Pinewood Nematode Bursaphelenchus xylophilus 에 의한 In Vivo 및 In Vitro Pines 감염 및 유도 휘발성 물질의 분리

요약

이 프로토콜은 Pinus pinaster의 in vivo 및 in vitro pinewood 선충 감염과 가스 크로마토그래피(GC) 및 질량 분석법(GC-MS)과 결합된 GC를 통한 휘발성 분석을 설명합니다.

초록

소나무 선충(PWN)은 침엽수 종에서 소나무 시들음병(PWD)을 일으키는 식물 기생충입니다. 이 식물 기생 선충은 일본, 중국, 한국과 같은 아시아 국가에서 소나무 삼림 벌채에 크게 기여했습니다. 지난 20년 동안 유럽에서는 포르투갈과 스페인이 큰 영향을 받았다. 감수성 숙주 종에서 PWN 감염 및/또는 PWD 진행 메커니즘에 대한 연구는 온실 조건에서 소나무 묘목의 통제된 감염에 의존합니다. 이 기술은 힘들고 상당한 경제적 및 인적 자원을 동원합니다. 또한 일부 소나무 종과 관련된 유전적 다양성뿐만 아니라 외부 요인의 간섭으로 인한 변동성이 발생하기 쉽습니다. 대안으로, PWN을 이용한 소나무의 체외 공동 배양은 a) 단일 환경 또는 영양 변수를 제어할 수 있고, b) 공간을 덜 차지하며, c) 얻는 데 더 적은 시간이 필요하고, d) 오염 또는 숙주의 유전적 변이가 없기 때문에 생화학적 변화를 연구하는 데 더 유리한 시스템을 제공합니다. 다음 프로토콜은 해양 소나무인 Pinus pinaster의 표준 생체 내 PWN 감염 및 소나무 휘발성 물질에 대한 이러한 식물 기생충 영향을 연구하기 위한 개선된 방법론으로 PWN과 함께 소나무 싹의 새로운 시험관 내 공동 배양의 확립에 대해 자세히 설명합니다. PWN 유도 휘발성 물질은 수소 증류 및 증류 추출을 통해 생체 내 및 시험관 내 감염된 소나무에서 추출되며, 방출 된 휘발성 물질은 섬유 또는 충진 컬럼 기술을 사용하여 고체상 미세 추출 (SPME)로 포집됩니다.

서문

소나무 선충 (PWN), Bursaphelenchus xylophilus (Steiner & Bührer 1934) Nickle 1970은 주로 Pinus 종에 기생하는 식물 기생 선충입니다. 이 식물 기생충은 Monochamus 속의 곤충에 의해 곤충의 성숙 먹이 동안 감수성 소나무 종의 나무로 벡터화됩니다. PWN은 수지 운하를 공격하고 수지 흐름을 감소시키고 혈관 조직을 손상시켜 물기둥을 중단시킴으로써 나무를 죽입니다. 나무 캐노피에 물이 부족하면 소나무 시들음병(PWD)의 첫 번째 눈에 띄는 증상, 즉 광합성이 중단된 후 솔잎이 백화색이 되고 건조로 인해 처집니다. 소나무는 일반적으로 수지와 휘발성 화합물의 생산을 통해 생물적 및 비생물적 스트레스에 반응한다¹. 따라서 소나무 방어 메커니즘을 이해하는 것은 PWN 공격의 특정 효과를 결정하고 병충해 방제를 위한 대체 방법을 찾는 데 중요하다².

