זיהום של In Vivo ו- In Vitro Pines עם נמטודת עץ האורן Bursaphelenchus xylophilus ובידוד של נדיפים מושרים

Summary

הפרוטוקול מתאר את זיהום הנמטודות in vivo ו - in vitro pinewood של Pinus pinaster ואת הניתוח הנדיף שלהם באמצעות כרומטוגרפיית גז (GC) ו- GC המצומדים לספקטרומטריית מסה (GC-MS).

Abstract

נמטודת עץ האורן (PWN) היא פיטופרזיט הגורם למחלת נבילת האורן (PWD) במינים של עצי מחט. צמח זה נמטודה טפילית תרם רבות לכריתת יערות אורנים במדינות אסיה, כגון יפן, סין וקוריאה. במהלך שני העשורים האחרונים, באירופה, פורטוגל וספרד הושפעו מאוד. המחקר על מנגנוני ההדבקה של PWN ו/או התקדמות PWD במינים פונדקאים רגישים מסתמך על זיהום מבוקר של שתילי אורן בתנאי חממה. טכניקה זו מייגעת ומגייסת משאבים כלכליים ואנושיים משמעותיים. בנוסף, הוא יכול להיות מועד לשונות הנובעת מהמגוון הגנטי הקשור לכמה מיני אורנים, אך גם מהתערבות של גורמים חיצוניים. כחלופה, תרביות מבחנה של אורן עם PWN מציעות מערכת מועילה יותר לחקר שינויים ביוכימיים מכיוון שהן א) מאפשרות שליטה במשתנים סביבתיים או תזונתיים בודדים, ב) תופסות פחות מקום, ג) דורשות פחות זמן להשגה, ד) נקיות מזיהום או משונות גנטית של המאכסן. הפרוטוקול הבא מפרט את הזיהום הסטנדרטי in vivo PWN של Pinus pinaster, האורן הימי, ואת ביסוס התרביות המבחנה החדשניות של נבטי אורן עם PWN כמתודולוגיה משופרת לחקר השפעת פיטופרזיט זה על נדיפים אורנים. נדיפים הנגרמים על ידי PWN מופקים מאורנים נגועים in vivo ו - in vitro על ידי זיקוק הידרודיג ומיצוי זיקוק, והנדיפים הנפלטים נלכדים על ידי מיקרומיצוי שלב מוצק (SPME), תוך שימוש בטכניקות סיבים או עמודות ארוזות.

Introduction

נמטודת עץ אורן (שם מדעי: Bursaphelenchus xylophilus ; Steiner & Bührer 1934) Nickle 1970, היא נמטודה טפילית צמחית המטפילה בעיקר על מיני פינוס . פיטופרזיט זה עובר וקטור על ידי חרקים מהסוג Monochamus לעצים של מיני אורן רגישים במהלך האכלת ההבשלה של החרק. ה-PWN הורג את העץ על ידי תקיפת תעלות השרף שלו והפחתת זרימת השרף, ועל ידי פגיעה ברקמת כלי הדם שלו, מה שגורם להפרעות בעמודת המים. מחסור במים בחופת העץ גורם לתסמינים הראשונים הנראים לעין של מחלת נבילת האורן (PWD), כלומר, מחטי האורן הופכות לכלורוטיות לאחר הפסקת הפוטוסינתזה וצניחה עקב התייבשות. אורן בדרך כלל מגיב לעקה ביוטית וא-ביוטית באמצעות ייצור שרף ותרכובות נדיפ....

Protocol

1. גידול נמטודה במבחנה של עץ אורן

הערה: נמטודות עץ אורן גדלות על ידי האכלה על תפטיר פטרייתי של זן לא נבג של Botrytis cinerea (de Bary) Whetzel¹¹.

1. עבור תת-תרבית שגרתית, מעבירים פקק תרבית (בקוטר 0.5 ס"מ) מהגבול החיצוני ביותר של מושבת הפטריות לצלחת של אגר דקסטרוז תפוחי אדמה סטרילי (PDA) ושומרים על 25 ± 1 מעלות צלזיוס במשך 7 עד 10 ימים, או עד שמושבת הפטריות מגיעה לקצה הצלחת.
   הערה: סוגים אחרים של מדיום גידול פטרייתי כללי יכולים לשמש לצמיחה פטרייתית.
2. כדי להשיג כמויות גדולות יותר של PWNs, השתמש ב- B. cinerea שגדל

תוצאות

ה-PWN מתרבה במהירות בתנאים אופטימליים, וזמני הייצור יכולים להגיע ל-4 ימים, כאשר כל נקבה מטילה כ-80 ביצים במהלך חייה²⁸. באמצעות המתודולוגיה המתוארת לעיל, כמויות גדולות של PWN ניתן להשיג בהתאם לצמיחה פטרייתית. בתוך תקופת גידול של 8 ימים, PWN יכולים לגדול פי 100 במספר האו?.......

Discussion

הפרוטוקול המוצג כאן מתווה מתודולוגיה משופרת לניתוח תרכובות נדיפות באורן ימי הנגוע ב- PWN, כאשר השונות הסביבתית והגנטית מופחתת ואינה משפיעה על התוצאות. באמצעות קווים טהורים של גנוטיפים של אורן ימי במבחנה , ניתן לנתח נדיפים שחולצו ונפלטו כתגובה מארחת לאחד האיומים הביו.......

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
38 mesh test sieve	Retsch	60.131.000038
6-Benzylaminopurine (6-BAP)	Duchefa Biochemie	B0904
Charcoal activated	Duchefa Biochemie	C1302
Clevenger apparatus	WINZER Laborglastechnik	25-000-02
Hydrogen peroxide solution	Sigma-Aldrich	H1009-500ML
Indole-3-butyric acid (IBA)	Duchefa Biochemie	I0902
Likens-Nickerson apparatus	VitriLab LDA.	c/IN29/32
Microbox round containers	Sac O2	O118/80+OD118
n-Pentane	Sigma-Aldrich	1.00882
PARAFILM M sealing film	BRAND	HS234526B-1EA
Phyto agar	Duchefa Biochemie	P1003
Potato Dextrose Agar	BD DIFCO	213400
Scalpel blade no. 24	Romed Holland	BLADE24
Schenk & Hildebrandt Basal salt medium	Duchefa Biochemie	S0225
Schenk & Hildebrandt vitamin mixture	Duchefa Biochemie	S0411
SPME fiber assembly Polydimethylsiloxane (PDMS)	Supelco	57300-U
SPME Fiber Holder	Supelco	57330-U
Sucrose	Duchefa Biochemie	S0809
Tenax TA- stainless steel tubes- conditioned + capped	Markes International	C1-AAXX-5003