İn Vivo ve İn Vitro Çamların Çam Ağacı Nematodu Bursaphelenchus xylophilus ile Enfeksiyonu ve İndüklenen Uçucuların İzolasyonu

Özet

Protokol, Pinus pinaster'ın in vivo ve in vitro çam ağacı nematod enfeksiyonunu ve bunların Gaz Kromatografisi (GC) ve Kütle Spektrometresine (GC-MS) bağlı GC yoluyla uçucu analizini açıklar.

Özet

Çam ağacı nematodu (PWN), kozalaklı türlerde çam solgunluğu hastalığına (PWD) neden olan bir fitoparazittir. Bu bitki paraziti nematod, Asya ülkelerinde, örneğin Japonya, Çin ve Kore'de çam ormansızlaşmasına büyük ölçüde katkıda bulunmuştur. Son yirmi yılda, Avrupa'da, Portekiz ve İspanya büyük ölçüde etkilendi. Duyarlı konukçu türlerde PWN enfeksiyonu ve/veya PWD ilerlemesi mekanizmaları üzerine yapılan araştırmalar, çam fidelerinin sera koşullarında kontrollü enfeksiyonuna dayanmaktadır. Bu teknik zahmetlidir ve önemli ekonomik ve insan kaynaklarını harekete geçirir. Ek olarak, bazı çam türleriyle ilişkili genetik çeşitlilikten ve aynı zamanda dış faktörlerin müdahalesinden kaynaklanan değişkenliğe eğilimli olabilir. Alternatif olarak, PWN'lerle in vitro çam ko-kültürleri, a) tek çevresel veya besinsel değişkenlerin kontrol edilmesine izin verdikleri, b) daha az yer kapladıkları, c) elde etmek için daha az zaman gerektirdikleri ve d) kontaminasyondan veya konakçı genetik varyasyonundan arınmış oldukları için biyokimyasal değişiklikleri incelemek için daha avantajlı bir sistem sunar. Aşağıdaki protokol, deniz çamı Pinus pinaster'ın standart in vivo PWN enfeksiyonunu ve çam uçucu maddeleri üzerindeki bu fitoparazit etkisini incelemek için geliştirilmiş bir metodoloji olarak PWN ile çam sürgünlerinin yeni in vitro ko-kültürlerinin kurulmasını detaylandırmaktadır. PWN ile indüklenen uçucular, hidrodamıtma ve damıtma-ekstraksiyon yoluyla in vivo ve in vitro enfekte olmuş çamlardan ekstrakte edilir ve yayılan uçucular, elyaf veya paketlenmiş kolon teknikleri kullanılarak katı faz mikroekstraksiyonu (SPME) ile yakalanır.

Giriş

Çam ağacı nematodu (PWN), Bursaphelenchus xylophilus (Steiner ve Bührer 1934) Nickle 1970, esas olarak Pinus türlerini parazitleştiren bir bitki paraziti nematoddur. Bu fitoparazit, Monochamus cinsinin böcekleri tarafından, böceğin olgunlaşma beslemesi sırasında hassas çam türlerinin ağaçlarına vektörlenir. PWN, reçine kanallarına saldırarak ve reçine akışını azaltarak ve damar dokusuna zarar vererek su sütununda kesintilere neden olarak ağacı öldürür. Ağaç gölgesindeki su eksikliği, çam solgunluğu hastalığının (PWD) ilk görünür semptomlarına neden olur, yani çam iğneleri, fotosentezin kesilmesinden ve kurumaya bağlı olarak sarkmasından sonra klorotik hale gelir. Çam genellikle reçine ve uçucu bileşiklerin üretimi yoluyla biyotik ve abiyotik strese yanıt verir¹. Bu nedenle, çam savunma mekanizmalarını anlamak, PWN saldırılarının spesifik etkilerini belirlemek ve haşere kontrolü için alternatif yöntemler bulmak için önemlidir².