현재 현장 조건에서의 실험은 감염된 소나무의 가용성, PWN 감염 확인 및 다양한 환경 조건에 따라 달라집니다. 온실 조건에서 이러한 매개변수는 더 쉽게 제어할 수 있습니다. 그러나 숙주의 유전적 다양성은 변이성의 강력한 원천이 된다³. 예를 들어, Pinus pinaster의 내성 반응에 대한 연구에서 테르펜 리모넨 및 수지 산의 생산은 PWN 감염과 관련이 있었습니다⁴. 그러나 샘플의 수가 적고 자연 조건의 변동성으로 인해 감지 가능한 변화는 샘플의 절반에 대해서만 등록되었습니다. 온실에서 재배한 소나무 묘목을 사용한 또 다른 연구에서는 환경 조건을 더 쉽게 제어할 수 있음에도 불구하고 자연적인 소나무의 유전적 다양성으로 인해 추출된 휘발성 물질에서 큰 변동성을 유발했다⁵. 질병으로 유발된 소나무 휘발성 물질은 환경 및 유전적 변이에 의해 크게 영향을 받을 수 있기 때문에 시험관 내 싹 배양에 의존하는 것은 PWN 감염에 대한 소나무 조직의 화학적 및 생화학적 반응에 대한 연구에 좋은 대안입니다 ^5,6. 식물 유전자형을 체외에서 증식시킴으로써 유전자 구성을 무한히 유지하고 복제할 수 있으므로 in vivo 조건보다 더 적은 공간과 더 짧은 시간 내에 유전적으로 동일한 개체를 더 많이 만들 수 있습니다. 이러한 배양물은 영양 및 환경 조건에서 쉽게 조작할 수 있는 간단한 작업 시스템이므로 휘발성 물질 ^7,8의 생산 및 배출 평가에서 기존 시스템에 추가적인 이점을 제공합니다. 이러한 시스템은 대부분의 경우 상당한 자원이 필요한 목본 종에 대한 연구에 특히 유리하며, 예를 들어 대상 나무가 때때로 접근하기 어려운 장소에 위치하고, 고가의 장비, 전담 인력 및 더 긴 분석 기간을 필요로 한다⁸. 시험관외에서, PWN과 소나무의 공동 배양은 다양한 단계에서 선충과 식물 사이의 대사 상호 작용을 평가할 수 있게 한다⁹. 휘발성 물질 분석의 경우, 프로파일링 기술이 매우 정확해졌고 샘플링의 미세한 변화로 인해 휘발성 프로파일에 상당한 변화가 발생할 수 있기 때문에 이는 매우 중요합니다. 질량분석법(GC-MS)과 결합된 가스 크로마토그래피는 휘발성 물질 분석을 위한 강력한 기법이며 휘발성 물질¹⁰의 빠르고 간소화된 프로파일링을 가능하게 합니다. 여기에 제시된 프로토콜은 유도 휘발성 물질의 추출 및 프로파일링에 최적화된 유전적으로 동일한 소나무의 온실 조건 및 시험관 내 싹 배양 하에서 생체 내 소나무 묘목을 감염시키는 기술을 설명합니다.

프로토콜

1. 체외 소나무 선충 성장

참고 : 소나무 선충은 Botrytis cinerea (de Bary) Whetzel¹¹의 비 포자 균주의 곰팡이 균사체를 먹음으로써 자랍니다.

1. 일상적인 하위 배양의 경우, 곰팡이 군집의 가장 바깥쪽 경계에서 배양 플러그(직경 0.5cm)를 멸균 감자 포도당 한천(PDA) 플레이트로 옮기고 7-10일 동안 또는 진균 군집이 플레이트의 가장자리에 도달할 때까지 25 ± 1°C에서 유지합니다.
   참고: 다른 유형의 일반 곰팡이 성장 배지를 곰팡이 성장에 사용할 수 있습니다.
2. 더 많은 양의 PWN을 얻으려면 증기 멸균 수화 인증 유기농 보리 곡물(Hordeum vulgare L.)에서 시험관에서 재배한 B. cinerea를 사용하십시오. 시리얼 15g을 초순수 15mL에 넣고 목이 넓은 250mL 삼각 플라스크에 넣고 멸균합니다. 그 후, B. cinerea 배양 플러그를 접종하고 25 ± 1 °C에서 7-10일 동안 또는 시리얼 표면이 완전히 집락화될 때까지 보관한다¹².
   참고: 연구 목적의 선충은 식물 기생 선충에 대한 국립 표준 실험실에서 요청할 수 있습니다.
3. B. cinerea를 PWN 수성 현탁액(최소 20명의 남성과 30명의 여성 포함)으로 시험관 내 배양액을 접종하여 PWN 배양을 시작하고 앞서 설명한 조건에서 7-10일 동안 또는 곰팡이 군집이 완전히 소모되고 PWN 개체군이 플레이트 또는 플라스크의 벽을 오르기 시작할 때까지 어둠 속에서 유지합니다(그림 1). 건조를 방지하기 위해 플레이트나 플라스크를 플라스틱 필름으로 밀봉하십시오.
   참고 : 암컷은 외음부 플랩, 긴 자궁 후 주머니 및 일반적으로 둥근 꼬리 말단으로 구별 할 수 있습니다. 수컷은 복부 방향으로 구부러진 뾰족한 꼬리 말단을 가지고 있으며 특징적인 스피큘¹³이 있습니다. PWN 현탁액을 피펫팅할 때 피펫팅된 현탁액이 진균 표면에 물방울을 형성하여 표면 장력을 통해 PWN을 가두지 않도록 곰팡이 군집을 줄무늬로 만듭니다.
4. 플라스크 벽을 수돗물로 헹구고 내용물을 Baermann 깔때기 또는 트레이의 종이 타월에 붓고 물에 담가 PWN을 분리합니다¹⁴. 24시간에서 48시간 후에, 살아있는 선충은 감염된 물질로부터 물로 옮겨졌을 것이다. 38μm 메쉬 체¹⁵를 사용하여 체질하여 복구합니다. 축적된 PWN을 수돗물과 함께 용기에 씻으십시오.
   알림: PWN과 접촉하는 모든 물질은 검역 유기체이므로 적절하게 오염을 제거해야 합니다. 일반적으로 에탄올에 10-20분 동안 담그는 것으로 충분합니다. 리젝트된 수성 현탁액은 멸균하거나 최소 35분 동안 60°C로 가열해야 합니다.
5. PWN이 포함된 수성 현탁액을 즉시 사용하거나 더 긴 보관 기간(최대 2개월) 동안 11°C에서 보관하십시오.

