İn Vivo ve İn Vitro Çamların Çam Ağacı Nematodu Bursaphelenchus xylophilus ile Enfeksiyonu ve İndüklenen Uçucuların İzolasyonu

Özet

Protokol, Pinus pinaster'ın in vivo ve in vitro çam ağacı nematod enfeksiyonunu ve bunların Gaz Kromatografisi (GC) ve Kütle Spektrometresine (GC-MS) bağlı GC yoluyla uçucu analizini açıklar.

Özet

Çam ağacı nematodu (PWN), kozalaklı türlerde çam solgunluğu hastalığına (PWD) neden olan bir fitoparazittir. Bu bitki paraziti nematod, Asya ülkelerinde, örneğin Japonya, Çin ve Kore'de çam ormansızlaşmasına büyük ölçüde katkıda bulunmuştur. Son yirmi yılda, Avrupa'da, Portekiz ve İspanya büyük ölçüde etkilendi. Duyarlı konukçu türlerde PWN enfeksiyonu ve/veya PWD ilerlemesi mekanizmaları üzerine yapılan araştırmalar, çam fidelerinin sera koşullarında kontrollü enfeksiyonuna dayanmaktadır. Bu teknik zahmetlidir ve önemli ekonomik ve insan kaynaklarını harekete geçirir. Ek olarak, bazı çam türleriyle ilişkili genetik çeşitlilikten ve aynı zamanda dış faktörlerin müdahalesinden kaynaklanan değişkenliğe eğilimli olabilir. Alternatif olarak, PWN'lerle in vitro çam ko-kültürleri, a) tek çevresel veya besinsel değişkenlerin kontrol edilmesine izin verdikleri, b) daha az yer kapladıkları, c) elde etmek için daha az zaman gerektirdikleri ve d) kontaminasyondan veya konakçı genetik varyasyonundan arınmış oldukları için biyokimyasal değişiklikleri incelemek için daha avantajlı bir sistem sunar. Aşağıdaki protokol, deniz çamı Pinus pinaster'ın standart in vivo PWN enfeksiyonunu ve çam uçucu maddeleri üzerindeki bu fitoparazit etkisini incelemek için geliştirilmiş bir metodoloji olarak PWN ile çam sürgünlerinin yeni in vitro ko-kültürlerinin kurulmasını detaylandırmaktadır. PWN ile indüklenen uçucular, hidrodamıtma ve damıtma-ekstraksiyon yoluyla in vivo ve in vitro enfekte olmuş çamlardan ekstrakte edilir ve yayılan uçucular, elyaf veya paketlenmiş kolon teknikleri kullanılarak katı faz mikroekstraksiyonu (SPME) ile yakalanır.

Giriş

Çam ağacı nematodu (PWN), Bursaphelenchus xylophilus (Steiner ve Bührer 1934) Nickle 1970, esas olarak Pinus türlerini parazitleştiren bir bitki paraziti nematoddur. Bu fitoparazit, Monochamus cinsinin böcekleri tarafından, böceğin olgunlaşma beslemesi sırasında hassas çam türlerinin ağaçlarına vektörlenir. PWN, reçine kanallarına saldırarak ve reçine akışını azaltarak ve damar dokusuna zarar vererek su sütununda kesintilere neden olarak ağacı öldürür. Ağaç gölgesindeki su eksikliği, çam solgunluğu hastalığının (PWD) ilk görünür semptomlarına neden olur, yani çam iğneleri, fotosentezin kesilmesinden ve kurum....

Protokol

1. Büyüyen in vitro çam ağacı nematodu

NOT: Çam ağacı nematodları, Botrytis cinerea (de Bary) Whetzel^11'in spor yapmayan bir türünün mantar miselyumu ile beslenerek yetiştirilir.

1. Rutin alt kültür için, mantar kolonisinin en dış sınırından bir kültür tıkacını (0,5 cm çapında) bir steril patates dekstroz agar (PDA) tabağına aktarın ve 7 ila 10 gün boyunca 25 ± 1 ° C'de tutun veya mantar kolonisi plakanın kenarına ulaşana kadar.
   NOT: Mantar büyümesi için diğer genel mantar büyüme ortamı türleri kullanılabilir.
2. Daha fazla....

Tartışmalar

Burada sunulan protokol, çevresel ve genetik değişkenliğin azaldığı ve sonuçları etkilemediği, PWN tarafından enfekte olmuş deniz çamındaki uçucu bileşikleri analiz etmek için gelişmiş bir metodolojinin ana hatlarını çizmektedir. Saf in vitro deniz çamı genotiplerinin hatları kullanılarak, ekstrakte edilen ve yayılan uçucular, çam ormanlarına yönelik en zararlı biyotik tehditlerden birine karşı bir konakçı yanıtı olarak analiz edilebilir.

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
38 mesh test sieve	Retsch	60.131.000038
6-Benzylaminopurine (6-BAP)	Duchefa Biochemie	B0904
Charcoal activated	Duchefa Biochemie	C1302
Clevenger apparatus	WINZER Laborglastechnik	25-000-02
Hydrogen peroxide solution	Sigma-Aldrich	H1009-500ML
Indole-3-butyric acid (IBA)	Duchefa Biochemie	I0902
Likens-Nickerson apparatus	VitriLab LDA.	c/IN29/32
Microbox round containers	Sac O2	O118/80+OD118
n-Pentane	Sigma-Aldrich	1.00882
PARAFILM M sealing film	BRAND	HS234526B-1EA
Phyto agar	Duchefa Biochemie	P1003
Potato Dextrose Agar	BD DIFCO	213400
Scalpel blade no. 24	Romed Holland	BLADE24
Schenk & Hildebrandt Basal salt medium	Duchefa Biochemie	S0225
Schenk & Hildebrandt vitamin mixture	Duchefa Biochemie	S0411
SPME fiber assembly Polydimethylsiloxane (PDMS)	Supelco	57300-U
SPME Fiber Holder	Supelco	57330-U
Sucrose	Duchefa Biochemie	S0809
Tenax TA- stainless steel tubes- conditioned + capped	Markes International	C1-AAXX-5003