Infección de pinos in vivo e in vitro con el nematodo del pino Bursaphelenchus xylophilus y aislamiento de volátiles inducidos

Resumen

El protocolo describe la infección in vivo e in vitro por el nematodo de la madera de pino Pinus pinaster y su análisis de volatiloma mediante cromatografía de gases (GC) y GC acoplada a espectrometría de masas (GC-MS).

Resumen

El nematodo de la madera del pino (PWN) es un fitoparásito que causa la enfermedad del marchitamiento del pino (PWD) en las especies de coníferas. Este nematodo parásito de plantas ha contribuido en gran medida a la deforestación del pino en países asiáticos, por ejemplo, Japón, China y Corea. En las últimas dos décadas, en Europa, Portugal y España se han visto muy afectados. La investigación sobre los mecanismos de infección por PWN y/o progresión de PWD en especies hospederas susceptibles se basa en la infección controlada de plántulas de pino en condiciones de invernadero. Esta técnica es laboriosa y moviliza importantes recursos económicos y humanos. Además, puede ser propenso a la variabilidad que resulta de la diversidad genética asociada a algunas especies de pino, pero también de la interferencia de factores externos. Como alternativa, los cocultivos in vitro de pino con PWNs ofrecen un sistema más ventajoso para el estudio de los cambios bioquímicos, ya que a) permiten controlar variables ambientales o nutricionales individuales, b) ocupan menos espacio, c) requieren menos tiempo para obtenerse, y d) están libres de contaminación o de variación genética del huésped. El siguiente protocolo detalla la infección estándar in vivo por PWN de Pinus pinaster, el pino marítimo, y el establecimiento de los nuevos cocultivos in vitro de brotes de pino con el PWN como una metodología mejorada para estudiar la influencia de este fitoparásito en los volátiles del pino. Los volátiles inducidos por PWN se extraen de pinos infectados in vivo e in vitro por hidrodestilación y destilación-extracción, y los volátiles emitidos se capturan mediante microextracción en fase sólida (SPME), utilizando técnicas de fibra o columna empaquetada.

Introducción

El nematodo del pino (PWN), Bursaphelenchus xylophilus (Steiner & Bührer 1934) Nickle 1970, es un nematodo parásito de plantas que parasita principalmente a las especies de Pinus . Este fitoparásito es vectorizado por insectos del género Monochamus a árboles de especies de pino susceptibles durante la alimentación de maduración del insecto. El PWN mata al árbol atacando sus canales de resina y reduciendo el flujo de resina, y dañando su tejido vascular, causando interrupciones en la columna de agua. La falta de agua en la copa de los árboles induce los primeros síntomas visibles de la enfermedad de la marchitez del pino (PWD), es decir, las agujas del pino se vuelven cloróticas después del cese de la fotosíntesis y se caen debido a la desecación. El pino generalmente responde al estrés biótico y abiótico a través de la producción de resina y compuestos volátiles¹. Por lo tanto, comprender los mecanismos de defensa del pino es importante para determinar los efectos específicos de los ataques de PWN y encontrar métodos alternativos para el control de plagas².