2. 혼합 생활 단계 소나무 선충 살균

1. 플로우 후드에서 약 5000 PWN을 함유한 부피의 PWN 현탁액을 멸균 38μm 메시 체에 피펫팅하고 멸균수로 세척합니다.
   참고: 쌍안 현미경(40x)으로 선충을 세십시오.
2. PWN이 들어있는 체의 아래쪽 절반을 20 % 과산화수소 (H₂O₂) 용액에 담그고 15 분 동안 수동으로 혼합합니다.
3. 체를 통해 멸균수를 분사하여 멸균 PWN을 세척합니다. 이 단계를 3번 반복합니다. 마지막 세척에서 PWN이 체 경계에서 모이도록 체를 기울입니다. 체 경계에 1mL의 멸균수를 피펫팅하여 멸균 선충 현탁액을 회수하고 11°C에서 보관하거나 즉시 사용하십시오.
   참고: 멸균의 성공 여부는 PDA 배지에 PWN 현탁액 100μL 분취액을 도금하고 약 1주일 동안 정기적으로 오염을 모니터링하여 평가할 수 있습니다.

3. in vivo Pinus pinaster 묘목의 감염

참고: 접종 시험은 2년 된 P. pinaster 묘목≥ 수행됩니다. 나무는 인증된 상업 소매업체에서 구입할 수 있지만 인증된 씨앗으로 온실에서 자랄 수도 있습니다.

1. 1단계에서 설명한 대로 PWN 접종물을 얻고 현탁액에 물을 추가하거나 선충이 가라앉을 때까지 기다리고(약 60분) 지표수를 디캔팅하여 부피를 줄여 혼합 수명 단계 PWN의 현탁액을 1000PWNs/mL로 설정합니다. 실온에서 40x의 쌍안 현미경 아래의 오목한 슬라이드에서 카운팅을 수행합니다.
2. 접종을 시작하려면 소나무 줄기의 위쪽 5cm 아래 부분에서 바늘을 수동으로 제거하고 멸균 메스¹⁶으로 표재성 세로 절개(길이 0.5-1cm)를 합니다.
   참고: 절개는 선충이 소나무 내부 조직에 접근할 수 있도록 하기 위해 수행됩니다.
3. 상처 부위에 피펫 처리된 PWN 현탁액 0.5mL를 담을 수 있는 멸균 면 조각을 놓고 투명 스트립으로 고정하여 습도를 유지합니다.
   알림: 선충이 빠르게 가라앉기 때문에 각 접종 사이에 PWN 현탁액을 세게 혼합하십시오. 접종 장소에서 현탁액이 건조되면 선충 감염에 실패할 수 있으므로 습기가 많은 면화를 충분히 덮습니다.
4. 대조군 소나무의 경우 PWN 현탁액을 멸균수로 교체하십시오.
5. PWD 진행을 정기적으로 추적하고 변색되고 시든 바늘의 비율을 정량화하여 증상 점수를 매깁니다. 외부 증상이 없는 경우 0점, 최대 25%의 바늘 변색에 대해 1점, 25%에서 50% 사이의 바늘 변색에 대해 2점, 50%에서 75%의 바늘 변색에 대해 3점, 완전히 갈색인 바늘이 있는 소나무의 경우 4점을 얻습니다(그림 2).
6. 온실을 습한 조건(60%-80%)으로 유지하고 물을 자주 (토양 최대 수분 보유 용량의 70%로 유지) 선충이 10°C 이하에서 대사가 비활성화되고 발달이 30°C 이상에서 영향을 받을 수 있으므로 극한의 온도를 피하십시오.
7. 접종 후 20일이 지나면 줄기 밑부분의 묘목을 자르고 갈색 종이 봉지에 담아 얼려(-20°C) 휘발성 물질 추출용 식물 재료를 수확합니다. 방출되는 휘발성 물질(SMPE 섬유 또는 포장된 튜브)의 경우 실온 ^5,17에서 즉시 소나무 묘목을 샘플링합니다.

