. Para lavar, enxágue todos os tubos e copos de PTFE com etanol a 70% e aqueça em um forno a 230 °C por pelo menos 2 h²⁵.

6. Análise de perfis voláteis

1. Realizar análise de perfis voláteis através de cromatografia gasosa-espectrometria de massas (GC-MS), ou rotineiramente através de cromatografia gasosa com deteção por ionização de chama (GC-FID) para quantificação de voláteis previamente identificados.
   NOTA: A descrição dos métodos de análise por GC-FID e GC-MS é extensa e está além do objetivo do presente trabalho. O leitor é aconselhado a usar procedimentos ou padrões em laboratório, como a ISO 7609²⁶, que fornecem condições operacionais relevantes na quantificação de constituintes individuais e dados da literatura sobre a comparação de dois métodos analíticos²⁷.
2. Use analitos puros ou transportados em um solvente, por exemplo, n-pentano ou n-hexano, e injetados ou adsorvidos diretamente em uma fibra, por exemplo, SPME e dessorvidos diretamente no injetor de cromatógrafo ou usando uma unidade de dessorção térmica (TD) ligada à unidade de GC.
   NOTA: Apesar de sua maior sensibilidade, maior resolução e menor tempo de análise, as colunas capilares têm baixa capacidade amostral. Assim, embora quase todas as condições de operação possam ser semelhantes, o tipo de analito (puro, em solvente, SPME, etc.) pode exigir diferentes procedimentos de injeção dividida/dividida menos.
3. Realizar a identificação de componentes voláteis comparando seus índices de retenção, avaliados de acordo com a ISO 7609, com espectros de GC-MS de uma biblioteca criada em laboratório usando amostras de referência cuja identidade do componente foi estabelecida por RI, GC-MS e ¹³C-NMR, compostos sintetizados e isolados em laboratório e padrões comercialmente disponíveis ou, na falta deles, bibliotecas de espectros de massa disponíveis comercialmente.
4. Exprimir os resultados utilizando uma representação gráfica (cromatograma) e um perfil cromatográfico que enumere as quantidades relativas de todos os compostos identificados na amostra, com a sua ordem de eluição indicada pelos seus índices de retenção na coluna adequada utilizada.
5. Para um grande número de amostras, realizar uma avaliação de análise estatística adequada com base na composição química para interpretação do arranjo da amostra (agrupamentos e/ou separações).

Resultados

O NMP se reproduz rapidamente em condições ideais, e os tempos de geração podem ser tão baixos quanto 4 dias, com cada fêmea deitada cerca de 80 ovos durante sua vida²⁸. Usando a metodologia descrita acima, grandes quantidades de PWNs podem ser obtidas dependendo do crescimento do fungo. Dentro de um período de crescimento de 8 dias, os nemátodo do pinheiro podem ter um aumento de 100 vezes no número da população (Figura 1)...

Discussão

O protocolo aqui apresentado descreve uma metodologia aprimorada para analisar compostos voláteis em pinheiro-bravo infectado pelo NMP, onde a variabilidade ambiental e genética é reduzida e não influencia os resultados. Utilizando linhagens puras de genótipos de pinheiro-bravo in vitro , os voláteis extraídos e emitidos podem ser analisados como resposta do hospedeiro a uma das ameaças bióticas mais prejudiciais às florestas de pinus.

A man...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
38 mesh test sieve	Retsch	60.131.000038
6-Benzylaminopurine (6-BAP)	Duchefa Biochemie	B0904
Charcoal activated	Duchefa Biochemie	C1302
Clevenger apparatus	WINZER Laborglastechnik	25-000-02
Hydrogen peroxide solution	Sigma-Aldrich	H1009-500ML
Indole-3-butyric acid (IBA)	Duchefa Biochemie	I0902
Likens-Nickerson apparatus	VitriLab LDA.	c/IN29/32
Microbox round containers	Sac O2	O118/80+OD118
n-Pentane	Sigma-Aldrich	1.00882
PARAFILM M sealing film	BRAND	HS234526B-1EA
Phyto agar	Duchefa Biochemie	P1003
Potato Dextrose Agar	BD DIFCO	213400
Scalpel blade no. 24	Romed Holland	BLADE24
Schenk & Hildebrandt Basal salt medium	Duchefa Biochemie	S0225
Schenk & Hildebrandt vitamin mixture	Duchefa Biochemie	S0411
SPME fiber assembly Polydimethylsiloxane (PDMS)	Supelco	57300-U
SPME Fiber Holder	Supelco	57330-U
Sucrose	Duchefa Biochemie	S0809
Tenax TA- stainless steel tubes- conditioned + capped	Markes International	C1-AAXX-5003