Şu anda, tarla koşulları altında deney, enfekte olmuş çamların mevcudiyetine, PWN enfeksiyonunun doğrulanmasına ve değişken çevresel koşullara bağlıdır. Sera koşullarında bu parametreler daha kolay kontrol edilebilir; Bununla birlikte, konakçının genetik çeşitliliği güçlü bir değişkenlik kaynağı haline gelir³. Örneğin, Pinus pinaster'ın direnç tepkisi üzerine yapılan bir çalışmada, terpen limonen ve reçine asitlerinin üretimi PWN enfeksiyonu⁴ ile ilişkilendirilmiştir. Bununla birlikte, az sayıda numune ve doğal koşulların değişkenliği nedeniyle, numunelerin yalnızca yarısı için tespit edilebilir değişiklikler kaydedildi. Serada yetiştirilen çam fideleri kullanılarak yapılan başka bir çalışmada, çevre koşulları daha kolay kontrol edilmesine rağmen, doğal çam genetik çeşitliliği, çıkarılan uçucu maddelerde büyük bir değişkenliğe neden olmuştur⁵. Hastalığa bağlı çam uçucuları çevresel ve genetik varyasyondan büyük ölçüde etkilenebileceğinden, in vitro sürgün kültürlerine başvurmak, çam dokusunun PWN enfeksiyonuna kimyasal ve biyokimyasal tepkisi üzerine yapılan çalışmalar için iyi bir alternatiftir ^5,6. Bir bitki genotipinin in vitro olarak çoğaltılmasıyla, genetik yapısı süresiz olarak korunabilir ve klonlanabilir, bu da in vivo koşullara göre daha az alanda ve daha kısa sürede daha yüksek miktarda genetik olarak özdeş bireyin kurulmasına yol açar. Bu kültürler, kolayca manipüle edilebilen beslenme ve çevre koşulları altında basit bir çalışma sistemidir, bu nedenle uçucu maddelerin üretimi ve emisyonunun değerlendirilmesinde geleneksel sistemlere ek avantajlar sunarlar ^7,8. Bu sistemler, çoğu zaman önemli kaynaklar gerektiren, yani hedef ağaçların bazen ulaşılması zor alanlarda bulunduğu, pahalı ekipman, özel bir işgücü ve daha uzun analiz süreleri gerektiren odunsu türlerde yapılan araştırmalar için özellikle avantajlıdır⁸. İn vitro, PWN ile çam ko-kültürleri, nematod ve bitki arasındaki metabolik etkileşimlerin farklı aşamalarda değerlendirilmesini sağlar⁹. Uçucu maddelerin analizi için bu çok önemlidir, çünkü profil oluşturma teknikleri son derece doğru hale gelmiştir ve örneklemedeki küçük farklılıklar uçucu profillerde önemli değişikliklere neden olabilir. Kütle spektrometresi (GC-MS) ile birleştirilmiş gaz kromatografisi, uçucuların analizi için güçlü bir tekniktir ve uçucuların hızlı ve akıcı bir şekilde profillenmesine izin verir¹⁰. Burada sunulan protokol, sera koşulları altında in vivo çam fidelerini enfekte etme tekniklerini ve indüklenmiş uçucuların ekstraksiyonu ve profillenmesi için optimize edilmiş genetik olarak özdeş çamların in vitro sürgün kültürlerini açıklar.

Protokol

1. Büyüyen in vitro çam ağacı nematodu

NOT: Çam ağacı nematodları, Botrytis cinerea (de Bary) Whetzel^11'in spor yapmayan bir türünün mantar miselyumu ile beslenerek yetiştirilir.

1. Rutin alt kültür için, mantar kolonisinin en dış sınırından bir kültür tıkacını (0,5 cm çapında) bir steril patates dekstroz agar (PDA) tabağına aktarın ve 7 ila 10 gün boyunca 25 ± 1 ° C'de tutun veya mantar kolonisi plakanın kenarına ulaşana kadar.
   NOT: Mantar büyümesi için diğer genel mantar büyüme ortamı türleri kullanılabilir.
2. Daha fazla miktarda PWN elde etmek için, buharla sterilize edilmiş hidratlı sertifikalı organik arpa taneleri (Hordeum vulgare L.) üzerinde in vitro olarak yetiştirilen B. cinerea kullanın. Kapalı geniş boyunlu 250 mL Erlenmeyer şişelerinde 15 mL ultra saf suya 15 g mısır gevreği ekleyin ve sterilize edin. Ardından, bir B. cinerea kültür tapası ile aşılayın ve 25 ± 1 ° C'de 7 ila 10 gün veya tahılın yüzeyi tamamen kolonize olana kadar saklayın¹².
   NOT: Bitki paraziti nematodlar için ulusal referans laboratuvarlarından araştırma amaçlı nematodlar talep edilebilir.
3. B. cinerea in vitro kültürleri bir PWN sulu süspansiyonu (en az 20 erkek ve 30 dişi içeren) ile aşılayarak PWN kültürlerini başlatın ve daha önce tarif edilen koşullarda 7 ila 10 gün boyunca veya mantar kolonisi tamamen tüketilene ve PWN popülasyonu plakanın veya şişenin duvarlarına tırmanmaya başlayana kadar karanlıkta tutun (Şekil 1). Kurumasını önlemek için plakaları veya şişeleri plastik filmle kapatın.
   NOT: Dişiler vulval flep, uzun uterus sonrası kese ve genellikle yuvarlak bir kuyruk ucu ile ayırt edilebilir; Erkekler, karakteristik spiküllere sahip ventral olarak kavisli sivri bir kuyruk ucuna sahiptir¹³. PWN süspansiyonlarını pipetlerken, pipetlenmiş süspansiyonun mantar yüzeyinde damlacıklar oluşturmaması ve PWN'leri yüzey gerilimi yoluyla hapsetmesi için mantar kolonisini çizin.
4. Şişenin duvarlarını musluk suyuyla durulayarak, içindekileri bir Baermann hunisi veya tepsisindeki bir kağıt havluya dökerek ve suyla daldırarak PWN'leri izole edin¹⁴. 24 ila 48 saat sonra, canlı nematodlar enfekte olmuş materyalden suya geçmiş olacaktır. 38 μm gözenekli elek¹⁵ kullanarak eleyerek geri kazanın. Biriken PWN'leri musluk suyuyla bir kaba yıkayın.
   NOT: PWN ile temas eden herhangi bir malzeme, bir karantina organizması olduğu için uygun şekilde dekontamine edilmelidir; 10 ila 20 dakika etanole daldırma genellikle yeterlidir. Reddedilen sulu süspansiyonlar sterilize edilmeli veya en az 35 dakika boyunca 60 °C'ye ısıtılmalıdır.
5. PWN'leri içeren sulu süspansiyonu hemen kullanın veya daha uzun bir saklama süresi (2 aya kadar) için 11 °C'de tutun.

