JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • תוצאות
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

הפרוטוקול מתאר את זיהום הנמטודות in vivo ו - in vitro pinewood של Pinus pinaster ואת הניתוח הנדיף שלהם באמצעות כרומטוגרפיית גז (GC) ו- GC המצומדים לספקטרומטריית מסה (GC-MS).

Abstract

נמטודת עץ האורן (PWN) היא פיטופרזיט הגורם למחלת נבילת האורן (PWD) במינים של עצי מחט. צמח זה נמטודה טפילית תרם רבות לכריתת יערות אורנים במדינות אסיה, כגון יפן, סין וקוריאה. במהלך שני העשורים האחרונים, באירופה, פורטוגל וספרד הושפעו מאוד. המחקר על מנגנוני ההדבקה של PWN ו/או התקדמות PWD במינים פונדקאים רגישים מסתמך על זיהום מבוקר של שתילי אורן בתנאי חממה. טכניקה זו מייגעת ומגייסת משאבים כלכליים ואנושיים משמעותיים. בנוסף, הוא יכול להיות מועד לשונות הנובעת מהמגוון הגנטי הקשור לכמה מיני אורנים, אך גם מהתערבות של גורמים חיצוניים. כחלופה, תרביות מבחנה של אורן עם PWN מציעות מערכת מועילה יותר לחקר שינויים ביוכימיים מכיוון שהן א) מאפשרות שליטה במשתנים סביבתיים או תזונתיים בודדים, ב) תופסות פחות מקום, ג) דורשות פחות זמן להשגה, ד) נקיות מזיהום או משונות גנטית של המאכסן. הפרוטוקול הבא מפרט את הזיהום הסטנדרטי in vivo PWN של Pinus pinaster, האורן הימי, ואת ביסוס התרביות המבחנה החדשניות של נבטי אורן עם PWN כמתודולוגיה משופרת לחקר השפעת פיטופרזיט זה על נדיפים אורנים. נדיפים הנגרמים על ידי PWN מופקים מאורנים נגועים in vivo ו - in vitro על ידי זיקוק הידרודיג ומיצוי זיקוק, והנדיפים הנפלטים נלכדים על ידי מיקרומיצוי שלב מוצק (SPME), תוך שימוש בטכניקות סיבים או עמודות ארוזות.

Introduction

נמטודת עץ אורן (שם מדעי: Bursaphelenchus xylophilus ; Steiner & Bührer 1934) Nickle 1970, היא נמטודה טפילית צמחית המטפילה בעיקר על מיני פינוס . פיטופרזיט זה עובר וקטור על ידי חרקים מהסוג Monochamus לעצים של מיני אורן רגישים במהלך האכלת ההבשלה של החרק. ה-PWN הורג את העץ על ידי תקיפת תעלות השרף שלו והפחתת זרימת השרף, ועל ידי פגיעה ברקמת כלי הדם שלו, מה שגורם להפרעות בעמודת המים. מחסור במים בחופת העץ גורם לתסמינים הראשונים הנראים לעין של מחלת נבילת האורן (PWD), כלומר, מחטי האורן הופכות לכלורוטיות לאחר הפסקת הפוטוסינתזה וצניחה עקב התייבשות. אורן בדרך כלל מגיב לעקה ביוטית וא-ביוטית באמצעות ייצור שרף ותרכובות נדיפות1. לכן, הבנת מנגנוני ההגנה של אורן חשובה כדי לקבוע את ההשפעות הספציפיות של התקפות PWN ולמצוא שיטות חלופיות להדברה2.

כיום, ניסויים בתנאי שדה תלויים בזמינות של אורנים נגועים, אישור זיהום PWN, ותנאים סביבתיים משתנים. בתנאי חממה, ניתן לשלוט בפרמטרים אלה ביתר קלות; עם זאת, המגוון הגנטי של הפונדקאי הופך למקור חזק של שונות3. לדוגמה, במחקר על תגובת ההתנגדות של Pinus pinaster, הייצור של לימונן טרפן וחומצות שרף היה קשור עם זיהום PWN4. עם זאת, בשל מספר הדגימות הקטן והשונות בתנאים טבעיים, נרשמו שינויים הניתנים לזיהוי רק עבור מחצית הדגימות. במחקר אחר שהשתמש בשתילי אורן שגודלו בחממה, למרות שתנאי הסביבה נשלטו בקלות רבה יותר, המגוון הגנטי הטבעי של האורן גרם לשונות גדולה בנדיפים שחולצו5. מכיוון שנדיפים של אורן הנגרמים על ידי מחלות יכולים להיות מושפעים מאוד משונות סביבתית וגנטית, פנייה לתרביות יורה חוץ גופיות היא חלופה טובה למחקרים על התגובה הכימית והביוכימית של רקמת אורן לזיהום PWN 5,6. על ידי הפצת גנוטיפ של צמח במבחנה, המטען הגנטי שלו יכול להישמר ולשכפל ללא הגבלת זמן, מה שמוביל לביסוס כמות גדולה יותר של פרטים זהים גנטית בפחות מקום ובזמן קצר יותר מאשר בתנאי in vivo. תרבויות אלה הן מערכת עבודה פשוטה בתנאים תזונתיים וסביבתיים קלים למניפולציה, ולכן הם מציעים יתרונות נוספים למערכות קונבנציונליות בהערכת הייצור והפליטה של נדיפים 7,8. מערכות אלה מועילות במיוחד למחקר במינים עציים, אשר לרוב דורשים משאבים ניכרים, כלומר, עצי מטרה ממוקמים לעיתים באתרים קשים להשגה, דורשים ציוד יקר, כוח אדם ייעודי ופרקי זמן ארוכים יותר של ניתוח8. במבחנה, תרביות מבחנה של אורנים עם PWN מאפשרות להעריך אינטראקציות מטבוליות בין הנמטודה לצמח בשלבים שונים9. עבור ניתוח של נדיפים, זה חשוב מאוד מאז טכניקות פרופיל הפכו מדויקים מאוד, ושינויים זעירים בדגימה יכול לגרום לשינויים משמעותיים פרופילים נדיפים. כרומטוגרפיית גז בשילוב ספקטרומטריית מסות (GC-MS) היא טכניקה רבת עוצמה לניתוח נדיפים ומאפשרת פרופיל מהיר ויעיל של נדיפים10. הפרוטוקול המוצג כאן מתאר טכניקות להדבקה של שתילי אורן in vivo בתנאי חממה ותרביות יורה במבחנה של אורנים זהים גנטית המותאמים למיצוי ופרופיל של נדיפים מושרים.