4. 시험관 내 소나무 싹 배양의 형성 및 감염

1. 표면 멸균 전에 인증된 P. pinaster 씨앗을 흐르는 수돗물에 세척하여 가장 큰 파편을 제거한 다음 일반 세제 용액(물 40mL당 1방울)으로 격렬한 교반으로 세척하여 더 미세한 파편을 세척합니다.
2. 플로우 후드에서 세척된 씨앗이 덮일 때까지 상업용 표백제 용액(1:4, 수돗물에 상업용 표백제)을 추가하여 씨앗 표면 살균을 시작하고 15분 동안 세게 혼합합니다. 표백제 용액을 버리고 멸균된 수돗물로 씨앗을 3번 헹굽니다.
3. 씨앗을 에탄올 용액(80%, v/v)에 격렬한 교반으로 15분 동안 담그고 에탄올을 버리고 멸균된 초순수로 3번 씻습니다.
4. 소나무 발아를 위해 멸균 된 종자 코트를 플로우 후드의 멸균 기계 선반으로 부수고 잣을 분리 한 다음 멸균 된 습식 여과지와 함께 밀폐 된 용기에 넣어 밤새 잣을 수화시킵니다⁶.
5. 수화 잣을 4 °C에서 7 일 동안 성층화하여 휴면을 깨고 발아를 동기화 한 다음 발아가 될 때까지 25 °C의 어두운 곳에서 유지합니다.
   참고: 계층화 단계는 선택 사항입니다.
6. 밀폐 된 용기에 담긴 무균 발아 소나무를 24 ° C / 18 ° C 열주기에서 16 시간 광 광주기로 옮기고 2 주 동안 또는 주요 줄기가 발달하기 시작할 때까지 유지합니다.
7. 플로우 후드에서 메스로 뿌리 위의 묘목의 공중 부분을 자르고 자당 30g/L, 한천 8g/L, 6-벤질아미노푸린(BAP, 사이토키닌) 0.5mg/L 및 인돌-3-부티르산 0.1mg/L(IBA, 옥신)⁶, 마이크로싹 증식을 유도합니다. 위에서 설명한 조건의 배양물을 in vitro culture growth chamber에 보관합니다.
8. 플로우 후드에서 멸균 메스로 싹 기저부(배양 배지와 접촉하는 부분)의 굳은살 조직을 절단하고 멸균 핀셋으로 싹 클러스터를 새로운 증식 배양 배지로 옮겨 주기적으로(약 4주) 하위 배양합니다.
9. 마이크로스템 신장을 위해 마이크로싹을 위에서 설명한 SH 배양 배지로 옮기지만 식물 호르몬 대신 3g/L의 활성탄을 함유합니다.
   알림: 활성탄은 독성 물질을 흡착하고 절단 조직¹⁹에 과도하게 유도된 식물 호르몬 축적을 방지합니다.
10. PWN 감염의 경우 길쭉한 새싹을 식물 호르몬 또는 활성탄이 없는 SH 배양 배지로 옮기고 마이크로싹 바닥에 100-150개의 혼합 수명 단계 멸균 PWN을 추가합니다. PWD의 증상이 눈에 띄기 시작할 때까지 위에서 설명한 상태를 유지하십시오(그림 3)⁶.
11. 휘발성 물질 추출을 위해 식물 물질을 수확하려면 in vitro explants를 즉시 사용하거나 분석할 때까지 동결(-20 °C)하십시오. 방출되는 휘발성 물질(SMPE 섬유 또는 충전된 튜브)의 경우 마이크로슛 박스를 즉시 분석하십시오.

5. 휘발성 화합물의 분리

참고: 휘발성 물질의 분리는 여러 기술을 통해 수행할 수 있습니다. 여기서, 휘발성 추출은 Clevenger 장치(20)를 사용한 수소 증류, Likens-Nickerson 장치(²¹)를 사용한 증류 추출, 코팅된 섬유 또는 충전된 튜브(다공성 폴리머 흡착제)²²를 사용한 고체상 미세 추출(SPME)을 통한 헤드스페이스 휘발성 물질의 포획에 의해 수행됩니다.