2. Karışık yaşam evresi çam ağacı nematodlarının sterilize edilmesi

1. Bir akış davlumbazında, yaklaşık 5000 PWN içeren bir hacimde PWN süspansiyonunu steril 38 μm gözenekli bir eleğe pipetleyin ve steril suyla yıkayın.
   NOT: Binoküler mikroskop altında nematodları sayın (40x).
2. PWN'leri içeren eleğin alt yarısını %20'lik bir hidrojen peroksit (H₂O₂) çözeltisine batırın ve 15 dakika boyunca manuel olarak karıştırın.
3. Steril PWN'leri elekten steril su vererek yıkayın. Bu adımı 3 kez tekrarlayın. Son yıkamada eleği, PWN'ler elek sınırında toplanacak şekilde eğin. Elek kenarına 1 mL steril su pipetleyerek steril nematod süspansiyonunu geri kazanın ve 11 °C'de saklayın veya hemen kullanın.
   NOT: Sterilizasyonun başarısı, bir PDA ortamında 100 μL'lik bir PWN süspansiyonu alikotunun kaplanması ve yaklaşık 1 hafta boyunca kontaminasyonların düzenli olarak izlenmesiyle değerlendirilebilir.

3. İn vivo Pinus pinaster fidelerinin enfeksiyonu

NOT: Aşılama denemeleri 2 yaşındaki ≥ P. pinaster fidanlarında yapılmaktadır. Ağaçlar sertifikalı ticari perakendecilerden satın alınabilir, ancak sertifikalı tohumlardan bir serada da yetiştirilebilir.

1. Adım 1'de tarif edildiği gibi PWN aşısını alın ve süspansiyona su ekleyerek veya nematodların çökelmesini bekleyerek (yaklaşık 60 dakika) ve yüzey suyunu boşaltarak hacmi düşürerek karışık yaşam aşaması PWN'lerin süspansiyonlarını 1000 PWN / mL'ye ayarlayın. Oda sıcaklığında, dürbün mikroskobu altında 40x'te içbükey bir slaytta sayım yapın.
2. Aşılamaya başlamak için, iğneleri çam sapının üst 5 cm'sinin altındaki bir bölümden manuel olarak çıkarın ve sterilize edilmiş bir neşter¹⁶ ile yüzeysel uzunlamasına bir kesi (0,5 ila 1 cm uzunluğunda) yapın.
   NOT: Kesi, nematodun iç çam dokularına erişimini sağlamak için yapılır.
3. Yara bölgesine, pipetlenmiş PWN süspansiyonunun 0,5 mL'sini tutmak için bir parça sterilize pamuk yerleştirin ve nemi korumak için şeffaf bir şeritle sabitleyin.
   NOT: Nematodlar hızla çökeleceği için PWN süspansiyonunu her aşılama arasında kuvvetlice karıştırın. Süspansiyon aşılama bölgesinde kurursa, nematod enfeksiyonu başarısız olabilir, bu nedenle nemli pamuğu yeterince örtün.
4. Kontrol çamları için PWN süspansiyonunu steril su ile değiştirin.
5. PWD ilerlemesini düzenli olarak takip edin ve renksiz ve solmuş iğnelerin yüzdesini ölçerek semptomatolojiyi puanlayın. Dış semptom olmaması için 0, %25'e kadar iğne renk değişikliği için 1, iğne renk değişikliğinin %25 ila %50'si için 2, iğne renk değişikliğinin %50 ila %75'i için 3 ve tamamen kahverengi iğneli çamlar için 4 puan alın (Şekil 2).
6. Nematodlar 10 °C'nin altında metabolik olarak inaktif hale geldiğinden ve gelişme 30 °C'nin üzerinde etkilenebileceğinden, serayı nemli koşullarda (%60-%80) ve sık sık sulayın (toprağın maksimum su tutma kapasitesinin %70'inde tutun).
7. Aşılamadan 20 gün sonra, fideleri sapın tabanından keserek ve kahverengi kağıt torbalarda dondurarak (-20 ° C) uçucu maddelerin ekstraksiyonu için bitki materyalini hasat edin. Yayılan uçucular (SMPE lifleri veya paketlenmiş tüpler) için, çam fidelerinden hemen, oda sıcaklığında ^5,17 numune alın.