Actualmente, la experimentación en condiciones de campo depende de la disponibilidad de pinos infectados, la confirmación de la infección por PWN y las condiciones ambientales variables. En condiciones de invernadero, estos parámetros se pueden controlar más fácilmente; Sin embargo, la diversidad genética del huésped se convierte en una fuerte fuente de variabilidad³. Por ejemplo, en un estudio sobre la respuesta de resistencia de Pinus pinaster, la producción del terpeno limoneno y los ácidos resinosos se asoció con la infección por PWN⁴. Sin embargo, debido al pequeño número de muestras y a la variabilidad de las condiciones naturales, solo se registraron cambios detectables en la mitad de las muestras. En otro estudio con plántulas de pino cultivadas en invernadero, a pesar de que las condiciones ambientales eran más fácilmente controlables, la diversidad genética natural del pino indujo una gran variabilidad en los volátiles extraídos⁵. Dado que los volátiles del pino inducidos por enfermedades pueden estar muy influenciados por la variación ambiental y genética, el recurso a los cultivos de brotes in vitro es una buena alternativa para los estudios sobre la respuesta química y bioquímica del tejido del pino a la infección por PWN ^5,6. Al propagar un genotipo de planta in vitro, su composición genética puede mantenerse y clonarse indefinidamente, lo que lleva al establecimiento de una mayor cantidad de individuos genéticamente idénticos en menos espacio y en menos tiempo que en condiciones in vivo. Estos cultivos son un sistema de trabajo sencillo bajo condiciones nutricionales y ambientales fácilmente manipulables, por lo que ofrecen ventajas adicionales a los sistemas convencionales en la evaluación de la producción y emisión de volátiles ^7,8. Estos sistemas son particularmente ventajosos para la investigación de especies leñosas, que la mayoría de las veces requieren recursos sustanciales, es decir, los árboles objetivo a veces se encuentran en sitios de difícil acceso, requieren equipos costosos, una mano de obra dedicada y períodos de análisis más largos⁸. In vitro, los cocultivos de pinos con el PWN permiten evaluar las interacciones metabólicas entre el nematodo y la planta en diferentes estadios⁹. Para el análisis de volátiles, esto es muy importante, ya que las técnicas de elaboración de perfiles se han vuelto muy precisas y las variaciones mínimas en el muestreo pueden dar lugar a cambios sustanciales en los perfiles de volátiles. La cromatografía de gases acoplada a espectrometría de masas (GC-MS) es una técnica potente para el análisis de volátiles y permite un perfilado rápido y simplificado de los volátiles¹⁰. El protocolo presentado aquí describe técnicas para infectar plántulas de pino in vivo en condiciones de invernadero y cultivos de brotes in vitro de pinos genéticamente idénticos optimizados para la extracción y el perfil de volátiles inducidos.

Protocolo

1. Cultivo in vitro de nematodo de pino

NOTA: Los nematodos del pino se cultivan alimentándose del micelio fúngico de una cepa no esporulante de Botrytis cinerea (de Bary) Whetzel¹¹.

1. Para el subcultivo de rutina, transfiera un tapón de cultivo (0,5 cm de diámetro) desde el borde más externo de la colonia fúngica a una placa de agar dextrosa de patata estéril (PDA) y manténgalo a 25 ± 1 °C durante 7 a 10 días, o hasta que la colonia fúngica alcance el borde de la placa.
   NOTA: Se pueden usar otros tipos de medio de crecimiento de hongos generales para el crecimiento de hongos.
2. Para obtener mayores cantidades de PWNs, utilice B. cinerea cultivada in vitro sobre granos de cebada orgánica certificada hidratados esterilizados al vapor (Hordeum vulgare L.). Añadir 15 g de cereal a 15 ml de agua ultrapura, en matraces Erlenmeyer de cuello ancho tapados de 250 ml y esterilizar. A continuación, inocular con un tapón de cultivo de B. cinerea y mantener a 25 ± 1 °C durante 7 a 10 días o hasta que la superficie del cereal esté completamente colonizada¹².
   NOTA: Los nematodos con fines de investigación pueden solicitarse a los laboratorios nacionales de referencia para nematodos fitoparásitos.
3. Iniciar cultivos de NMP inoculando cultivos in vitro de B. cinerea con una suspensión acuosa de NMP (que contenga un mínimo de 20 machos y 30 hembras) y mantener en oscuridad en las condiciones previamente descritas, durante 7 a 10 días o hasta que la colonia fúngica se consuma por completo y la población de NMP comience a trepar por las paredes de la placa o matraz (Figura 1). Selle las placas o matraces con una película de plástico para evitar la desecación.
   NOTA: Las hembras se pueden distinguir por el colgajo vulvar, el saco postuterino largo y un extremo de la cola generalmente redondo; Los machos tienen un extremo de la cola puntiagudo curvado ventralmente con espículas características¹³. Al pipetear suspensiones de PWN, raye la colonia de hongos para que la suspensión pipeteada no forme gotas en la superficie del hongo, atrapando los PWN a través de la tensión superficial.
4. Aísle los NMP enjuagando las paredes del matraz con agua del grifo, vertiendo el contenido en una toalla de papel en un embudo o bandeja Baermann y sumergiéndolo con agua¹⁴. Después de 24 a 48 h, los nematodos vivos se habrían transferido del material infectado al agua. Recupérelos tamizando con un tamiz de malla de 38 μm¹⁵. Lave los PWN acumulados en un recipiente con agua del grifo.
   NOTA: Cualquier material que entre en contacto con el PWN debe ser debidamente descontaminado ya que es un organismo de cuarentena; La inmersión en etanol durante 10 a 20 minutos suele ser suficiente. Las suspensiones acuosas rechazadas deben esterilizarse o calentarse a 60 °C durante al menos 35 minutos.
5. Utilice inmediatamente la suspensión acuosa que contiene los NMP o manténgala a 11 °C durante un período de almacenamiento más largo (hasta 2 meses).