Protocol

1. גידול נמטודה במבחנה של עץ אורן

הערה: נמטודות עץ אורן גדלות על ידי האכלה על תפטיר פטרייתי של זן לא נבג של Botrytis cinerea (de Bary) Whetzel11.

  1. עבור תת-תרבית שגרתית, מעבירים פקק תרבית (בקוטר 0.5 ס"מ) מהגבול החיצוני ביותר של מושבת הפטריות לצלחת של אגר דקסטרוז תפוחי אדמה סטרילי (PDA) ושומרים על 25 ± 1 מעלות צלזיוס במשך 7 עד 10 ימים, או עד שמושבת הפטריות מגיעה לקצה הצלחת.
    הערה: סוגים אחרים של מדיום גידול פטרייתי כללי יכולים לשמש לצמיחה פטרייתית.
  2. כדי להשיג כמויות גדולות יותר של PWNs, השתמש ב- B. cinerea שגדל במבחנה על גרגרי שעורה אורגניים מאושרים מעוקרים בקיטור (Hordeum vulgare L). מוסיפים 15 גרם דגנים ל-15 מ"ל מים טהורים במיוחד, בצלוחיות ארלנמאייר רחבות צוואר מכוסות 250 מ"ל ומעקרים. לאחר מכן, יש לחסן עם תקע תרבית B. cinerea ולשמור על 25 ± 1 °C במשך 7 עד 10 ימים או עד פני השטח של הדגנים הוא התיישב במלואו12.
    הערה: ניתן לבקש נמטודות למטרות מחקר ממעבדות ייחוס לאומיות לנמטודות טפיליות צמחיות.
  3. התחילו תרביות PWN על-ידי חיסון תרביות B. cinerea in vitro בתרחיף מימי PWN (המכיל מינימום של 20 זכרים ו-30 נקבות) ושמרו בחושך בתנאים שתוארו קודם לכן, במשך 7 עד 10 ימים או עד שמושבת הפטריות נאכלת לחלוטין ואוכלוסיית PWN מתחילה לטפס על קירות הצלחת או הבקבוק (איור 1). אטמו את הצלחות או הצלוחיות בסרט פלסטיק כדי למנוע התייבשות.
    הערה: ניתן להבחין בין נקבות על ידי דש הפות, שק פוסט-רחמי ארוך וקצה זנב עגול בדרך כלל; לזכרים יש קצה זנב מחודד מעוקל גחון עם קוצים אופייניים13. בעת ביצוע מתלי PWN, יש לפשט את מושבת הפטריות כך שתרחיף ה-PWN לא ייצור טיפות על פני השטח הפטרייתיים, ולוכד את ה-PWN דרך מתח פני השטח.
  4. בודדו PWN על ידי שטיפת דפנות הבקבוק במי ברז, שפיכת התוכן על מגבת נייר במשפך או מגש של Baermann, וטבילה במים14. לאחר 24 עד 48 שעות, הנמטודות החיות היו עוברות מהחומר הנגוע למים. לשחזר אותם על ידי מסננת באמצעות מסננת רשת 38 מיקרומטר15. שטפו את ה-PWN שהצטברו לתוך מיכל עם מי ברז.
    הערה: כל חומר שבא במגע עם PWN חייב להיות מטוהר כראוי מכיוון שהוא אורגניזם הסגר; טבילה באתנול במשך 10 עד 20 דקות היא בדרך כלל מספיק. מתלים מימיים שנדחו חייבים להיות מעוקרים או מחוממים ל -60 מעלות צלזיוס למשך 35 דקות לפחות.
  5. השתמש בתרחיף המימי המכיל את PWN באופן מיידי או שמור אותו על 11 ° C לתקופת אחסון ארוכה יותר (עד חודשיים).

2. עיקור נמטודות עץ אורן מעורבות בשלב החיים

  1. במכסה מנוע זרימה, פיפטה נפח של מתלה PWN המכיל כ 5000 PWN לתוך מסננת רשת סטרילית 38 מיקרומטר ולשטוף עם מים סטריליים.
    הערה: ספירת נמטודות תחת מיקרוסקופ דו-עיני (40x).
  2. טבלו את החצי התחתון של המסננת המכילה את PWN בתמיסת 20% מי חמצן (H2O2), וערבבו ידנית במשך 15 דקות.
  3. שטפו את ה-PWN הסטריליים על ידי חלוקת מים סטריליים דרך המסננת. חזור על שלב זה 3x. בשטיפה האחרונה הטו את המסננת כך ש-PWN ייאספו בגבול המסננת. לשחזר את תרחיף הנמטודות הסטרילי על ידי pipetting 1 מ"ל של מים סטריליים בגבול המסננת, ולאחסן ב 11 ° C או להשתמש מיד.
    הערה: ניתן להעריך את הצלחת העיקור על ידי ציפוי aliquot של 100 μL של תרחיף PWN בתווך PDA וניטור קבוע של זיהומים במשך כשבוע.