4. İn vitro çam sürgün kültürlerinin oluşumu ve enfeksiyonu

1. Yüzey sterilizasyonundan önce, en büyük kalıntıları gidermek için sertifikalı P. pinaster tohumlarını akan musluk suyunda yıkayın ve ardından daha ince kalıntıları yıkamak için ortak bir deterjan solüsyonuyla (40 mL su başına 1 damla) kuvvetli çalkalama ile yıkayın.
2. Bir akış davlumbazında, yıkanmış tohumlar kaplanana kadar ticari bir ağartma çözeltisi (1:4, musluk suyunda ticari ağartıcı) ekleyerek tohum yüzeyi sterilizasyonuna başlayın ve 15 dakika kuvvetlice karıştırın. Çamaşır suyu solüsyonunu atın ve tohumları 3x sterilize edilmiş musluk suyuyla durulayın.
3. Tohumları şiddetli çalkalama ile 15 dakika boyunca bir etanol çözeltisine (% 80, h / h) daldırın, etanolü atın ve 3x'i sterilize edilmiş ultra saf suyla yıkayın.
4. Çam çimlenmesi için, sterilize edilmiş tohum kabuklarını bir akış davlumbazında steril bir mekanik torna tezgahı ile kırın, çam fıstıklarını izole edin ve çam fıstığını gece boyunca nemlendirmek için sterilize edilmiş ıslak filtre kağıdı ile kapalı bir kaba koyun⁶.
5. Dormansiden kurtulmak ve çimlenmeyi senkronize etmek için hidratlı çam fıstığını 7 gün boyunca 4 °C'de tabakalaştırın ve ardından çimlenmeye kadar 25 °C'de karanlıkta tutun.
   NOT: Tabakalaşma adımı isteğe bağlıdır.
6. Aseptik çimlenmiş çamları kapalı kapta 24 °C / 18 °C termoperiyotta 16 saatlik bir ışık fotoperiyoduna aktarın ve 2 hafta veya ana gövde gelişmeye başlayana kadar muhafaza edin.
7. Akış davlumbazında, fidanın kökün üzerindeki hava kısmını bir neşter ile kesin ve 30 g/L sakaroz, 8 g/L agar, 0,5 mg/L 6-benzilaminopurin (BAP, bir sitokinin) ve 0,1 mg/L indol-3-bütirik asit (IBA, bir oksin)⁶, mikro sürgün çoğalmasını indüklemek için. Kültürleri yukarıda açıklanan koşullarda bir in vitro kültür büyüme odasında tutun.
8. Akış başlığında, sürgünün tabanındaki kallus dokusunu (kültür ortamı ile temas eden kısım) steril bir neşter ile keserek ve sürgün kümesini steril cımbızla taze bir çoğaltma kültürü ortamına aktararak periyodik olarak (yaklaşık 4 hafta) alt kültürleyin.
9. Mikrosap uzaması için, mikro sürgünleri yukarıda tarif edilen ancak fitohormonlar yerine 3 g/L aktif kömür içeren SH kültür ortamına aktarın.
   NOT: Aktif kömür, toksik maddeleri adsorbe eder ve kesitli doku¹⁹ üzerinde aşırı indüklenmiş fitohormon birikimini önler.
10. PWN enfeksiyonu için, uzun sürgünleri fitohormonlar veya aktif kömür içermeyen SH kültür ortamına aktarın ve mikro sürgünün altına 100-150 karışık yaşam evresi sterilize PWN ekleyin. PWD semptomları fark edilmeye başlayana kadar yukarıda açıklanan koşullarda devam edin (Şekil 3)⁶.
11. Uçucu maddelerin ekstraksiyonu için bitki materyalini hasat etmek için, hemen in vitro eksplantlar kullanın veya analize kadar dondurun (-20 °C). Yayılan uçucu maddeler (SMPE lifleri veya paketlenmiş tüpler) için mikro sürgün kutularını hemen analiz edin.

5. Uçucu bileşiklerin izolasyonu

NOT: Uçucuların izolasyonu çeşitli tekniklerle gerçekleştirilebilir. Burada, uçucu ekstraksiyon, bir Clevenger aparatı²⁰ kullanılarak hidrodamıtma, bir Likens-Nickerson aparatı²¹ kullanılarak damıtma-ekstraksiyon ve kaplanmış lifler veya paketlenmiş tüpler (gözenekli polimer sorbent) kullanılarak katı faz mikroekstraksiyonu (SPME) yoluyla üst boşluk uçucularının yakalanması yoluyla ^yapılır.22.