2. Esterilización de nematodos mixtos de la madera de pino en etapa vital

1. En una campana de flujo, pipetee un volumen de suspensión de PWN que contenga alrededor de 5000 PWN en un tamiz de malla estéril de 38 μm y lávela con agua estéril.
   NOTA: Cuente los nematodos con un microscopio binocular (40x).
2. Sumerja la mitad inferior del tamiz que contiene los PWN en una solución de peróxido de hidrógeno (_H2O2) al 20% y mezcle manualmente durante 15 minutos.
3. Lave los PWN estériles dispensando agua estéril a través del tamiz. Repita este paso 3 veces. En el último lavado, incline el tamiz para que los PWN se acumulen en el borde del tamiz. Recupere la suspensión estéril de nematodos pipeteando 1 mL de agua estéril en el borde del tamiz y almacene a 11 °C o utilícela inmediatamente.
   NOTA: El éxito de la esterilización se puede evaluar colocando una alícuota de 100 μL de la suspensión de PWN en un medio PDA y monitoreando regularmente las contaminaciones durante aproximadamente 1 semana.

3. Infección de plántulas de Pinus pinaster in vivo

NOTA: Se realizan ensayos de inoculación en plántulas de P. pinaster de ≥ 2 años de edad. Los árboles se pueden adquirir en minoristas comerciales certificados, pero también se pueden cultivar en un invernadero a partir de semillas certificadas.

1. Obtenga el inóculo de PWN como se describe en el paso 1 y ajuste las suspensiones de PWN mixtos en etapa de vida a 1000 PWN/mL agregando agua a la suspensión o esperando a que los nematodos se asienten (aprox. 60 min) y disminuyendo el volumen decantando el agua superficial. Realice el recuento a temperatura ambiente en un portaobjetos cóncavo bajo el microscopio binocular a 40x.
2. Para comenzar la inoculación, retire manualmente las agujas de una sección por debajo de los 5 cm superiores del tallo del pino y realice una incisión longitudinal superficial (de 0,5 a 1 cm de longitud) con un bisturí esterilizado¹⁶.
   NOTA: La incisión se realiza para permitir que el nematodo acceda a los tejidos internos del pino.
3. En la zona de herida, coloque un trozo de algodón esterilizado para sujetar 0,5 mL de la suspensión de PWN pipeteada y fíjelo con una tira transparente para mantener la humedad.
   NOTA: Mezcle vigorosamente la suspensión de PWN entre cada inoculación porque los nematodos se asentarán rápidamente. Si la suspensión se seca en el sitio de inoculación, la infección por nematodos puede ser infructuosa, por lo que debe cubrir adecuadamente el algodón húmedo.
4. Para los pinos de control, reemplace la suspensión de PWN con agua estéril.
5. Realice un seguimiento regular de la progresión de la DPP y puntúe la sintomatología cuantificando el porcentaje de agujas descoloridas y marchitas. Puntúe 0 para ningún síntoma externo, 1 para hasta un 25% de decoloración de la aguja, 2 para entre el 25% y el 50% de decoloración de la aguja, 3 para el 50% al 75% de la decoloración de la aguja y 4 para pinos con agujas completamente marrones (Figura 2).
6. Mantener el invernadero en condiciones húmedas (60%-80%) y regar con frecuencia (mantener al 70% de la capacidad máxima de retención de agua del suelo), evitando temperaturas extremas ya que los nematodos se vuelven metabólicamente inactivos por debajo de 10 °C y el desarrollo puede verse afectado por encima de 30 °C.
7. A los 20 días después de la inoculación, coseche el material vegetal para la extracción de volátiles cortando las plántulas en la base del tallo y congelándolas (-20 °C) en bolsas de papel marrón. Para los volátiles emitidos (fibras SMPE o tubos empaquetados), muestree las plántulas de pino inmediatamente, a temperatura ambiente ^5,17.

