Pinewood Nematode Bursaphelenchus xylophilus 에 의한 In Vivo 및 In Vitro Pines 감염 및 유도 휘발성 물질의 분리

요약

이 프로토콜은 Pinus pinaster의 in vivo 및 in vitro pinewood 선충 감염과 가스 크로마토그래피(GC) 및 질량 분석법(GC-MS)과 결합된 GC를 통한 휘발성 분석을 설명합니다.

초록

소나무 선충(PWN)은 침엽수 종에서 소나무 시들음병(PWD)을 일으키는 식물 기생충입니다. 이 식물 기생 선충은 일본, 중국, 한국과 같은 아시아 국가에서 소나무 삼림 벌채에 크게 기여했습니다. 지난 20년 동안 유럽에서는 포르투갈과 스페인이 큰 영향을 받았다. 감수성 숙주 종에서 PWN 감염 및/또는 PWD 진행 메커니즘에 대한 연구는 온실 조건에서 소나무 묘목의 통제된 감염에 의존합니다. 이 기술은 힘들고 상당한 경제적 및 인적 자원을 동원합니다. 또한 일부 소나무 종과 관련된 유전적 다양성뿐만 아니라 외부 요인의 간섭으로 인한 변동성이 발생하기 쉽습니다. 대안으로, PWN을 이용한 소나무의 체외 공동 배양은 a) 단일 환경 또는 영양 변수를 제어할 수 있고, b) 공간을 덜 차지하며, c) 얻는 데 더 적은 시간이 필요하고, d) 오염 또는 숙주의 유전적 변이가 없기 때문에 생화학적 변화를 연구하는 데 더 유리한 시스템을 제공합니다. 다음 프로토콜은 해양 소나무인 Pinus pinaster의 표준 생체 내 PWN 감염 및 소나무 휘발성 물질에 대한 이러한 식물 기생충 영향을 연구하기 위한 개선된 방법론으로 PWN과 함께 소나무 싹의 새로운 시험관 내 공동 배양의 확립에 대해 자세히 설명합니다. PWN 유도 휘발성 물질은 수소 증류 및 증류 추출을 통해 생체 내 및 시험관 내 감염된 소나무에서 추출되며, 방출 된 휘발성 물질은 섬유 또는 충진 컬럼 기술을 사용하여 고체상 미세 추출 (SPME)로 포집됩니다.

서문

소나무 선충 (PWN), Bursaphelenchus xylophilus (Steiner & Bührer 1934) Nickle 1970은 주로 Pinus 종에 기생하는 식물 기생 선충입니다. 이 식물 기생충은 Monochamus 속의 곤충에 의해 곤충의 성숙 먹이 동안 감수성 소나무 종의 나무로 벡터화됩니다. PWN은 수지 운하를 공격하고 수지 흐름을 감소시키고 혈관 조직을 손상시켜 물기둥을 중단시킴으로써 나무를 죽입니다. 나무 캐노피에 물이 부족하면 소나무 시들음병(PWD)의 첫 번째 눈에 띄는 증상, 즉 광합성이 중단된 후 솔잎이 백화색이 되고 건조로 인해 처집니다. 소나무는 일반적으로 수지와 휘발성 화합물의 생산을 통해 생물적 및 비생물적 스트레스에 반응한다¹. 따라서 소나무 방어 메커니즘을 이해하는 것은 PWN 공격의 특정 효과를 결정하고 병충해 방제를 위한 대체 방법을 찾는 데 중요하다².

현재 현장 조건에서의 실험은 감염된 소나무의 가용성, PWN 감염 확인 및 다양한 환경 조건에 따라 달라집니다. 온실 조건에서 이러한 매개변수는 더 쉽게....

프로토콜

1. 체외 소나무 선충 성장

참고 : 소나무 선충은 Botrytis cinerea (de Bary) Whetzel¹¹의 비 포자 균주의 곰팡이 균사체를 먹음으로써 자랍니다.

1. 일상적인 하위 배양의 경우, 곰팡이 군집의 가장 바깥쪽 경계에서 배양 플러그(직경 0.5cm)를 멸균 감자 포도당 한천(PDA) 플레이트로 옮기고 7-10일 동안 또는 진균 군집이 플레이트의 가장자리에 도달할 때까지 25 ± 1°C에서 유지합니다.
   참고: 다른 유형의 일반 곰팡이 성장 배지를 곰팡이 성장에 사용할 수 있습니다.
2. 더 많은 양의 PWN을 얻으려면 증기 멸균 수화 인증 유기농 보리 곡물(Hordeum vulgare L.)에서 시험관에서 재배한 B. cinerea를 사용하십시오. 시리얼 15g을 초순수 15mL에 넣고 목이 넓은 250mL 삼각 플라스크에 넣고 멸균합니다. 그 후, B. cinerea 배양 플러그를 접종하고 25 ± 1 °C에서 7-10일 동안 또는 시리얼 표면이 ....

토론

여기에 제시된 프로토콜은 PWN에 감염된 해송의 휘발성 화합물을 분석하기 위한 향상된 방법론을 간략하게 설명하며, 여기서 환경 및 유전적 변동성이 감소하고 결과에 영향을 미치지 않습니다. in vitro maritime pine 유전자형의 순수한 라인을 사용하여 추출 및 방출된 휘발성 물질을 소나무 숲에 가장 해로운 생물학적 위협 중 하나에 대한 숙주 반응으로 분석할 수 있?.......

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
38 mesh test sieve	Retsch	60.131.000038
6-Benzylaminopurine (6-BAP)	Duchefa Biochemie	B0904
Charcoal activated	Duchefa Biochemie	C1302
Clevenger apparatus	WINZER Laborglastechnik	25-000-02
Hydrogen peroxide solution	Sigma-Aldrich	H1009-500ML
Indole-3-butyric acid (IBA)	Duchefa Biochemie	I0902
Likens-Nickerson apparatus	VitriLab LDA.	c/IN29/32
Microbox round containers	Sac O2	O118/80+OD118
n-Pentane	Sigma-Aldrich	1.00882
PARAFILM M sealing film	BRAND	HS234526B-1EA
Phyto agar	Duchefa Biochemie	P1003
Potato Dextrose Agar	BD DIFCO	213400
Scalpel blade no. 24	Romed Holland	BLADE24
Schenk & Hildebrandt Basal salt medium	Duchefa Biochemie	S0225
Schenk & Hildebrandt vitamin mixture	Duchefa Biochemie	S0411
SPME fiber assembly Polydimethylsiloxane (PDMS)	Supelco	57300-U
SPME Fiber Holder	Supelco	57330-U
Sucrose	Duchefa Biochemie	S0809
Tenax TA- stainless steel tubes- conditioned + capped	Markes International	C1-AAXX-5003