Infection des pins in vivo et in vitro par le nématode du pin Bursaphelenchus xylophilus et isolement des substances volatiles induites

Résumé

Le protocole décrit l’infection in vivo et in vitro de Pinus pinaster par le nématode du pin et leur analyse du volatilome par chromatographie en phase gazeuse (GC) et GC couplée à la spectrométrie de masse (GC-MS).

Résumé

Le nématode du pin (PWN) est un phytoparasite qui cause la maladie du flétrissement du pin (PWD) chez les espèces de conifères. Ce nématode parasite des plantes a fortement contribué à la déforestation des pins dans les pays asiatiques, par exemple au Japon, en Chine et en Corée. Au cours des deux dernières décennies, en Europe, le Portugal et l’Espagne ont été fortement touchés. La recherche sur les mécanismes de l’infection par le NPD et/ou de la progression des PWD chez les espèces hôtes sensibles repose sur l’infection contrôlée de semis de pin dans des conditions de serre. Cette technique est laborieuse et mobilise des ressources économiques et humaines conséquentes. De plus, il peut être sujet à une variabilité résultant de la diversité génétique associée à certaines espèces de pins, mais aussi de l’interférence de facteurs externes. Comme alternative, les co-cultures in vitro de pin avec des PWN offrent un système plus avantageux pour l’étude des changements biochimiques car elles a) permettent de contrôler des variables environnementales ou nutritionnelles uniques, b) occupent moins d’espace, c) nécessitent moins de temps pour être obtenues, et d) sont exemptes de contamination ou de variation génétique de l’hôte. Le protocole suivant détaille l’infection standard in vivo par le PWN de Pinus pinaster, le pin maritime, et l’établissement de nouvelles co-cultures in vitro de pousses de pin avec le PWN en tant que méthodologie améliorée pour étudier cette influence phytoparasitaire sur les substances volatiles du pin. Les substances volatiles induites par le PWN sont extraites de pins infectés in vivo et in vitro par hydrodistillation et distillation-extraction, et les substances volatiles émises sont capturées par microextraction en phase solide (SPME), en utilisant des techniques de fibres ou de colonnes garnies.

Introduction

Le nématode du pin, Bursaphelenchus xylophilus (Steiner & Bührer 1934) Nickle 1970, est un nématode parasite des plantes qui parasite principalement les espèces de Pinus . Ce phytoparasite est transmis par des insectes du genre Monochamus aux arbres des espèces de pin sensibles pendant la maturation de l’insecte. Le PWN tue l’arbre en attaquant ses canaux de résine et en réduisant l’écoulement de la résine, et en endommageant son tissu vasculaire, provoquant des interruptions dans la colonne d’eau. Le manque d’eau au niveau de la canopée des arbres induit les premiers symptômes visibles de la maladie du flét....

Protocole

1. Cultiver in vitro le nématode du pin

REMARQUE : Les nématodes du pin se développent en se nourrissant du mycélium fongique d’une souche non sporulante de Botrytis cinerea (de Bary) Whetzel¹¹.

1. Pour une sous-culture de routine, transférez un bouchon de culture (0,5 cm de diamètre) du bord extérieur de la colonie fongique sur une plaque de gélose stérile au dextrose de pomme de terre (PDA) et conservez-le à 25 ± 1 °C pendant 7 à 10 jours, ou jusqu’à ce que la colonie fongique atteigne le bord de la plaque.
   REMARQUE : D’autres t....

Discussion

Le protocole présenté ici décrit une méthodologie améliorée pour analyser les composés volatils du pin maritime infecté par le PWN, où la variabilité environnementale et génétique est réduite et n’influence pas les résultats. À l’aide de lignées pures de génotypes in vitro de pin maritime, les substances volatiles extraites et émises peuvent être analysées en tant que réponse de l’hôte à l’une des menaces biotiques les plus dommageables pour les fo.......

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
38 mesh test sieve	Retsch	60.131.000038
6-Benzylaminopurine (6-BAP)	Duchefa Biochemie	B0904
Charcoal activated	Duchefa Biochemie	C1302
Clevenger apparatus	WINZER Laborglastechnik	25-000-02
Hydrogen peroxide solution	Sigma-Aldrich	H1009-500ML
Indole-3-butyric acid (IBA)	Duchefa Biochemie	I0902
Likens-Nickerson apparatus	VitriLab LDA.	c/IN29/32
Microbox round containers	Sac O2	O118/80+OD118
n-Pentane	Sigma-Aldrich	1.00882
PARAFILM M sealing film	BRAND	HS234526B-1EA
Phyto agar	Duchefa Biochemie	P1003
Potato Dextrose Agar	BD DIFCO	213400
Scalpel blade no. 24	Romed Holland	BLADE24
Schenk & Hildebrandt Basal salt medium	Duchefa Biochemie	S0225
Schenk & Hildebrandt vitamin mixture	Duchefa Biochemie	S0411
SPME fiber assembly Polydimethylsiloxane (PDMS)	Supelco	57300-U
SPME Fiber Holder	Supelco	57330-U
Sucrose	Duchefa Biochemie	S0809
Tenax TA- stainless steel tubes- conditioned + capped	Markes International	C1-AAXX-5003