3. זיהום של invivo Pinus pinaster שתילים

הערה: ניסויי חיסון מבוצעים בשתילי P. pinaster בני ≥ שנתיים. ניתן לרכוש עצים מקמעונאים מסחריים מוסמכים, אך ניתן גם לגדל אותם בחממה מזרעים מאושרים.

  1. השג חיסון PWN כמתואר בשלב 1 והגדר את המתלים של PWN מעורבים בשלב החיים ל- 1000 PWNs/mL על ידי הוספת מים לתרחיף או המתנה לנמטודות לשקוע (כ- 60 דקות) והנמכת הנפח על ידי ניקוז המים העיליים. בצע ספירה בטמפרטורת החדר במגלשה קעורה מתחת למיקרוסקופ הדו-עיני במהירות של 40x.
  2. כדי להתחיל חיסון, יש להסיר ידנית מחטים מקטע מתחת ל-5 הס"מ העליונים של גזע האורן ולבצע חתך אורכי שטחי (0.5 עד 1 ס"מ אורך) עם אזמל מעוקר16.
    הערה: החתך מבוצע כדי לתת לנמטודה גישה לרקמות האורן הפנימיות.
  3. באזור הפציעה, הניחו פיסת כותנה מעוקרת כדי להחזיק 0.5 מ"ל של מתלה PWN pipetted וקבעו אותו עם רצועה שקופה כדי לשמור על לחות.
    הערה: ערבבו במרץ את תרחיף PWN בין כל חיסון מכיוון שנמטודות ישקעו במהירות. אם התרחיף מתייבש באתר החיסון, זיהום נמטודה יכול להיות לא מוצלח, אז לכסות את כותנה לחה כראוי.
  4. לשליטה אורנים להחליף את מתלה PWN עם מים סטריליים.
  5. עקוב אחר התקדמות PWD באופן קבוע וציון סימפטומטולוגיה על ידי כימות אחוז המחטים הדהויות והנבולות. ציון 0 ללא תסמינים חיצוניים, 1 עבור עד 25% שינוי צבע מחט, 2 עבור בין 25% ל-50% משינוי צבע המחטים, 3 עבור 50% עד 75% משינוי צבע המחטים, ו-4 עבור אורנים עם מחטים חומות לחלוטין (איור 2).
  6. לשמור על החממה בתנאי לחות (60%-80%) ומים לעתים קרובות (לשמור על 70% מקיבולת אחיזת המים המקסימלית של הקרקע), הימנעות מטמפרטורות קיצוניות מכיוון שנמטודות הופכות ללא פעילות מטבולית מתחת ל -10 מעלות צלזיוס וההתפתחות יכולה להיות מושפעת מעל 30 מעלות צלזיוס.
  7. ב 20 ימים לאחר החיסון, לקצור חומר צמחי עבור מיצוי נדיף על ידי חיתוך שתילים בבסיס הגבעול והקפאה (-20 ° C) בשקיות נייר חום. עבור נדיפים הנפלטים (סיבי SMPE או צינורות ארוזים), דגמו שתילי אורן מיד, בטמפרטורת החדר 5,17.

4. הקמה והדבקה של תרביות יורה אורן במבחנה

  1. לפני עיקור פני השטח, שטפו זרעי P. pinaster מאושרים במי ברז זורמים כדי להסיר את הפסולת הגדולה ביותר, ולאחר מכן בתמיסת דטרגנט נפוצה (טיפה אחת לכל 40 מ"ל מים), עם תסיסה נמרצת, כדי לשטוף את הפסולת העדינה יותר.
  2. במכסה מנוע זורם, מתחילים בעיקור פני השטח של הזרעים על ידי הוספת תמיסת אקונומיקה מסחרית (1:4, אקונומיקה מסחרית במי ברז) עד לכיסוי הזרעים השטופים, ומערבבים במרץ במשך 15 דקות. יש להשליך את תמיסת האקונומיקה ולשטוף את הזרעים 3 פעמים במי ברז מעוקרים.
  3. לטבול את הזרעים בתמיסת אתנול (80%, v/v) במשך 15 דקות עם תסיסה נמרצת, להיפטר אתנול, ולשטוף 3x עם מים מעוקרים טהורים במיוחד.
  4. לנביטת אורנים, שברו את מעילי הזרעים המעוקרים עם מחרטה מכנית סטרילית במכסה מנוע זרימה, בודדו את הצנוברים והניחו אותם במיכל סגור עם נייר פילטר רטוב מעוקר כדי ללחלח את הצנוברים למשך הלילה6.
  5. לרבד צנוברים hydrated ב 4 ° C במשך 7 ימים, כדי לשבור תרדמה לסנכרן נביטה, ולאחר מכן לשמור בחושך ב 25 ° C עד הנביטה.
    הערה: שלב הריבוד הוא אופציונלי.
  6. מעבירים את האורנים הנבטים האספטיים, במיכל הסגור, לפוטופריוד אור של 16 שעות, בטמפרטורה של 24°C/18°C ושומרים למשך שבועיים או עד שהגבעול הראשי מתחיל להתפתח.
  7. במכסה המנוע חותכים את החלק האווירי של השתיל שמעל השורש בעזרת אזמל ומעבירים למדיום תרבית מעוקר של שנק והילדברנדט (SH)18 (pH=5.8) בתוספת 30 גרם/ליטר סוכרוז, 8 גרם/ליטר אגר, 0.5 מ"ג/ליטר 6-בנזילאמינופורין (BAP, ציטוקינין), ו-0.1 מ"ג/ליטר חומצה אינדול-3-בוטירית (IBA, אוקסין)6, כדי לגרום לכפל מיקרושוט. שמור את התרבויות בתנאים המתוארים לעיל בתא גידול תרבות חוץ גופית .
  8. במכסה המנוע של הזרימה, תת-תרבית מעת לעת (כ-4 שבועות) על ידי חיתוך רקמת היבלות בבסיס הנבטה (חלק במגע עם מדיום התרבית) עם אזמל סטרילי והעברת אשכול הנבטים עם פינצטה סטרילית למדיום תרבית כפל טרי.
  9. עבור התארכות מיקרוסטם, להעביר את microshoots למדיום תרבית SH שתואר לעיל אבל מכיל 3 גרם / ליטר של פחם פעיל במקום phytohormones.
    הערה: פחם פעיל סופח רעלים ומונע הצטברות יתר של פיטו-הורמונים על הרקמה החתוכה19.
  10. עבור זיהום PWN, להעביר נבטים מוארכים למדיום תרבית SH ללא phytohormones או פחם פעיל ולהוסיף 100-150 PWN מעוקרים מעורבים בשלב החיים בתחתית microshoot. שמרו על התנאים שתוארו לעיל עד שהתסמינים של PWD יתחילו להיות מורגשים (איור 3)6.
  11. כדי לקצור חומר צמחי למיצוי נדיפים, יש להשתמש מיד בצמחי מבחנה או להקפיא (-20°C) עד לניתוח. עבור נדיפים הנפלטים (סיבי SMPE או צינורות ארוזים), נתח מיד קופסאות מיקרושוט.