4. Establecimiento e infección de cultivos de brotes de pino in vitro

1. Antes de la esterilización de la superficie, lavar las semillas certificadas de P. pinaster en agua corriente del grifo para eliminar los residuos más grandes, y luego con una solución de detergente común (1 gota por 40 mL de agua), con agitación vigorosa, para lavar los residuos más finos.
2. En una campana de flujo, comience la esterilización de la superficie de las semillas agregando una solución de lejía comercial (1:4, lejía comercial en agua del grifo) hasta que las semillas lavadas estén cubiertas y mezcle vigorosamente durante 15 minutos. Deseche la solución de lejía y enjuague las semillas 3 veces con agua del grifo esterilizada.
3. Sumerja las semillas en una solución de etanol (80%, v/v) durante 15 minutos con agitación vigorosa, deseche el etanol y lave 3 veces con agua ultrapura esterilizada.
4. Para la germinación del pino, rompa las cubiertas de semillas esterilizadas con un torno mecánico estéril en una campana de flujo, aísle los piñones y colóquelos en un recipiente cerrado con papel de filtro húmedo esterilizado para hidratar los piñones durante la noche⁶.
5. Estratificar los piñones hidratados a 4 °C durante 7 días, para romper la latencia y sincronizar la germinación, y luego mantener en oscuridad a 25 °C hasta la germinación.
   NOTA: El paso de estratificación es opcional.
6. Transfiera los pinos germinados asépticos, en el recipiente cerrado, a un fotoperiodo de luz de 16 h, a 24 °C / 18 °C de termoperiodo y manténgalo durante 2 semanas o hasta que el tallo principal comience a desarrollarse.
7. En la campana de flujo, corte la parte aérea de la plántula por encima de la raíz con un bisturí y transfiérala a un medio de cultivo esterilizado de Schenk y Hildebrandt (SH)¹⁸ (pH = 5,8) suplementado con 30 g/L de sacarosa, 8 g/L de agar, 0,5 mg/L de 6-bencilaminopurina (BAP, una citoquinina) y 0,1 mg/L de ácido indol-3-butírico (IBA, una auxina)⁶, para inducir la multiplicación de microbrotes. Mantener los cultivos en las condiciones descritas anteriormente en una cámara de crecimiento de cultivo in vitro .
8. En la campana de flujo, subcultivo periódicamente (alrededor de 4 semanas) cortando el tejido del callo en la base del brote (porción en contacto con el medio de cultivo) con un bisturí estéril y transfiriendo el racimo de brotes con pinzas estériles a un medio de cultivo de multiplicación fresco.
9. Para la elongación del microtallo, transfiera los microbrotes al medio de cultivo SH descrito anteriormente, pero que contenga 3 g/L de carbón activado en lugar de fitohormonas.
   NOTA: El carbón activado adsorbe los tóxicos y evita la acumulación excesiva de fitohormonas inducidas en el tejido seccionado¹⁹.
10. Para la infección por PWN, transfiera los brotes alargados a un medio de cultivo SH sin fitohormonas ni carbón activado y agregue 100-150 PWN esterilizados en etapa de vida mixta en la parte inferior del microbrote. Mantener en las condiciones descritas anteriormente hasta que los síntomas de la DPP comiencen a notarse (Figura 3)⁶.
11. Para recolectar material vegetal para la extracción de volátiles, utilizar explantes in vitro inmediatamente o congelar (-20 °C) hasta el análisis. En el caso de los volátiles emitidos (fibras SMPE o tubos empaquetados), analice las cajas de microbrotes de inmediato.

5. Aislamiento de compuestos volátiles

NOTA: El aislamiento de volátiles se puede realizar a través de varias técnicas. En este caso, la extracción de volátiles se realiza por hidrodestilación, utilizando un aparato Clevenger²⁰, destilación-extracción, utilizando un aparato Likens-Nickerson²¹, y atrapamiento de volátiles en el espacio de cabeza mediante microextracción en fase sólida (SPME) utilizando fibras recubiertas o tubos empaquetados (sorbente de polímero poroso)²².