1. 수소증류(Hydrodistillation)
   1. 에센셜 오일의 분리를 위해 Clevenger 장치를 사용하십시오. 증류 시스템은 a) Clevenger 장치, b) 물과 소나무 재료를 담기 위한 둥근 바닥 플라스크 또는 삼각 튜브, c) 적절한 가열 장비, d) 시스템을 제자리에 고정하기 위한 지지 프레임으로 구성됩니다(그림 4A).
   2. 사용하기 전에 유리 제품을 철저히 청소하십시오. 실험실 프레임 cl을 사용하십시오.amps Clevenger 장치를 격자 프레임에 고정합니다. 물을 순환시켜 시스템 콘덴서를 냉장 보관하거나 가능한 경우 냉장 순환기를 사용하십시오.
   3. 소나무 싹 무게를 등록하고 바닥이 둥근 플라스크 또는 삼각에 넣습니다. 용기가 절반 이상 채워지지 않도록 물의 양을 조정하십시오.
   4. 플라스크 아래에 가열 장비를 배치하고 누출이 없는지 확인한 다음 시스템의 모든 부품이 올바른 위치에 있고 지지 프레임에 고정되어 있는지 확인합니다.
      알림: Clevenger와 플라스크의 접지 유리 연결 부분은 연결하기 전에 철저히 청소, 탈지 및 건조해야 합니다. 이를 위해 아세톤을 약간 적신 여과지 조각을 사용하십시오. 이 부품에는 그리스를 사용해서는 안 됩니다.
   5. Clevenger 장치의 중간 부분에 있는 리턴 대각선 튜브에 위치한 충전 깔때기를 통해 물을 주입합니다. 리턴 대각선 튜브에서 플라스크로 흘러내리기 직전에 플라스크를 채울 때까지 두 개의 튜브(대각선 및 눈금)에서 물이 균등하게 흐르도록 3방향 탭의 위치를 조정합니다( 그림 4 참조).
   6. 열원을 켜고 물을 2 - 3 mL/min의 증류 속도로 끓이도록 조정합니다.
   7. 증류수의 첫 번째 방울이 Clevenger 장치의 오른쪽에 있는 눈금이 매겨진 튜브에 떨어지면 증류 시간을 시작합니다. 평균 증류 시간은 3시간²³분이지만 특정 요구 사항에 따라 더 짧거나 더 긴 증류 기간을 사용할 수 있습니다. 에센셜 오일은 일반적으로 아래의 증류수(가수산)보다 가볍기 때문에 상층액에 있습니다.
      주의 : 증류가 작동 중일 때 Clevenger 장치는 만지면 뜨거워집니다.
   8. 증류 시간이 끝나면 가열을 멈추고 증류와 끓는 것을 멈출 수 있도록 약 10분 동안 그대로 두십시오. 10분 후 탭을 시계 방향으로 열어 에센셜 오일이 눈금이 매겨진 부분에 도달할 때까지 가수분해물이 흘러나오도록 합니다. 분리 된 에센셜 오일의 양을 읽으십시오. 수율을 백분율(%, v/w)로 표시되는 mL/g(신선 또는 건조 중량)으로 계산합니다.
   9. 부피가 0.05mL 미만인 에센셜 오일의 경우 눈금이 매겨진 튜브에서 가장 낮은 눈금이 있으며 수율을 결정할 수 없습니다. 에센셜 오일을 회수하려면 증류된 n-펜탄을 사용하여 Clevenger 장치를 헹굽니다.
   10. 증류된 n-펜탄을 사용하여 에센셜 오일을 회수하려면 증류가 끝나면 약 10-15분 정도 기다렸다가 시계 반대 방향으로 3방향 탭을 열어 가수분해물이 충전 깔때기 바로 아래까지 리턴 대각선 튜브에서 흘러나오도록 합니다. 깨끗한 스포이드를 사용하여 리턴 대각선 튜브의 왼쪽 상단까지 충전 깔때기에 증류된 n-펜탄을 도입합니다. 교차 오염을 방지하기 위해 충전 깔때기를 만지지 마십시오.
   11. 증류수 세척 병을 사용하여 충전 깔때기에 물을 주입합니다. n-Pentane은 증류 플라스크로 흘러 내려 달인 물의 잔류 열과 함께 증발합니다. 이런 식으로, 그것은 시스템을 통과하고, 용해되고, 휘발성 물질을 눈금이 매겨진 튜브의 가수 압 수소 표면으로 드래그합니다. 3방향 탭을 시계 방향으로 일반 위치로 엽니다.