5. בידוד של תרכובות נדיפות

הערה: בידוד של נדיפים יכול להתבצע באמצעות מספר טכניקות. כאן, מיצוי נדיף נעשה על ידי זיקוק הידרודיסטיקציה, באמצעות מנגנון Clevenger20, זיקוק-מיצוי, באמצעות מכשיר Likens-Nickerson21, ולכידת נדיפים של headspace באמצעות microextraction פאזה מוצקה (SPME) באמצעות סיבים מצופים או צינורות ארוזים (סורבנט פולימר נקבובי)22.

  1. זיקוק הידרודיג
    1. השתמש מנגנון Clevenger לבידוד של שמנים אתריים. מערכת הזיקוק מורכבת מ-א) מכשיר Clevenger, ב) בקבוק בעל תחתית עגולה או Erlenmeyer להחזקת מים וחומר האורן, ג) ציוד חימום מתאים, ו-ד) מסגרת תמיכה להחזקת המערכת במקומה (איור 4A).
    2. יש לנקות היטב את כלי הזכוכית לפני השימוש. השתמש במהדקי מסגרת מעבדה כדי לאבטח את מכשיר Clevenger למסגרת הסריג. יש לקרר את המעבה של המערכת על ידי סירקולציית מים או להשתמש בסירקולטור מקורר אם זמין.
    3. רשמו את משקולת נבטי האורן והניחו אותה בבקבוק בעל תחתית עגולה או בארלנמאייר. התאימו את כמות המים כדי לוודא שהמיכל לא יותר מחצי מלא.
    4. מקמו את ציוד החימום מתחת לצלוחית, בדקו אם אין נזילות וודאו שכל חלקי המערכת נמצאים במיקום הנכון ומאובטחים למסגרת התמיכה.
      הערה: יש לנקות היטב, להסיר את השומן ולייבש את חלקי הזכוכית הטחונה של הקלבנגר והבקבוקון לפני החיבור. למטרה זו, להשתמש פיסת נייר מסנן מעט רטוב עם אצטון. אין להשתמש בגריז בחלקים אלה.
    5. הציגו מים דרך משפך המילוי, הממוקם בצינור האלכסוני החוזר בחלק האמצעי של מכשיר Clevenger. התאימו את מיקום הברז התלת-כיווני כך שמים יזרמו באופן שווה בשני הצינורות (האלכסוני והמדורג) עד למילוי הצלוחית, ממש לפני שהם זורמים מטה מהצינור האלכסוני החוזר לתוכו (ראו איור 4).
    6. הפעל את מקור החום וכוונן אותו כדי להביא את המים לרתיחה בקצב זיקוק של 2 - 3 מ"ל / דקה.
    7. התחל את זמן הזיקוק כאשר הטיפה הראשונה של מים מזוקקים נופלת בצינור המדורג בצד ימין של מכשיר Clevenger. זמן הזיקוק הממוצע הוא 3 שעות23, אך ניתן להשתמש בתקופות זיקוק קצרות או ארוכות יותר בהתאם לדרישות הספציפיות. שמנים אתריים נמצאים בדרך כלל בנוזל הסופרנאטנטי מכיוון שהם בדרך כלל קלים יותר מהמים הארומטיים המזוקקים שמתחתיו (הידרולט).
      זהירות: כאשר הזיקוק פועל, מכשיר Clevenger יהיה חם למגע.
    8. לאחר סיום זמן הזיקוק, עצרו את החימום ותנו לו לעמוד כ-10 דקות כדי לאפשר לזיקוק ולרתיחה להיפסק. לאחר 10 דקות, פתחו את הברז בכיוון השעון כדי לאפשר להידרולט לזרום החוצה עד שהשמן האתרי יגיע לחלק המדורג. קרא את נפח שמן אתרי מבודד. חשב את התשואה כ- mL/g (משקל טרי או יבש), מבוטא באחוזים (%, v/w).
    9. במקרה של שמנים אתריים עם נפח מתחת 0.05 מ"ל, הסיום הנמוך ביותר בצינור מדורג, התשואה לא ניתן לקבוע. כדי לשחזר את השמן האתרי, השתמש n-pentane מזוקק כדי לשטוף את מכשיר Clevenger.
    10. כדי לשחזר את השמן האתרי באמצעות n-פנטאן מזוקק, לאחר סיום הזיקוק, המתינו כ-10 עד 15 דקות ופתחו את הברז המשולש נגד כיוון השעון, כך שההידרולט יזרום החוצה מהצינור האלכסוני החוזר עד ממש מתחת למשפך המילוי. בעזרת טפטפת נקייה, הכניסו n-pentane מזוקק למשפך המילוי עד לצד השמאלי העליון של הצינור האלכסוני החוזר. הימנע מלגעת במשפך המילוי כדי למנוע זיהום צולב.