1. Hidrodestilación
   1. Utilice un aparato Clevenger para el aislamiento de aceites esenciales. El sistema de destilación está compuesto por a) el aparato Clevenger, b) un matraz de fondo redondo o un Erlenmeyer para contener el agua y el material de pino, c) un equipo de calefacción adecuado, y d) un marco de soporte para mantener el sistema en su lugar (Figura 4A).
   2. Limpie a fondo la cristalería antes de usarla. Utilice abrazaderas de marco de laboratorio para asegurar el aparato Clevenger al marco de celosía. Refrigere el condensador del sistema haciendo circular agua o use un circulador refrigerado si está disponible.
   3. Registre el peso del brote de pino y colóquelo en el matraz de fondo redondo o Erlenmeyer. Ajuste la cantidad de agua para asegurarse de que el recipiente no esté lleno más de la mitad.
   4. Coloque el equipo de calefacción debajo del matraz, verifique la ausencia de fugas y asegúrese de que todas las partes del sistema estén en la posición correcta y aseguradas al marco de soporte.
      NOTA: Las piezas de conexión de vidrio esmerilado del Clevenger y el matraz deben limpiarse, desengrasarse y secarse a fondo antes de la conexión. Para ello, utilice un trozo de papel de filtro ligeramente humedecido con acetona. No se debe usar grasa en estas piezas.
   5. Introduzca el agua a través del embudo de llenado, situado en el tubo diagonal de retorno en la parte central del aparato Clevenger. Ajuste la posición del grifo de tres vías para que el agua fluya por igual en los dos tubos (el diagonal y el graduado) hasta llenar el matraz, justo antes de fluir hacia abajo desde el tubo diagonal de retorno hacia él (ver Figura 4).
   6. Encienda la fuente de calor y ajústela para que el agua hierva a una velocidad de destilación de 2 a 3 mL/min.
   7. Inicie el tiempo de destilación cuando la primera gota de agua destilada caiga en el tubo graduado en el lado derecho del aparato Clevenger. El tiempo medio de destilación es de 3 h²³, pero se pueden utilizar períodos de destilación más cortos o más largos según los requisitos específicos. Los aceites esenciales suelen estar en el líquido sobrenadante, ya que suelen ser más ligeros que el agua aromática destilada que se encuentra debajo (hidrolato).
      PRECAUCIÓN: Cuando la destilación está en marcha, el aparato Clevenger estará caliente al tacto.
   8. Una vez finalizado el tiempo de destilación, detenga el calentamiento y déjelo reposar durante unos 10 minutos para permitir que se detenga la destilación y la ebullición. Después de 10 minutos, abra el grifo en el sentido de las agujas del reloj para que el hidrolato fluya hasta que el aceite esencial llegue a la parte graduada. Lea el volumen de aceite esencial aislado. Calcule el rendimiento como mL/g (peso fresco o seco), expresado como porcentaje (%, v/p).
   9. En el caso de aceites esenciales con volumen inferior a 0,05 mL, no se puede determinar la graduación más baja en el tubo graduado. Para recuperar el aceite esencial, use n-pentano destilado para enjuagar el aparato Clevenger.
   10. Para recuperar el aceite esencial utilizando n-pentano destilado, una vez finalizada la destilación, espere unos 10 a 15 minutos y abra el grifo de tres vías en sentido contrario a las agujas del reloj para que el hidrolato fluya fuera del tubo diagonal de retorno hasta justo debajo del embudo de llenado. Con un gotero limpio, introduzca el n-pentano destilado en el embudo de llenado hasta la parte superior izquierda del tubo diagonal de retorno. Evite tocar el embudo de llenado para evitar la contaminación cruzada.
   11. Con una botella de lavado de agua destilada, introduzca agua en el embudo de llenado. El n-pentano fluirá hasta el matraz de destilación y se evaporará con el calor residual del agua de decocción. De esta manera, atravesará el sistema, se disolverá y arrastrará los volátiles a la superficie del hidrolato, en el tubo graduado. Abra el grifo de tres vías en el sentido de las agujas del reloj a su posición normal.