   12. 5.1.8에서와 같이 진행합니다. N-펜탄에 용해 된 에센셜 오일을 수집합니다.
   13. 블로우 다운 증발기 시스템을 사용하여 질소 플럭스 하의 실온에서 에센셜 오일과 n-펜탄의 혼합물을 약 100 μL의 최소 부피로 농축합니다. 분석할 때까지 -20 °C에서 유지하십시오.
       알림: 휘발성 화합물의 손실을 방지하기 위해 건조에 집중하지 마십시오.
2. 증류 - 추출
   1. Likens-Nickerson 장치를 사용하여 식물에서 휘발성 물질을 추출합니다. 증류-추출 시스템은 a) Likens-Nickerson 장치, b) 물과 소나무 재료를 담기 위한 둥근 바닥 플라스크(증류 장치의 우측 암), 및 증류된 n-펜탄(증류 장치의 왼쪽 암)과 같은 비혼화성 유기 용매를 보유하는 다른 플라스크, c) 두 개의 적절한 가열 장치, d) 응축기로 구성되며, e) 시스템을 고정하기 위한 지지 프레임(그림 4B).
      참고: 실험실 내 증류된 n-펜탄을 사용하여 용제 첨가 안정제로 샘플이 오염되지 않도록 하십시오.
   2. 고정된 응축기에서 물을 순환시키는 것으로 시작하거나 가능한 경우 냉장 순환기를 사용하십시오.
   3. 실험실 프레임 cl을 사용하십시오.amp증류 추출 장치를 격자 프레임에 고정합니다. 바닥이 둥근 플라스크에 추출할 소나무 재료를 넣고 물을 절반 용량까지 추가합니다. 더 작은 100mL 둥근 바닥 플라스크는 증류된 n-펜탄으로 절반을 채워야 합니다.
      알림: 연결하기 전에 유리 구성 요소의 접지 유리 연결 부분을 잘 청소, 탈지 및 건조해야 합니다. 아세톤에 잠시 적신 여과지 조각을 청소에 사용할 수 있습니다.
   4. 각 플라스크 아래에 가열 맨틀을 배치합니다. 누출이 없는지, 시스템의 모든 구성 요소가 올바르게 배치되고 실험실 격자 프레임에 고정되었는지 확인합니다. 열원을 켜고 각각의 끓는점에 맞게 조정하십시오. 물은 2-3mL/분의 증류 속도로 끓여야 합니다.
      주의 : 증류 추출 과정에서 Likens-Nickerson 장치는 만지면 뜨거워집니다.
   5. 증류 시간이 끝나면 소나무 재료가 있는 플라스크에서 가열을 중지하고 n-펜탄을 10분 동안 단독으로 증류합니다. n-펜탄이 투명한 액체로 변한 후 가열을 중지하고 약 10분 동안 그대로 두십시오. 색상 변화는 증류액이 이제 n-펜탄과 함께 플라스크에 있음을 나타냅니다.
   6. n-펜탄 추출물을 실온의 회전 증발기에서 감압(70 - 73 mmHg)으로 농축합니다. 부분적으로 농축된 추출물을 바이알로 옮기고 실온의 블로우다운 증발기에서 질소 흐름 하에 ≈100μL까지 농축합니다. 추출 후에는 분석할 때까지 -20°C에서 시료를 보관하십시오.
      알림: 추출물은 휘발성 화합물의 손실을 유발할 수 있으므로 건조에 집중해서는 안 됩니다.
3. 코팅된 섬유를 사용한 헤드스페이스 샘플링
   1. 고체상 미세추출(SPME) 설정에는 a) 수동으로 작동되는 SPME 홀더, b) 코팅된 섬유, c) SPME 홀더를 지지하는 적절한 스탠드가 포함됩니다(그림 4C). 현재 프로토콜의 경우 휘발성 물질을 포집하기 위해 100μM 폴리디메틸실록산(PDMS) 코팅 섬유가 있는 수동 바이알 SPME 헤드스페이스 시스템을 사용합니다.
      알림: 다른 시중에서 판매되는 섬유는 화학적 특성이 다른 코팅을 가지고 있으므로 원하는 효과에 따라 선택해야 합니다.
   2. 제조업체의 권장 사항에 따라 사용하기 전에 250°C에서 최대 20분 동안 각 SPME 섬유를 열로 컨디셔닝하십시오.