    11. עם בקבוק מים מזוקקים, להכניס מים למשפך המילוי. n-Pentane יזרום למטה אל בקבוק הזיקוק ויתאדה עם החום השיורי של מי המרתח. בדרך זו, הוא יעבור דרך המערכת, יתמוסס ויגרור את הנדיפים אל פני השטח של ההידרולט, בצינור המדורג. פתח את ההקשה התלת-כיוונית בכיוון השעון למקומה הרגיל.
    12. המשך כמו ב- 5.1.8. כדי לאסוף את השמן האתרי מומס N-Pentane.
    13. רכז את תערובת השמן האתרי וה-n-פנטאן לנפח מינימלי של כ-100 מיקרוליטר בטמפרטורת החדר תחת שטף חנקן באמצעות מערכת מאייד ניפוח. שמור אותו בטמפרטורה של -20°C עד לניתוח.
      הערה: אין להתרכז ליובש כדי למנוע אובדן של תרכובות נדיפות.
  2. זיקוק-מיצוי
    1. השתמש במכשיר Likens-Nickerson כדי לחלץ נדיפים מצמחים. מערכת הזיקוק-מיצוי מורכבת מ-א) מכשיר ליקנס-ניקרסון, ב) בקבוק בעל תחתית עגולה להחזקת מים וחומר אורן (זרוע צד ימין של יחידת הזיקוק), ואחר להחזקת ממס אורגני בלתי ניתן להפרעה, כגון n-פנטאן מזוקק (זרוע צד שמאל של יחידת הזיקוק), ג) שני מכשירי חימום מתאימים, ד) מעבה, ו-ה) מסגרת תמיכה להחזקת המערכת (איור 4B).
      הערה: השתמש ב-n-pentane מזוקק במעבדה כדי למנוע זיהום של הדגימה במייצבים שנוספו על-ידי ממס.
    2. התחילו בסירקולציה של מים במעבה המאובטח או השתמשו בסירקולטור מקורר אם זמין.
    3. השתמש במלחציים למסגרת מעבדה כדי לאבטח את יחידת הזיקוק-מיצוי למסגרת הסריג. העמיסו את הבקבוק בעל התחתית העגולה בחומר האורן שיש לחלץ והוסיפו מים לחצי קיבולת מלאה. הבקבוק הקטן יותר בעל תחתית עגולה של 100 מ"ל צריך להיות מלא למחצה של n-pentane מזוקק.
      הערה: לפני החיבור, יש לנקות היטב את חלקי החיבור בין זכוכית הקרקע של רכיבי הזכוכית, להסיר מהם שומנים ולייבש אותם. פיסת נייר פילטר שנרטבה לזמן קצר עם אצטון יכולה לשמש לניקוי.
    4. מקמו את מעטפת החימום מתחת לכל בקבוק. יש לוודא שאין נזילות ושכל רכיב במערכת ממוקם ומהודק כראוי למסגרת סריג המעבדה. הפעל את מקורות החום והתאם אותם לנקודות הרתיחה שלהם. המים צריכים להרתיח בקצב זיקוק של 2-3 מ"ל/דקה.
      זהירות: במהלך תהליך הזיקוק-מיצוי, מכשיר Likens-Nickerson יהיה חם למגע.
    5. לאחר סיום זמן הזיקוק, להפסיק את החימום מן הבקבוק עם חומר אורן ולאפשר n-pentane לזקק לבד במשך 10 דקות. לאחר ש-n-פנטאן משתנה לנוזל שקוף, יש להפסיק את החימום ולתת לו לעמוד למשך כ-10 דקות. שינוי הצבע מצביע על כך שהתזקיק נמצא כעת בבקבוק עם n-pentane.
    6. רכז את תמצית n-pentane בלחץ מופחת (70 - 73 מ"מ כספית) על מאייד סיבובי בטמפרטורת החדר. מעבירים את התמצית המרוכזת חלקית לבקבוקון ומרכזים אותה ל-≈100 μL תחת זרם של חנקן במאייד נשיפה בטמפרטורת החדר. לאחר החילוץ יש לשמור את הדגימות מאוחסנות בטמפרטורה של -20°C עד לניתוח.
      הערה: אין לרכז את התמצית ליובש, שכן הדבר יגרום לאובדן תרכובות נדיפות.
  3. דגימת Headspace עם סיב מצופה
    1. הגדרת מיקרו-מיצוי בפאזה מוצקה (SPME) כוללת א) מחזיק SPME המופעל ידנית, ב) סיבים מצופים, ו-ג) מעמד מתאים לתמיכה במחזיק SPME (איור 4C). עבור הפרוטוקול הנוכחי, השתמש במערכת SPME-headspace ידנית בבקבוקון עם סיב מצופה 100 מיקרומטר פולידימתילסילוקסאן (PDMS) ללכידת נדיפים.
      הערה: סיבים מסחריים אחרים הם בעלי ציפויים בעלי מאפיינים כימיים שונים ויש לבחור אותם בהתאם לאפקט הרצוי.