1. Hidrodamıtma
   1. Uçucu yağların izolasyonu için bir Clevenger aparatı kullanın. Damıtma sistemi, a) Clevenger aparatı, b) suyu ve çam malzemesini tutmak için yuvarlak tabanlı bir şişe veya bir Erlenmeyer, c) uygun ısıtma ekipmanı ve d) sistemi yerinde tutmak için bir destek çerçevesinden oluşur (Şekil 4A).
   2. Kullanmadan önce cam eşyaları iyice temizleyin. Clevenger aparatını kafes çerçevesine sabitlemek için laboratuvar çerçevesi kelepçelerini kullanın. Sistem kondansatörünü su sirkülasyonu ile soğutun veya varsa soğutmalı bir sirkülatör kullanın.
   3. Çam filizi ağırlığını kaydedin ve yuvarlak tabanlı şişeye veya Erlenmeyer'e yerleştirin. Kabın yarısından fazla dolu olmadığından emin olmak için su miktarını ayarlayın.
   4. Isıtma ekipmanını şişenin altına yerleştirin, sızıntı olup olmadığını kontrol edin ve sistemin tüm parçalarının doğru konumda olduğundan ve destek çerçevesine sabitlendiğinden emin olun.
      NOT: Clevenger ve şişenin buzlu cam bağlantı parçaları, bağlantıdan önce iyice temizlenmeli, yağdan arındırılmalı ve kurutulmalıdır. Bunun için asetonla hafifçe nemlendirilmiş bir parça filtre kağıdı kullanın. Bu kısımlarda gres yağı kullanılmamalıdır.
   5. Clevenger aparatının orta kısmındaki dönüş diyagonal tüpünde bulunan doldurma hunisinden su verin. Üç musluğun konumunu, şişeyi doldurana kadar, dönüş diyagonal borusundan aşağıya akmadan hemen önce, su iki tüpte (çapraz ve dereceli) eşit olarak akacak şekilde ayarlayın (bkz. Şekil 4).
   6. Isı kaynağını açın ve suyu 2 - 3 mL/dk damıtma hızında kaynatacak şekilde ayarlayın.
   7. Damıtılmış suyun ilk damlası Clevenger aparatının sağ tarafındaki dereceli tüpe düştüğünde damıtma süresini başlatın. Ortalama damıtma süresi 3 sa^23'tür, ancak özel gereksinimlere göre daha kısa veya daha uzun damıtma süreleri kullanılabilir. Esansiyel yağlar tipik olarak süpernatant sıvının içindedir, çünkü genellikle aşağıdaki damıtılmış aromatik sudan (hidrolat) daha hafiftirler.
      DİKKAT: Damıtma çalışırken, Clevenger cihazı dokunulamayacak kadar sıcak olacaktır.
   8. Damıtma süresi sona erdiğinde, ısıtmayı durdurun ve damıtma ve kaynatmanın durması için yaklaşık 10 dakika bekletin. 10 dakika sonra, uçucu yağ dereceli kısma ulaşana kadar hidrolatın dışarı akmasına izin vermek için musluğu saat yönünde açın. İzole edilen uçucu yağ hacmini okuyun. Verimi mL/g (taze veya kuru ağırlık) olarak hesaplayın, yüzde (%, v/w) olarak ifade edilir.
   9. Hacim 0.05 mL'nin altında olan uçucu yağlar söz konusu olduğunda, dereceli tüpteki en düşük derece, verim belirlenemez. Esansiyel yağı geri kazanmak için, Clevenger aparatını durulamak için damıtılmış n-pentan kullanın.
   10. Damıtılmış n-pentan kullanarak uçucu yağı geri kazanmak için, damıtma bittiğinde, yaklaşık 10 ila 15 dakika bekleyin ve üç musluğu saat yönünün tersine açın, böylece hidrolat, doldurma hunisinin hemen altına kadar dönüş diyagonal borusundan dışarı akar. Temiz bir damlalıkla, damıtılmış n-pentanı, dönüş diyagonal tüpünün sol üst tarafına kadar doldurma hunisine sokun. Çapraz kontaminasyonu önlemek için doldurma hunisine dokunmaktan kaçının.
   11. Damıtılmış bir su yıkama şişesi ile doldurma hunisine su ekleyin. n-Pentan, damıtma şişesine akacak ve kaynatma suyunun kalan ısısı ile buharlaşacaktır. Bu şekilde, sistemden geçecek, çözülecek ve uçucu maddeleri dereceli tüpte hidrolatın yüzeyine sürükleyecektir. Üç musluğu saat yönünde normal konumuna getirin.