   12. Proceda como en 5.1.8. para recoger el aceite esencial disuelto en n-pentano.
   13. Concentre la mezcla de aceite esencial y n-pentano a un volumen mínimo de aproximadamente 100 μL a temperatura ambiente bajo flujo de nitrógeno utilizando un sistema de evaporador de purga. Manténgalo a -20 °C hasta el análisis.
       NOTA: No se concentre hasta la sequedad para evitar la pérdida de compuestos volátiles.
2. Destilación-extracción
   1. Utilice el aparato de Likens-Nickerson para extraer los volátiles de las plantas. El sistema de destilación-extracción está compuesto por: a) el aparato de Likens-Nickerson, b) un matraz de fondo redondo para retener el agua y el material de pino (brazo del lado derecho de la unidad de destilación), y otro para contener un disolvente orgánico inmiscible, como el n-pentano destilado (brazo del lado izquierdo de la unidad de destilación), c) dos dispositivos de calentamiento adecuados, d) un condensador, y e) un marco de soporte para sostener el sistema (Figura 4B).
      NOTA: Utilice n-pentano destilado en el laboratorio para evitar la contaminación de la muestra con estabilizadores añadidos con disolvent.
   2. Comience por hacer circular el agua en el condensador asegurado o use un circulador refrigerado si está disponible.
   3. Utilice abrazaderas de marco de laboratorio para asegurar la unidad de destilación-extracción al marco de celosía. Cargue el matraz de fondo redondo con el material de pino a extraer y agregue agua hasta la mitad de su capacidad. El matraz más pequeño de 100 ml de fondo redondo debe estar medio lleno de n-pentano destilado.
      NOTA: Antes de conectar, las piezas de conexión de vidrio esmerilado de los componentes de vidrio deben limpiarse, desengrasarse y secarse bien. Un pedazo de papel de filtro que se haya mojado brevemente con acetona se puede usar para limpiar.
   4. Coloque las mantas calefactoras debajo de cada matraz. Verifique que no haya fugas y que todos los componentes del sistema estén correctamente colocados y sujetos al marco de la celosía del laboratorio. Encienda las fuentes de calor y ajústelas a sus respectivos puntos de ebullición. El agua debe hervir a una velocidad de destilación de 2-3 mL/min.
      PRECAUCIÓN: Durante el proceso de destilación-extracción, el aparato Likens-Nickerson estará caliente al tacto.
   5. Una vez finalizado el tiempo de destilación, detenga el calentamiento del matraz con material de pino y deje destilar el n-pentano solo durante 10 min. Después de que el n-pentano se convierta en un líquido transparente, detenga el calentamiento y déjelo reposar durante unos 10 minutos. El cambio de color indica que el destilado está ahora en el matraz con n-pentano.
   6. Concentre el extracto de n-pentano a presión reducida (70 - 73 mmHg) en un evaporador rotativo a temperatura ambiente. Transfiera el extracto parcialmente concentrado a un vial y concéntrelo a ≈100 μL bajo un chorro de nitrógeno en un evaporador de purga a temperatura ambiente. Después de la extracción, mantenga las muestras almacenadas a -20 °C hasta el análisis.
      NOTA: El extracto no debe concentrarse hasta la sequedad, ya que esto inducirá la pérdida de compuestos volátiles.
3. Muestreo del espacio de cabeza con una fibra recubierta
   1. La configuración de microextracción en fase sólida (SPME) implica a) un soporte SPME operado manualmente, b) fibra recubierta y c) un soporte apropiado para soportar el soporte SPME (Figura 4C). Para el protocolo actual, utilice un sistema manual de espacio de cabeza SPME en vial con fibra recubierta de polidimetilsiloxano (PDMS) de 100 μM para atrapar volátiles.
      NOTA: Otras fibras disponibles comercialmente tienen recubrimientos con diferentes características químicas y deben elegirse de acuerdo con el efecto deseado.
   2. Acondicione térmicamente cada fibra SPME durante un máximo de 20 minutos a 250 °C antes de su uso, de acuerdo con las recomendaciones del fabricante.