   3. 소나무 재료 또는 소나무 부분을 투명한 유리 바이알에 삽입하고 폴리테트라플루오로에틸렌(PTFE) 라이너(격막)가 있는 구멍 나사 캡으로 밀봉합니다. 재료는 섬유가 샘플에 닿지 않도록 바이알 상단에서 최소 2-3cm 떨어져 있어야 합니다.
   4. 빈 바이알을 샘플링하여 SPME 섬유를 사용하여 제어 실험을 동시에 수행하여 시스템 오염 물질을 식별하거나 SPME 섬유의 반복적인 사용으로 인한 캐리오버가 없는지 확인합니다.
   5. 대기 평형을 위해 휘발성 물질이 수집되기 전에 바이알 내부에 소나무 재료를 1시간 동안 보관하십시오.
      참고: SPME를 사용한 분석은 실온에서 실행하거나 바이알을 서포트 랙에 수용하고 Bain Marie 수조에 삽입하여 조정 가능한 온도에서 실행할 수 있습니다.
   6. SPME 홀더에서 중격 피어싱 바늘의 깊이를 조정하여 비중격을 관통하되 섬유가 노출될 때 재료와 접촉하지 않도록 합니다.
   7. 섬유를 빼낸 상태에서 PTFE 라이너를 통해 홀더 바늘을 삽입합니다. 플런저를 아래로 눌러 섬유를 노출시킵니다. 플런저를 시계 방향으로 돌리고 Z-슬롯²⁴의 수평 왼쪽에 있는 고정 나사를 잡습니다. 섬유를 1시간 동안 노출시킵니다.
   8. 플런저가 Z-슬롯 상단에 도달할 때까지 플런저를 시계 반대 방향으로 돌려 섬유를 집어넣습니다. 수집된 휘발성 물질은 이제 GC 및/또는 GC-MS 직접 분석을 위해 준비되었습니다.
      참고: 필요한 경우 분석 전에 섬유를 실온에서 보관할 수 있지만 일주일 이상 보관할 수 없습니다.
4. 패킹된 튜브를 사용한 헤드스페이스 트래핑
   1. a) 질량 유량 펌핑 시스템, b) PTFE 튜브, c) 활성탄 공기 필터, d) 다공성 수지 폴리머 충전 튜브, e) 유리 제품 또는 폴리에틸렌 테레프탈레이트(PET) 백(조리 백)으로 구성된 패킹 스테인리스강 트랩을 사용하여 헤드스페이스 휘발성 물질을 포집하기 위한 설정을 준비합니다(그림 4D)²⁵.
   2. 소나무 재료가 굳은 후 덮개가 있는 유리 제품이나 PET 백 안에 보관하여 헤드스페이스 휘발성 물질을 축적하십시오.
      알림: 일반 플라스틱의 휘발성 물질이 풍부하며 GC-MS를 통해 대량으로 감지할 수 있습니다.
   3. 폐쇄 루프 시스템의 경우 다음과 같이 회로를 연결하십시오 : a) 펌프 출구를 PTFE 튜브에 연결, b) PTFE 튜브를 활성탄 공기 필터에 연결, c) 공기 필터에서 소나무 재료로 유리 제품 또는 PET 백에 연결하는 추가 튜브까지, d) 포장 된 튜브를 유리 제품 또는 PET 백 배출구에 연결하고, e) 스테인레스 스틸 튜브 출구에서 질량 유량 펌프 입구⁽²²)까지의 추가 PTFE 튜브.
      알림: 다공성 폴리머로 채워진 스테인리스 스틸 튜브는 제조업체의 권장 사항에 따라 열 탈착 장치에서 열 조절해야 합니다(예: 사용하기 전에 100°C에서 최대 15분). 튜브에는 존중해야 하는 흐름 방향이 있습니다.
   4. 여과된 공기의 양과 속도를 제어하기 위해 질량 유량 펌프를 사용하여 분당 0.6L의 소나무 시스템을 통해 100L의 여과된 공기를 펌핑하여 휘발성 물질을 수집합니다.
      참고: 컬럼을 통해 흐르는 헤드스페이스 공기의 양 및/또는 흐름은 포집된 휘발성 물질의 양과 결과적으로 얻어진 크로마토그램에 영향을 미칠 수 있습니다.
   5. 휘발성 물질을 수집한 후에는 밀폐된 보관 캡으로 포장된 튜브의 양쪽 끝을 닫습니다. 휘발성 물질이 분해되거나 빠져나갈 수 있으므로 실온(최대 1주일 동안)에서 보관하고 가능한 한 빨리 분석하십시오.
   6. 세척을 위해 모든 PTFE 튜브와 유리 제품을 70% 에탄올로 헹구고 230°C의 오븐에서 최소 2시간²⁵분 동안 가열합니다.