   12. 5.1.8'deki gibi devam edin. N-pentan içinde çözünmüş uçucu yağı toplamak için.
   13. Esansiyel yağ ve n-pentan karışımını, bir blöf evaporatör sistemi kullanarak nitrojen akışı altında oda sıcaklığında minimum yaklaşık 100 μL hacme konsantre edin. Analize kadar -20 °C'de tutun.
       NOT: Uçucu bileşiklerin kaybını önlemek için kuruluğa konsantre olmayın.
2. Damıtma-ekstraksiyon
   1. Bitkilerden uçucu maddeleri çıkarmak için Likens-Nickerson cihazını kullanın. Damıtma-ekstraksiyon sistemi, a) Likens-Nickerson aparatı, b) su ve çam malzemesini tutmak için yuvarlak tabanlı bir şişe (damıtma ünitesinin sağ yan kolu) ve damıtılmış n-pentan (damıtma ünitesinin sol yan kolu) gibi karışmayan bir organik çözücüyü tutmak için başka bir şişeden oluşur, c) iki uygun ısıtma cihazı, d) bir kondansatör, ve e) sistemi tutmak için bir destek çerçevesi (Şekil 4B).
      NOT: Numunenin solvent katkılı stabilizatörlerle kirlenmesini önlemek için laboratuvarda damıtılmış n-pentan kullanın.
   2. Güvenli kondansatörde su dolaştırarak başlayın veya varsa soğutmalı bir sirkülatör kullanın.
   3. Damıtma-ekstraksiyon ünitesini kafes çerçevesine sabitlemek için laboratuvar çerçevesi kelepçeleri kullanın. Yuvarlak tabanlı matarayı çıkarılacak çam malzemesiyle doldurun ve yarı tam kapasiteye kadar su ekleyin. Daha küçük 100 mL yuvarlak tabanlı şişe, damıtılmış n-pentan ile yarı yarıya dolu olmalıdır.
      NOT: Bağlamadan önce, cam bileşenlerin buzlu cam bağlantı parçalarının iyi temizlenmesi, yağdan arındırılması ve kurutulması gerekir. Temizlik için asetonla kısa bir süre ıslatılmış bir filtre kağıdı parçası kullanılabilir.
   4. Isıtma mantolarını her bir şişenin altına yerleştirin. Sızıntı olmadığını ve sistemin her bileşeninin doğru şekilde yerleştirildiğini ve laboratuvar kafes çerçevesine sabitlendiğini doğrulayın. Isı kaynaklarını açın ve ilgili kaynama noktalarına ayarlayın. Su, 2-3 mL / dak damıtma hızında kaynatılmalıdır.
      DİKKAT: Damıtma-ekstraksiyon işlemi sırasında, Likens-Nickerson aparatı dokunulamayacak kadar sıcak olacaktır.
   5. Damıtma süresi sona erdiğinde, çam malzemeli şişeden ısıtmayı durdurun ve n-pentanın 10 dakika boyunca tek başına damıtılmasına izin verin. N-pentan şeffaf bir sıvıya dönüştükten sonra, ısıtmayı durdurun ve yaklaşık 10 dakika bekletin. Renk değişimi, damıtmanın artık n-pentan içeren şişede olduğunu gösterir.
   6. N-pentan ekstraktını düşük basınç altında (70 - 73 mmHg) oda sıcaklığında döner bir buharlaştırıcı üzerinde konsantre edin. Kısmen konsantre ekstraktı bir şişeye aktarın ve oda sıcaklığında bir blöf buharlaştırıcıda bir nitrojen akışı altında ≈100 μL'ye konsantre edin. Ekstraksiyondan sonra numuneleri analize kadar -20 °C'de saklayın.
      NOT: Ekstrakt, uçucu bileşiklerin kaybına neden olacağından kuruyana kadar konsantre edilmemelidir.
3. Kaplanmış elyaf ile üst boşluk örneklemesi
   1. Katı faz mikroekstraksiyon (SPME) kurulumu, a) manuel olarak çalıştırılan bir SPME tutucusu, b) kaplanmış elyafı ve c) SPME tutucusunu desteklemek için uygun bir standı içerir (Şekil 4C). Mevcut protokol için, uçucuları yakalamak için 100 μM polidimetilsiloksan (PDMS) kaplı fiber içeren manuel bir şişe içi SPME-headspace sistemi kullanın.
      NOT: Piyasada bulunan diğer elyaflar, farklı kimyasal özelliklere sahip kaplamalara sahiptir ve istenen etkiye göre seçilmelidir.
   2. Üreticinin tavsiyelerine göre, kullanmadan önce her SPME fiberini 250 °C'de 20 dakikaya kadar termal olarak koşullandırın.
   3. Çam malzemesini veya çam parçasını şeffaf bir cam şişeye yerleştirin ve politetrafloroetilen (PTFE) astarlı (septum) bir delikli vidalı kapakla kapatın. Malzeme, elyafın numuneye temas etmemesi için flakon tepesinden en az 2 ila 3 cm uzakta olmalıdır.
   4. Sistem kirleticilerini tanımlamak veya SPME liflerinin tekrarlanan kullanımından kaynaklanan taşınma olmadığını doğrulamak için boş şişelerden numune alarak SPME liflerini kullanarak eş zamanlı olarak kontrol deneyleri gerçekleştirin.
   5. Atmosfer dengesi için uçucu maddeler toplanmadan önce çam malzemesini şişenin içinde 1 saat tutun.
      NOT: SPME ile yapılan tahliller, şişeleri bir destek rafına yerleştirerek ve bunları bir Benmari banyosuna yerleştirerek oda sıcaklığında veya ayarlanabilir bir sıcaklıkta çalıştırılabilir.
   6. Septum delici iğnenin derinliğini, septumu delmek için SPME tutucusundan ayarlayın, ancak lif açığa çıktığında malzeme ile temas etmeyecek şekilde ayarlayın.
   7. Elyaf geri çekildikten sonra, tutucu iğneyi PTFE astardan geçirin. Elyafı ortaya çıkarmak için pistonu aşağı doğru itin. Pistonu saat yönünde çevirin ve tespit vidasını Z yuvasının²⁴ yatay sol tarafında tutun. Elyafı 1 saat açığa çıkarın.
   8. Piston Z yuvasının üst kısmına ulaşana kadar pistonu saat yönünün tersine çevirerek elyafı geri çekin. Toplanan uçucular artık GC ve/veya GC-MS doğrudan analizi için hazırdır.
      NOT: Gerekirse, lifler analizden önce oda sıcaklığında, ancak bir haftadan uzun süre saklanamaz.
4. Paketlenmiş tüplerle üst boşluk yakalama
   1. A) bir kütle akış pompalama sistemi, b) PTFE boru, c) aktif karbon hava filtreleri, d) gözenekli reçine polimer dolgulu tüpler ve e) cam eşya veya polietilen tereftalat (PET) torbalar (pişirme torbaları) (Şekil 4D)²⁵.
   2. Baş boşluğu uçucularını biriktirmek için çam malzemesini kapalı cam eşyalarda veya PET torbaların içinde saklayın.
      NOT: Yaygın plastikten gelen uçucu maddelerin bol miktarda bulunduğunu ve GC-MS aracılığıyla büyük miktarlarda tespit edilebileceğini unutmayın.
   3. Kapalı döngü sistemi için devreyi aşağıdaki gibi bağlayın: a) pompa çıkışını PTFE borusuna, b) PTFE borusunu aktif karbon hava filtrelerine, c) hava filtrelerinden cam eşyalara veya çam malzemeli PET torbalara bağlanan ek borulara, d) paketlenmiş tüpü cam eşyaya veya PET torba çıkışına, e) paslanmaz çelik boru çıkışından kütle akış pompası girişine²² ek PTFE boru.
      NOT: Gözenekli polimer dolgulu paslanmaz çelik borular, kullanımdan önce üreticinin tavsiyelerine göre, örneğin 100 °C'de 15 dakikaya kadar Termal Desorpsiyon ünitesinde termal olarak şartlandırılmalıdır. Tüplerin saygı duyulması gereken bir akış yönüne sahip olduğuna dikkat edin.
   4. Filtrelenmiş hava miktarını ve hızını kontrol etmek için kütle akış pompasını kullanarak çam sisteminden dakikada 0,6 L hızla 100 L filtrelenmiş hava pompalayarak uçucu maddeleri toplayın.
      NOT: Kolondan akan üst boşluk havasının miktarı ve/veya akışı, sıkışan uçucuların miktarını ve ardından elde edilen kromatogramı etkileyebilir.
   5. Uçucu maddeler toplandıktan sonra, paketlenmiş tüpleri her iki uçta hava geçirmez saklama kapaklarıyla kapatın. Oda sıcaklığında saklayın (en fazla 1 hafta) ve uçucu maddeler bozulabileceğinden veya kaçabileceğinden mümkün olan en kısa sürede analiz edin.
   6. Yıkamak için tüm PTFE boruları ve cam eşyaları %70 etanol ile durulayın ve 230 °C'de bir fırında en az 2 saat²⁵ ısıtın.