   3. Inserte el material de pino, o parte de pino, en un frasco de vidrio transparente y séllelo con un tapón de rosca con orificio con un revestimiento de politetrafluoroetileno (PTFE) (tabique). El material debe estar al menos a 2 o 3 cm de la parte superior del vial, para que la fibra no toque la muestra.
   4. Realizar experimentos de control simultáneamente utilizando fibras SPME mediante el muestreo de viales vacíos para identificar los contaminantes del sistema, o para confirmar la ausencia de arrastre del uso repetido de las fibras SPME.
   5. Mantenga el material de pino dentro del vial durante 1 h antes de la recolección de volátiles para el equilibrio de la atmósfera.
      NOTA: Los ensayos con SPME pueden realizarse a temperatura ambiente o a una temperatura ajustable colocando los viales en una gradilla de soporte e insertándolos en un baño María.
   6. Ajuste la profundidad de la aguja de perforación del tabique desde el soporte SPME para perforar el tabique pero sin entrar en contacto con el material cuando la fibra esté expuesta.
   7. Con la fibra retirada, inserte la aguja del soporte a través del revestimiento de PTFE. Empuje el émbolo hacia abajo para exponer la fibra. Gire el émbolo en el sentido de las agujas del reloj y sostenga el tornillo de retención en el lado izquierdo horizontal de la ranura^{Z 24}. Exponga la fibra durante 1 h.
   8. Retraiga la fibra girando el émbolo en sentido contrario a las agujas del reloj hasta que el émbolo llegue a la parte superior de la ranura Z. Los volátiles recopilados ahora están listos para el análisis directo de GC y/o GC-MS.
      NOTA: Si es necesario, las fibras se pueden almacenar a temperatura ambiente antes del análisis, pero no más de una semana.
4. Atrapamiento del espacio de cabeza con tubos empaquetados
   1. Prepare una configuración para el atrapamiento de volátiles del espacio de cabeza con trampas de acero inoxidable empaquetadas que consisten en a) un sistema de bombeo de flujo másico, b) tubería de PTFE, c) filtros de aire de carbón activado, d) tubos empaquetados de polímero de resina porosa, y e) bolsas de cristalería o tereftalato de polietileno (PET) (bolsas de cocina) (Figura 4D)²⁵.
   2. Mantenga el material de pino colocado en cristalería cubierta o dentro de bolsas de PET para acumular volátiles en el espacio de cabeza.
      NOTA: Tenga en cuenta que los volátiles del plástico común son abundantes y se pueden detectar en grandes cantidades a través de GC-MS.
   3. Para un sistema de circuito cerrado, conecte el circuito de la siguiente manera: a) la salida de la bomba a la tubería de PTFE, b) la tubería de PTFE a los filtros de aire de carbón activado, c) desde los filtros de aire hasta la tubería adicional que se conecta a la cristalería o a las bolsas de PET con el material de pino, d) el tubo empaquetado a la salida de la cristalería o de la bolsa de PET, e) tubería de PTFE adicional desde la salida del tubo de acero inoxidable hasta la entrada de la bomba de flujo másico²².
      NOTA: Los tubos de acero inoxidable rellenos de polímero poroso deben acondicionarse térmicamente en la unidad de desorción térmica de acuerdo con las recomendaciones del fabricante, por ejemplo, hasta 15 minutos a 100 °C, antes de su uso. Tenga en cuenta que los tubos tienen una dirección de flujo que debe respetarse.
   4. Recoja los volátiles bombeando 100 L de aire filtrado a través del sistema de pino a 0,6 L por minuto, utilizando la bomba de flujo másico para controlar la cantidad y la tasa de aire filtrado.
      NOTA: La cantidad y/o el flujo de aire del espacio de cabeza que fluye a través de la columna puede influir en la cantidad de volátiles atrapados y, posteriormente, en el cromatograma obtenido.
   5. Después de la recolección de volátiles, cierre los tubos empaquetados en ambos extremos con tapas de almacenamiento herméticas. Almacenar a temperatura ambiente (durante un máximo de 1 semana) y analizar lo antes posible, ya que los volátiles pueden degradarse o escapar.
   6. Para el lavado, enjuague todos los tubos y cristalería de PTFE con etanol al 70% y caliente en un horno a 230 °C durante al menos 2 h²⁵.