    2. רכך תרמית כל סיב SPME למשך עד 20 דקות ב-250°C לפני השימוש, בהתאם להמלצות היצרן.
    3. הכנס את חומר האורן, או חלק האורן, לבקבוקון זכוכית שקוף ואטם אותו עם מכסה בורג חור עם תוחם פוליטטרה-פלואוראתילן (PTFE) (מחיצה). החומר צריך להיות לפחות 2 עד 3 ס"מ מהחלק העליון של הבקבוקון, כך שהסיב לא ייגע בדגימה.
    4. בצע ניסויי בקרה בו זמנית באמצעות סיבי SPME על ידי דגימת בקבוקונים ריקים כדי לזהות מזהמי מערכת, או כדי לאשר את היעדר הנשיאה משימוש חוזר בסיבי SPME.
    5. שמור את חומר האורן בתוך הבקבוקון במשך שעה אחת לפני איסוף נדיפים לאיזון האטמוספירה.
      הערה: ניתן להפעיל בדיקות עם SPME בטמפרטורת החדר או בטמפרטורה מתכווננת על ידי הכנסת הבקבוקונים למדף תמיכה והכנסתם לאמבט Bain Marie.
    6. כוונן את עומק המחט חודרת המחיצה ממחזיק SPME כדי לחדור את המחיצה אך לא לבוא במגע עם החומר כאשר הסיב חשוף.
    7. כאשר הסיב נסוג, הכנס את מחט המחזיק דרך אניה PTFE. לחץ למטה את הבוכנה כדי לחשוף את הסיב. סובב את הבוכנה בכיוון השעון והחזק את בורג התמך בצד השמאלי האופקי של חריץ Z24. חשוף את הסיב במשך 1 שעות.
    8. משכו את הסיב על ידי סיבוב הבוכנה נגד כיוון השעון עד שהבוכנה תגיע לחלק העליון של חריץ Z. הנדיפים שנאספו מוכנים כעת לניתוח ישיר של GC ו / או GC-MS.
      הערה: במידת הצורך, ניתן לאחסן סיבים בטמפרטורת החדר לפני הניתוח, אך לא יותר משבוע.
  4. לכידת מרחב ראש עם צינורות ארוזים
    1. הכינו מערך ללכידה של נדיפים בחלל הראש עם מלכודות נירוסטה ארוזות המורכבות מ-א) מערכת שאיבת זרימה המונית, ב) צינורות PTFE, ג) מסנני אוויר פחם פעיל, ד) צינורות ארוזים מפולימר שרף נקבובי, ו-ה) כלי זכוכית או שקיות פוליאתילן טרפתאלט (PET) (שקיות בישול) (איור 4D)25.
    2. יש לשמור את חומר האורן בתוך כלי זכוכית מכוסים או בתוך שקיות PET כדי לצבור נדיפים במרווח הראש.
      הערה: שים לב כי נדיפים מפלסטיק נפוץ נמצאים בשפע וניתן לזהות אותם בכמויות גדולות באמצעות GC-MS.
    3. עבור מערכת לולאה סגורה, חבר את המעגל באופן הבא: א) יציאת המשאבה לצינורות PTFE, ב) צינור PTFE למסנני אוויר פחם פעיל, ג) ממסנני האוויר לצינורות נוספים המתחברים לכלי הזכוכית או לשקיות PET עם חומר האורן, ד) הצינור הארוז לכלי הזכוכית או לשקע שקית PET, ה) צינורות PTFE נוספים ממוצא צינור הנירוסטה לכניסת משאבת זרימת ההמונים22.
      הערה: צינורות נירוסטה ארוזים מפולימר נקבובי צריכים להיות מותנים תרמית ביחידת הספיחה התרמית בהתאם להמלצות היצרן, למשל, עד 15 דקות ב-100°C, לפני השימוש. היזהרו שלצינורות יש כיוון זרימה שיש לכבד.
    4. איסוף נדיפים על ידי שאיבת 100 ליטר אוויר מסונן דרך מערכת האורן ב 0.6 ליטר לדקה, באמצעות משאבת זרימת המסה כדי לשלוט בכמות ובקצב האוויר המסונן.
      הערה: הכמות ו/או הזרימה של אוויר הראש שזורם דרך העמוד יכולה להשפיע על כמות הנדיפים הכלואים, וכתוצאה מכך, על הכרומטוגרמה המתקבלת.
    5. לאחר איסוף נדיפים, סגרו את הצינורות הארוזים בשני הקצוות באמצעות מכסי אחסון אטומים לאוויר. יש לאחסן בטמפרטורת החדר (למשך שבוע לכל היותר) ולנתח בהקדם האפשרי, שכן נדיפים יכולים להתפרק או לברוח.
    6. לשטיפה, יש לשטוף את כל צינורות ה-PTFE וכלי הזכוכית באתנול 70% ולחמם בתנור ב-230°C למשך שעתייםו-25 שעות לפחות.