6. Uçucu profillerin analizi

1. Önceden tanımlanmış uçucuların miktar tayini için gaz kromatografisi-kütle spektrometresi (GC-MS) veya rutin olarak alev iyonizasyon algılamalı gaz kromatografisi (GC-FID) yoluyla uçucu profillerin analizini gerçekleştirin.
   NOT: GC-FID ve GC-MS tarafından yapılan analiz yöntemlerinin tanımı kapsamlıdır ve bu çalışmanın amacının ötesindedir. Okuyucuya, bireysel bileşenlerin nicelleştirilmesine ilişkin ilgili çalışma koşullarını ve iki analitik yöntemin karşılaştırılmasına ilişkin literatür verilerini sağlayan ISO^{7609 26} gibi laboratuvar içi prosedürleri veya standartları kullanması tavsiye edilir²⁷.
2. Saf veya bir çözücü içinde taşınan analitler, örneğin n-pentan veya n-heksan, ve doğrudan bir elyafa enjekte edilen veya adsorbe edilen, örneğin SPME ve doğrudan kromatograf enjektörüne veya GC ünitesine bağlı bir Termal Desorpsiyon (TD) ünitesi kullanılarak desorbe edilen analitler.
   NOT: Daha yüksek hassasiyetlerine, daha yüksek çözünürlüklerine ve daha kısa analiz sürelerine rağmen, kılcal kolonlar düşük numune kapasitesine sahiptir. Bu nedenle, hemen hemen tüm çalışma koşulları benzer olabilse de, analit tipi (saf, çözücü içinde, SPME, vb.) farklı bölme / bölme daha az enjeksiyon prosedürleri gerektirebilir.
3. ISO 7609'a göre değerlendirilen tutma indekslerini, bileşenin kimliği RI, GC-MS ve ¹³C-NMR tarafından belirlenen referans numuneler, laboratuvarda sentezlenmiş ve izole edilmiş bileşikler ve ticari olarak mevcut standartlar veya bunların yokluğunda ticari olarak mevcut kütle spektrumu kütüphaneleri kullanılarak laboratuvarda oluşturulan bir kütüphaneden GC-MS spektrumları ile karşılaştırarak uçucu bileşenlerin tanımlanmasını gerçekleştirin.
4. Sonuçları, grafiksel bir gösterim (kromatogram) ve numunede tanımlanan tüm bileşiklerin nispi miktarlarını, kullanılan uygun sütundaki tutma indeksleri ile gösterilen elüsyon sıraları ile listeleyen bir kromatografik profil kullanarak ifade edin.
5. Çok sayıda numune için, numune düzenlemesinin yorumlanması için kimyasal bileşime dayalı uygun bir istatistiksel analiz değerlendirmesi yapın (gruplamalar ve/veya ayırmalar).

Sonuçlar

PWN, optimum koşullar altında hızlı bir şekilde çoğalır ve üretim süreleri 4 gün kadar düşük olabilir, her dişi yaşamı boyunca yaklaşık 80 yumurta bırakır²⁸. Yukarıda açıklanan metodolojiyi kullanarak, mantar büyümesine bağlı olarak büyük miktarlarda PWN elde edilebilir. 8 günlük bir büyüme periyodu içinde, PWN'ler nüfus sayılarında 100 kat artışa sahip olabilir (Şekil 1). PWN miktarlarındaki ...

Tartışmalar

Burada sunulan protokol, çevresel ve genetik değişkenliğin azaldığı ve sonuçları etkilemediği, PWN tarafından enfekte olmuş deniz çamındaki uçucu bileşikleri analiz etmek için gelişmiş bir metodolojinin ana hatlarını çizmektedir. Saf in vitro deniz çamı genotiplerinin hatları kullanılarak, ekstrakte edilen ve yayılan uçucular, çam ormanlarına yönelik en zararlı biyotik tehditlerden birine karşı bir konakçı yanıtı olarak analiz edilebilir.

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
38 mesh test sieve	Retsch	60.131.000038
6-Benzylaminopurine (6-BAP)	Duchefa Biochemie	B0904
Charcoal activated	Duchefa Biochemie	C1302
Clevenger apparatus	WINZER Laborglastechnik	25-000-02
Hydrogen peroxide solution	Sigma-Aldrich	H1009-500ML
Indole-3-butyric acid (IBA)	Duchefa Biochemie	I0902
Likens-Nickerson apparatus	VitriLab LDA.	c/IN29/32
Microbox round containers	Sac O2	O118/80+OD118
n-Pentane	Sigma-Aldrich	1.00882
PARAFILM M sealing film	BRAND	HS234526B-1EA
Phyto agar	Duchefa Biochemie	P1003
Potato Dextrose Agar	BD DIFCO	213400
Scalpel blade no. 24	Romed Holland	BLADE24
Schenk & Hildebrandt Basal salt medium	Duchefa Biochemie	S0225
Schenk & Hildebrandt vitamin mixture	Duchefa Biochemie	S0411
SPME fiber assembly Polydimethylsiloxane (PDMS)	Supelco	57300-U
SPME Fiber Holder	Supelco	57330-U
Sucrose	Duchefa Biochemie	S0809
Tenax TA- stainless steel tubes- conditioned + capped	Markes International	C1-AAXX-5003