6. Análisis de perfiles volátiles

1. Realizar análisis de perfiles volátiles a través de cromatografía de gases-espectrometría de masas (GC-MS), o de forma rutinaria a través de cromatografía de gases con detección de ionización de llama (GC-FID) para la cuantificación de volátiles previamente identificados.
   NOTA: La descripción de los métodos de análisis por GC-FID y GC-MS es extensa y va más allá del objetivo del presente trabajo. Se aconseja al lector que utilice procedimientos o normas en el laboratorio, como la ISO 7609²⁶, que proporcionan condiciones de funcionamiento relevantes para la cuantificación de componentes individuales y datos bibliográficos sobre la comparación de dos métodos analíticos²⁷.
2. Utilice analitos que sean puros o transportados en un solvente, por ejemplo, n-pentano o n-hexano, y que se inyecten o adsorban directamente en una fibra, por ejemplo, SPME y se desorban directamente en el inyector del cromatógrafo o mediante el uso de una unidad de desorción térmica (TD) conectada a la unidad de GC.
   NOTA: A pesar de su mayor sensibilidad, mayor resolución y menor tiempo de análisis, las columnas capilares tienen una baja capacidad de muestra. Por lo tanto, aunque casi todas las condiciones de funcionamiento pueden ser similares, el tipo de analito (puro, en solvente, SPME, etc.) puede requerir diferentes procedimientos de inyección divididos / sin división.
3. Llevar a cabo la identificación de componentes volátiles comparando sus índices de retención, evaluados de acuerdo con la norma ISO 7609, con los espectros GC-MS de una biblioteca creada en el laboratorio utilizando muestras de referencia cuya identidad del componente fue establecida por RI, GC-MS y ¹³C-RMN, compuestos sintetizados y aislados en el laboratorio, y estándares disponibles comercialmente, o, en su defecto, bibliotecas de espectros de masas disponibles comercialmente.
4. Expresar los resultados mediante una representación gráfica (cromatograma) y un perfil cromatográfico que enumere las cantidades relativas de todos los compuestos identificados en la muestra, con su orden de elución indicado por sus índices de retención en la columna adecuada utilizada.
5. Para un gran número de muestras, realice una evaluación de análisis estadístico adecuada basada en la composición química para la interpretación de la disposición de las muestras (agrupaciones y/o separaciones).

Resultados

El PWN se reproduce rápidamente en condiciones óptimas, y los tiempos de generación pueden ser tan bajos como 4 días, con cada hembra poniendo alrededor de 80 huevos durante su vida²⁸. Utilizando la metodología descrita anteriormente, se pueden obtener grandes cantidades de PWNs dependiendo del crecimiento de los hongos. Dentro de un período de crecimiento de 8 días, los PWN pueden tener un aumento de 100 veces en el número de población (

Discusión

El protocolo presentado aquí describe una metodología mejorada para analizar compuestos volátiles en pino marítimo infectados por el PWN, donde la variabilidad ambiental y genética se reduce y no influye en los resultados. Utilizando líneas puras de genotipos de pino marítimo in vitro , los volátiles extraídos y emitidos pueden analizarse como respuesta del huésped a una de las amenazas bióticas más dañinas para los bosques de pino.

El ma...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
38 mesh test sieve	Retsch	60.131.000038
6-Benzylaminopurine (6-BAP)	Duchefa Biochemie	B0904
Charcoal activated	Duchefa Biochemie	C1302
Clevenger apparatus	WINZER Laborglastechnik	25-000-02
Hydrogen peroxide solution	Sigma-Aldrich	H1009-500ML
Indole-3-butyric acid (IBA)	Duchefa Biochemie	I0902
Likens-Nickerson apparatus	VitriLab LDA.	c/IN29/32
Microbox round containers	Sac O2	O118/80+OD118
n-Pentane	Sigma-Aldrich	1.00882
PARAFILM M sealing film	BRAND	HS234526B-1EA
Phyto agar	Duchefa Biochemie	P1003
Potato Dextrose Agar	BD DIFCO	213400
Scalpel blade no. 24	Romed Holland	BLADE24
Schenk & Hildebrandt Basal salt medium	Duchefa Biochemie	S0225
Schenk & Hildebrandt vitamin mixture	Duchefa Biochemie	S0411
SPME fiber assembly Polydimethylsiloxane (PDMS)	Supelco	57300-U
SPME Fiber Holder	Supelco	57330-U
Sucrose	Duchefa Biochemie	S0809
Tenax TA- stainless steel tubes- conditioned + capped	Markes International	C1-AAXX-5003