6. ניתוח פרופילים תנודתיים

  1. בצע ניתוח של פרופילים נדיפים באמצעות ספקטרומטריית מסה של כרומטוגרפיית גז (GC-MS), או באופן שגרתי באמצעות כרומטוגרפיית גז עם זיהוי יינון להבה (GC-FID) לכימות של נדיפים שזוהו בעבר.
    הערה: תיאור שיטות הניתוח על ידי GC-FID ו- GC-MS הוא נרחב ומעבר למטרת העבודה הנוכחית. מומלץ לקורא להשתמש בנהלים או תקנים במעבדה, כגון ISO 760926, המספקים תנאי הפעלה רלוונטיים לכימות מרכיבים בודדים ונתוני ספרות על השוואה בין שתי שיטות אנליטיות27.
  2. השתמש באנליטים טהורים או נישאים בממס, כגון n-pentane או n-hexane, ומוזרקים ישירות או נספגים לסיב, למשל, SPME ונספגים ישירות לתוך מזרק הכרומטוגרף או באמצעות יחידת ספיחה תרמית (TD) המקושרת ליחידת GC.
    הערה: למרות רגישותן הגבוהה יותר, רזולוציה גבוהה יותר וזמן ניתוח קצר יותר, לעמודות נימיות יש קיבולת דגימה נמוכה. לכן, למרות שכמעט כל תנאי ההפעלה יכולים להיות דומים, סוג האנליט (טהור, בממס, SPME וכו ') עשוי לדרוש הליכי הזרקה שונים של פיצול / פיצול פחות.
  3. לבצע זיהוי של רכיבים נדיפים על ידי השוואת מדדי השימור שלהם, המוערכים בהתאם לתקן ISO 7609, עם ספקטרום GC-MS מספרייה שנוצרה במעבדה באמצעות דגימות ייחוס שזהות הרכיב שלהן נקבעה על ידי RI, GC-MS ו- 13C-NMR, תרכובות מסונתזות ומבודדות במעבדה, ותקנים זמינים מסחרית, או, בהיעדרם, ספריות ספקטרום המונים זמינות מסחרית.
  4. בטא את התוצאות באמצעות ייצוג גרפי (כרומטוגרמה) ופרופיל כרומטוגרפי המפרט את הכמויות היחסיות של כל התרכובות המזוהות במדגם, כאשר סדר ההמלטה שלהן מצוין על ידי מדדי השמירה שלהן בעמודה המתאימה בה נעשה שימוש.
  5. עבור מספר רב של דגימות, בצע הערכת ניתוח סטטיסטית מתאימה המבוססת על ההרכב הכימי לפענוח סידור הדגימות (קבוצות ו/או הפרדות).

תוצאות

ה-PWN מתרבה במהירות בתנאים אופטימליים, וזמני הייצור יכולים להגיע ל-4 ימים, כאשר כל נקבה מטילה כ-80 ביצים במהלך חייה28. באמצעות המתודולוגיה המתוארת לעיל, כמויות גדולות של PWN ניתן להשיג בהתאם לצמיחה פטרייתית. בתוך תקופת גידול של 8 ימים, PWN יכולים לגדול פי 100 במספר האו?...

Discussion

הפרוטוקול המוצג כאן מתווה מתודולוגיה משופרת לניתוח תרכובות נדיפות באורן ימי הנגוע ב- PWN, כאשר השונות הסביבתית והגנטית מופחתת ואינה משפיעה על התוצאות. באמצעות קווים טהורים של גנוטיפים של אורן ימי במבחנה , ניתן לנתח נדיפים שחולצו ונפלטו כתגובה מארחת לאחד האיומים הביו...

Disclosures

אין לנו מה לחשוף.

Acknowledgements

מחקר זה מומן בחלקו על ידי האיחוד האירופי במסגרת פרויקט PurPest באמצעות הסכם מענקים 101060634, ועל ידי Fundação para a Ciência e a Tecnologia (FCT), באמצעות פרויקטים NemACT, DOI 10.54499/2022.00359.CEECIND/CP1737/CT0002; NemaWAARS, DOI 10.54499/PTDC/ASP-PLA/1108/2021; CESAM UIDP/50017/2020+UIDB/50017/2020+ LA/P/0094/2020; CE3C, DOI 10.54499/UIDB/00329/2020; GREEN-IT, DOI 10.54499/UIDB/04551/2020 ו- 10.54499/UIDP/04551/2020.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
38 mesh test sieveRetsch60.131.000038
6-Benzylaminopurine (6-BAP)Duchefa BiochemieB0904
Charcoal activatedDuchefa BiochemieC1302
Clevenger apparatusWINZER Laborglastechnik25-000-02
Hydrogen peroxide solutionSigma-AldrichH1009-500ML
Indole-3-butyric acid (IBA)Duchefa BiochemieI0902
Likens-Nickerson apparatusVitriLab LDA.c/IN29/32
Microbox round containersSac O2O118/80+OD118
n-PentaneSigma-Aldrich1.00882
PARAFILM M sealing filmBRANDHS234526B-1EA
Phyto agarDuchefa BiochemieP1003
Potato Dextrose AgarBD DIFCO213400
Scalpel blade no. 24Romed HollandBLADE24
Schenk & Hildebrandt Basal salt mediumDuchefa BiochemieS0225
Schenk & Hildebrandt vitamin mixtureDuchefa BiochemieS0411
SPME fiber assembly Polydimethylsiloxane (PDMS)Supelco57300-U
SPME Fiber HolderSupelco57330-U
SucroseDuchefa BiochemieS0809
Tenax TA- stainless steel tubes- conditioned + cappedMarkes InternationalC1-AAXX-5003