6. 휘발성 프로파일 분석

1. 가스 크로마토그래피-질량 분석법(GC-MS)을 통해 또는 이전에 식별된 휘발성 물질의 정량화를 위해 화염 이온화 검출을 통한 가스 크로마토그래피(GC-FID)를 통해 일상적으로 휘발성 프로파일 분석을 수행합니다.
   참고: GC-FID 및 GC-MS에 의한 분석 방법에 대한 설명은 광범위하며 본 연구의 목표를 벗어납니다. 독자는 ISO 7609²⁶과 같은 실험실 내 절차 또는 표준을 사용하여 개별 성분의 정량화에 대한 관련 작동 조건과 두 분석 방법의 비교에 대한 문헌 데이터를 제공하는 것이 좋습니다²⁷.
2. 순수하거나 용매에 담겨 있는 분석물질(예: n-펜탄 또는 n-헥산)을 사용하고, 섬유(예: SPME)에 직접 주입 또는 흡착되어 크로마토그래프 주입기에 직접 탈착되거나 GC 단위에 연결된 열 탈착(TD) 장치를 사용합니다.
   참고: 더 높은 감도, 더 높은 분리능 및 더 짧은 분석 시간에도 불구하고 캐필러리 컬럼은 시료 용량이 적습니다. 따라서, 거의 모든 작동 조건이 유사할 수 있지만, 분석물의 유형(순수, 용매, SPME 등)은 다른 분할/분할 적은 주입 절차를 필요로 할 수 있습니다.
3. ISO 7609에 따라 평가된 머무름 지수를 RI, GC-MS 및 ¹³C-NMR, 실험실 합성 및 분리 화합물, 상업적으로 이용 가능한 표준 또는 상업적으로 이용 가능한 질량 스펙트럼 라이브러리에 의해 구성 요소의 식별이 확립된 참조 샘플을 사용하여 실험실에서 생성된 라이브러리의 GC-MS 스펙트럼과 비교하여 휘발성 성분의 식별을 수행합니다.
4. 그래픽 표현(크로마토그램)과 시료에서 식별된 모든 화합물의 상대량을 나열하는 크로마토그래피 프로파일을 사용하여 결과를 표현하고, 사용된 적합한 컬럼의 머무름 지수로 용출 순서를 표시합니다.
5. 많은 수의 샘플에 대해 샘플 배열(그룹화 및/또는 분리)을 해석하기 위해 화학적 조성을 기반으로 적절한 통계 분석 평가를 수행합니다.

결과

PWN은 최적의 조건에서 빠르게 번식하며 생성 시간은 4일 정도로 짧을 수 있으며 각 암컷은 일생 동안 약 80개의 알을 낳습니다²⁸. 상술한 방법론을 사용하여, 진균 성장에 따라 많은 양의 PWN을 얻을 수 있다. 8일의 성장 기간 내에 PWN은 개체 수가 100배 증가할 수 있습니다(그림 1). PWN 양의 일관성을 높이려면 알려지지 않은 박테리아 ?...

토론

여기에 제시된 프로토콜은 PWN에 감염된 해송의 휘발성 화합물을 분석하기 위한 향상된 방법론을 간략하게 설명하며, 여기서 환경 및 유전적 변동성이 감소하고 결과에 영향을 미치지 않습니다. in vitro maritime pine 유전자형의 순수한 라인을 사용하여 추출 및 방출된 휘발성 물질을 소나무 숲에 가장 해로운 생물학적 위협 중 하나에 대한 숙주 반응으로 분석할 수 있?...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
38 mesh test sieve	Retsch	60.131.000038
6-Benzylaminopurine (6-BAP)	Duchefa Biochemie	B0904
Charcoal activated	Duchefa Biochemie	C1302
Clevenger apparatus	WINZER Laborglastechnik	25-000-02
Hydrogen peroxide solution	Sigma-Aldrich	H1009-500ML
Indole-3-butyric acid (IBA)	Duchefa Biochemie	I0902
Likens-Nickerson apparatus	VitriLab LDA.	c/IN29/32
Microbox round containers	Sac O2	O118/80+OD118
n-Pentane	Sigma-Aldrich	1.00882
PARAFILM M sealing film	BRAND	HS234526B-1EA
Phyto agar	Duchefa Biochemie	P1003
Potato Dextrose Agar	BD DIFCO	213400
Scalpel blade no. 24	Romed Holland	BLADE24
Schenk & Hildebrandt Basal salt medium	Duchefa Biochemie	S0225
Schenk & Hildebrandt vitamin mixture	Duchefa Biochemie	S0411
SPME fiber assembly Polydimethylsiloxane (PDMS)	Supelco	57300-U
SPME Fiber Holder	Supelco	57330-U
Sucrose	Duchefa Biochemie	S0809
Tenax TA- stainless steel tubes- conditioned + capped	Markes International	C1-AAXX-5003