References

  1. Back, M. A., Bonifácio, L., Inácio, M. L., Mota, M., Boa, E. Pine wilt disease: A global threat to forestry. Plant Pathol. 73 (5), 1026-1041 (2024).
  2. Mumm, R., Hilker, M. Direct and indirect chemical defence of pine against folivorous insects. Trend Plant Sci. 11 (7), 351-358 (2006).
  3. Carrasquinho, I., Lisboa, A., Inácio, M. L., Gonçalves, E. Genetic variation in susceptibility to pine wilt disease of maritime pine (Pinus pinaster Aiton) half-sib families. Annals Forest Sci. 75 (3), 85 (2018).
  4. Gaspar, M. C., et al. Impact of the pinewood nematode on naturally-emitted volatiles and scCO2 extracts from Pinus pinaster branches: a comparison with P. pinea. J Supercritical Fluids. 159, 104784 (2020).
  5. Rodrigues, A. M., et al. Pinus halepensis, Pinus pinaster, Pinus pinea and Pinus sylvestris essential oils chemotypes and monoterpene hydrocarbon enantiomers, before and after inoculation with the pinewood nematode Bursaphelenchus xylophilus. Chem Biodiver. 14 (1), e1600153 (2017).
  6. Faria, J. M. S., et al. In vitro co-cultures of Pinus pinaster with Bursaphelenchus xylophilus: a biotechnological approach to study pine wilt disease. Planta. 241 (6), 1325-1336 (2015).
  7. Espinosa-Leal, C. A., Puente-Garza, C. A., García-Lara, S. In vitro plant tissue culture: means for production of biological active compounds. Planta. 248 (1), 1-18 (2018).
  8. Bonga, J. M., von Aderkas, P. . In Vitro Culture of Trees. , (1992).
  9. Faria, J. M. S., et al. Nematotoxic and phytotoxic activity of Satureja montana and Ruta graveolens essential oils on Pinus pinaster shoot cultures and P. pinaster with Bursaphelenchus xylophilus in vitro co-cultures. Indus Crops Prod. 77, 59-65 (2015).
  10. Vallarino, J. G., et al. Acquisition of volatile compounds by gas chromatography-mass spectrometry (GC-MS). Plant Metabol. Meth Mol Biol. , 225-239 (2018).
  11. Kikuchi, T., Aikawa, T., Oeda, Y., Karim, N., Kanzaki, N. A rapid and precise diagnostic method for detecting the pinewood nematode Bursaphelenchus xylophilus by loop-mediated isothermal amplification. Phytopathology. 99 (12), 1365-1369 (2009).
  12. Faria, J. M. S., Barbosa, P., Bennett, R. N., Mota, M., Figueiredo, A. C. Bioactivity against Bursaphelenchus xylophilus: Nematotoxics from essential oils, essential oils fractions and decoction waters. Phytochemistry. 94, 220-228 (2013).
  13. Nickle, W. R., Golden, A. M., Mamiya, Y., Wergin, W. P. On the taxonomy and morphology of the pine wood nematode, Bursaphelenchus xylophilus (Steiner &Buhrer 1934) Nickle 1970. J Nematol. 13 (3), 385-392 (1981).
  14. Viglierchio, D. R., Schmitt, R. V. On the methodology of nematode extraction from field samples: baermann funnel modifications. J Nematol. 15 (3), 438-444 (1983).
  15. IPPC. . DP 10: Bursaphelenchus xylophilus.Diagnostic protocols, International standard for phytosanitary measures.. 27, 1 (2016).
  16. Rodrigues, A. M., Carrasquinho, I., António, C. Primary metabolite adjustments associated with pinewood nematode Resistance in Pinus pinaster. Front Plant Sci. 12, (2021).
  17. Gonçalves, E., et al. Effect of Monochamus galloprovincialis feeding on Pinus pinaster and Pinus pinea, oleoresin and insect volatiles. Phytochemistry. 169 (September 2019), 112159 (2020).
  18. Schenk, R. U., Hildebrandt, A. C. Medium and techniques for induction and growth of monocotyledonous and dicotyledonous plant cell cultures. Canadian J Botany. 50 (1), 199-204 (1972).
  19. Tereso, S., et al. Improved axillary and adventitious bud regeneration from Portuguese genotypes of Pinus pinaster AIT. Propag Ornam Plants. 6 (1), 24-33 (2006).
  20. Council of Europe European Directorate for the Quality of Medicines. . European Pharmacopoeia. , 241 (2010).
  21. Likens, S. T., Nickerson, G. B. Detection of certain hop oil constituents in brewing products. Proc Ann Meet - Am Soc Brewing Chem. 22 (1), 5-13 (1964).
  22. Karimi, A., Gross, J. Development and validation of an innovative headspace collection technique: volatile organic compound patterns emitted by different developmental stages of Halyomorpha halys. Front Horti. 3, (2024).
  23. Koedam, A., Scheffer, J. J. C., Baerheim Svendsen, A. Comparison of isolation procedures for essential oils II. Ajowan, Caraway, Coriander and Cumin. Zeitschrift für Lebensmittel-Untersuchung und -Forschung. 168 (2), 106-111 (1979).
  24. Abdulra'uf, L. B., Hammed, W. A., Tan, G. H. SPME fibers for the analysis of pesticide residues in fruits and vegetables: A review. Crit Rev Anal Chem. 42 (2), 152-161 (2012).
  25. Gross, J., Gallinger, J., Rid, M. Collection, identification, and statistical analysis of volatile organic compound patterns emitted by phytoplasma infected plants. Methods Mol Biol. 1875, 333-343 (2019).
  26. . . ISO 7609:1985 Essential Oils-Analysis by Gas Chromatography on Capillary Columns-General Method. , (1985).
  27. Rubiolo, P., Sgorbini, B., Liberto, E., Cordero, C., Bicchi, C. Essential oils and volatiles: Sample preparation and analysis. A review. Flav Fragr J. 25 (5), 282-290 (2010).
  28. Fielding, N. J., Evans, H. F. The pine wood nematode Bursaphelenchus xylophilus (Steiner and Buhrer) nickle (= B. lignicolus Mamiya and Kiyohara): An assessment of the current position. Forestry. 69 (1), 34-46 (1996).
  29. Faria, J. M. S., et al. First report on the synergistic interaction between essential oils against the pinewood nematode Bursaphelenchus xylophilus. Plants. 12 (13), 2438 (2023).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

211

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved