Infection des pins in vivo et in vitro par le nématode du pin Bursaphelenchus xylophilus et isolement des substances volatiles induites

Résumé

Le protocole décrit l’infection in vivo et in vitro de Pinus pinaster par le nématode du pin et leur analyse du volatilome par chromatographie en phase gazeuse (GC) et GC couplée à la spectrométrie de masse (GC-MS).

Résumé

Le nématode du pin (PWN) est un phytoparasite qui cause la maladie du flétrissement du pin (PWD) chez les espèces de conifères. Ce nématode parasite des plantes a fortement contribué à la déforestation des pins dans les pays asiatiques, par exemple au Japon, en Chine et en Corée. Au cours des deux dernières décennies, en Europe, le Portugal et l’Espagne ont été fortement touchés. La recherche sur les mécanismes de l’infection par le NPD et/ou de la progression des PWD chez les espèces hôtes sensibles repose sur l’infection contrôlée de semis de pin dans des conditions de serre. Cette technique est laborieuse et mobilise des ressources économiques et humaines conséquentes. De plus, il peut être sujet à une variabilité résultant de la diversité génétique associée à certaines espèces de pins, mais aussi de l’interférence de facteurs externes. Comme alternative, les co-cultures in vitro de pin avec des PWN offrent un système plus avantageux pour l’étude des changements biochimiques car elles a) permettent de contrôler des variables environnementales ou nutritionnelles uniques, b) occupent moins d’espace, c) nécessitent moins de temps pour être obtenues, et d) sont exemptes de contamination ou de variation génétique de l’hôte. Le protocole suivant détaille l’infection standard in vivo par le PWN de Pinus pinaster, le pin maritime, et l’établissement de nouvelles co-cultures in vitro de pousses de pin avec le PWN en tant que méthodologie améliorée pour étudier cette influence phytoparasitaire sur les substances volatiles du pin. Les substances volatiles induites par le PWN sont extraites de pins infectés in vivo et in vitro par hydrodistillation et distillation-extraction, et les substances volatiles émises sont capturées par microextraction en phase solide (SPME), en utilisant des techniques de fibres ou de colonnes garnies.

Introduction

Le nématode du pin, Bursaphelenchus xylophilus (Steiner & Bührer 1934) Nickle 1970, est un nématode parasite des plantes qui parasite principalement les espèces de Pinus . Ce phytoparasite est transmis par des insectes du genre Monochamus aux arbres des espèces de pin sensibles pendant la maturation de l’insecte. Le PWN tue l’arbre en attaquant ses canaux de résine et en réduisant l’écoulement de la résine, et en endommageant son tissu vasculaire, provoquant des interruptions dans la colonne d’eau. Le manque d’eau au niveau de la canopée des arbres induit les premiers symptômes visibles de la maladie du flétrissement du pin, c’est-à-dire que les aiguilles de pin deviennent chlorotiques après l’arrêt de la photosynthèse et s’affaissent en raison de la dessiccation. Le pin réagit généralement aux stress biotiques et abiotiques par la production de résine et de composés volatils¹. Ainsi, il est important de comprendre les mécanismes de défense du pin pour déterminer les effets spécifiques des attaques de PWN et trouver des méthodes alternatives de lutte antiparasitaire².

À l’heure actuelle, l’expérimentation sur le terrain dépend de la disponibilité des pins infectés, de la confirmation de l’infection par le néphrovirus du poisson et des conditions environnementales variables. Dans des conditions de serre, ces paramètres peuvent être plus facilement contrôlés ; Cependant, la diversité génétique de l’hôte devient une forte source de variabilité³. Par exemple, dans une étude sur la réponse de résistance de Pinus pinaster, la production du terpène limonène et des acides résiniques a été associée à l’infection par le PWN⁴. Cependant, en raison du petit nombre d’échantillons et de la variabilité des conditions naturelles, des changements détectables n’ont été enregistrés que pour la moitié des échantillons. Dans une autre étude utilisant des semis de pin cultivés en serre, même si les conditions environnementales étaient plus facilement contrôlées, la diversité génétique naturelle du pin a induit une grande variabilité des substances volatiles extraites5. Étant donné que les substances volatiles du pin induites par les maladies peuvent être grandement influencées par les variations environnementales et génétiques, le recours à des cultures de pousses in vitro est une bonne alternative pour les études sur la réponse chimique et biochimique du tissu du pin à l’infection par le PWN ^5,6. En multipliant un génotype végétal in vitro, sa constitution génétique peut être maintenue et clonée indéfiniment, ce qui conduit à l’établissement d’un plus grand nombre d’individus génétiquement identiques dans moins d’espace et en moins de temps qu’in vivo. Ces cultures sont un système de travail simple dans des conditions nutritionnelles et environnementales facilement manipulables, de sorte qu’elles offrent des avantages supplémentaires par rapport aux systèmes conventionnels dans l’évaluation de la production et de l’émission de substances volatiles ^7,8. Ces systèmes sont particulièrement avantageux pour la recherche sur les espèces ligneuses, qui nécessitent la plupart du temps des ressources importantes, c’est-à-dire que les arbres cibles sont parfois situés dans des sites difficiles d’accès, nécessitent du matériel coûteux, une main-d’œuvre dédiée et des périodes d’analyse plus longues⁸. In vitro, les co-cultures de pins avec le PWN permettent d’évaluer les interactions métaboliques entre le nématode et la plante à différents stades⁹. Pour l’analyse des substances volatiles, cela est très important car les techniques de profilage sont devenues très précises et des variations infimes dans l’échantillonnage peuvent entraîner des changements substantiels dans les profils volatils. La chromatographie en phase gazeuse couplée à la spectrométrie de masse (GC-MS) est une technique puissante pour l’analyse des composés volatils et permet un profilage rapide et rationalisé des composés volatils¹⁰. Le protocole présenté ici décrit des techniques d’infection in vivo de plants de pins en serre et des cultures de pousses in vitro de pins génétiquement identiques optimisées pour l’extraction et le profilage des volatils induits.

Protocole

1. Cultiver in vitro le nématode du pin

REMARQUE : Les nématodes du pin se développent en se nourrissant du mycélium fongique d’une souche non sporulante de Botrytis cinerea (de Bary) Whetzel¹¹.

1. Pour une sous-culture de routine, transférez un bouchon de culture (0,5 cm de diamètre) du bord extérieur de la colonie fongique sur une plaque de gélose stérile au dextrose de pomme de terre (PDA) et conservez-le à 25 ± 1 °C pendant 7 à 10 jours, ou jusqu’à ce que la colonie fongique atteigne le bord de la plaque.
   REMARQUE : D’autres types de milieu de croissance fongique général peuvent être utilisés pour la croissance fongique.
2. Pour obtenir de plus grandes quantités de PWN, utilisez B. cinerea cultivé in vitro sur des grains d’orge hydratés et certifiés biologiques (Hordeum vulgare L.), stérilisés à la vapeur. Ajouter 15 g de céréales à 15 ml d’eau ultrapure, dans des flacons Erlenmeyer à col large couverts de 250 ml et stériliser. Ensuite, inoculer avec un bouchon de culture de B. cinerea et conserver à 25 ± 1 °C pendant 7 à 10 jours ou jusqu’à ce que la surface de la céréale soit complètement colonisée¹².
   REMARQUE : Les nématodes à des fins de recherche peuvent être demandés aux laboratoires nationaux de référence pour les nématodes parasites des plantes.
3. Amorcer les cultures de NEPP en inoculant des cultures in vitro de B. cinerea avec une suspension aqueuse de NEPP (contenant au moins 20 mâles et 30 femelles) et les maintenir dans l’obscurité dans les conditions décrites précédemment, pendant 7 à 10 jours ou jusqu’à ce que la colonie fongique soit complètement consommée et que la population de NEPP commence à grimper sur les parois de la plaque ou du ballon (figure 1). Scellez les plaques ou les flacons avec un film plastique pour éviter la dessiccation.
   REMARQUE : Les femelles peuvent être distinguées par le lambeau vulvaire, un long sac post-utérin et une terminaison de queue généralement ronde ; Les mâles ont une queue terminale pointue incurvée ventralement avec des spicules caractéristiques¹³. Lors du pipetage de suspensions de PWN, striez la colonie de champignons de manière à ce que la suspension pipetée ne forme pas de gouttelettes sur la surface fongique, piégeant les PWN par tension superficielle.
4. Isolez les PWN en rinçant les parois du ballon à l’eau du robinet, en versant le contenu sur une serviette en papier dans un entonnoir ou un plateau Baermann et en l’immergeant dans de l’eau¹⁴. Après 24 à 48 heures, les nématodes vivants se seraient transférés du matériel infecté dans l’eau. Récupérez-les par tamisage à l’aide d’un tamis à mailles de 38 μm¹⁵. Lavez les PWN accumulés dans un récipient avec de l’eau du robinet.
   REMARQUE : Tout matériau qui entre en contact avec le PWN doit être correctement décontaminé car il s’agit d’un organisme de quarantaine ; Une immersion dans l’éthanol pendant 10 à 20 min est généralement suffisante. Les suspensions aqueuses rejetées doivent être stérilisées ou chauffées à 60 °C pendant au moins 35 min.
5. Utilisez immédiatement la suspension aqueuse contenant les PWN ou maintenez-la à 11 °C pendant une période de stockage plus longue (jusqu’à 2 mois).

2. Stérilisation des nématodes du pin à des stades de vie mixtes

1. Dans une hotte d’écoulement, pipetez un volume de suspension de PWN contenant environ 5000 PWN dans un tamis à mailles stériles de 38 μm et lavez-les à l’eau stérile.
   REMARQUE : Comptez les nématodes au microscope binoculaire (40x).
2. Immerger la moitié inférieure du tamis contenant les PWN dans une solution de peroxyde d’hydrogène à 20 % (H₂O₂) et mélanger manuellement pendant 15 min.
3. Lavez les PWN stériles en distribuant de l’eau stérile à travers le tamis. Répétez cette étape 3 fois. Lors du dernier lavage, inclinez le tamis de manière à ce que les PWN s’accumulent à la bordure du tamis. Récupérer la suspension de nématodes stériles en pipetant 1 mL d’eau stérile dans la bordure du tamis et l’entreposer à 11 °C ou l’utiliser immédiatement.
   REMARQUE : Le succès de la stérilisation peut être évalué en plaquant une aliquote de 100 μL de la suspension de PWN dans un milieu PDA et en surveillant régulièrement les contaminations pendant environ 1 semaine.

3. Infection des semis in vivo de Pinus pinaster

REMARQUE : Les essais d’inoculation sont effectués sur ≥ semis de P. pinaster âgés de 2 ans. Les arbres peuvent être achetés auprès de détaillants commerciaux certifiés, mais peuvent également être cultivés en serre à partir de graines certifiées.

1. Prélever l’inoculum de NEPP comme décrit à l’étape 1 et régler les suspensions de NEPP à 1000 NPD/mL en ajoutant de l’eau à la suspension ou en attendant que les nématodes se déposent (environ 60 min) et en abaissant le volume en décantant l’eau de surface. Effectuez un comptage à température ambiante dans une lame concave sous le microscope binoculaire à 40x.
2. Pour commencer l’inoculation, retirez manuellement les aiguilles d’une section située sous les 5 cm supérieurs de la tige de pin et faites une incision longitudinale superficielle (0,5 à 1 cm de longueur) à l’aide d’un scalpel stérilisé¹⁶.
   REMARQUE : L’incision est pratiquée pour permettre au nématode d’accéder aux tissus internes du pin.
3. Au niveau de la zone de blessure, placez un morceau de coton stérilisé pour contenir 0,5 mL de suspension PWN pipetée et fixez-le avec une bande transparente pour maintenir l’humidité.
   REMARQUE : Mélangez vigoureusement la suspension de PWN entre chaque inoculation, car les nématodes se déposeront rapidement. Si la suspension sèche au site d’inoculation, l’infection par les nématodes peut échouer, alors couvrez le coton humide de manière adéquate.
4. Pour le contrôle des pins, remplacer la suspension PWN par de l’eau stérile.
5. Suivez régulièrement la progression du PWD et notez la symptomatologie en quantifiant le pourcentage d’aiguilles décolorées et flétries. Obtenir un score de 0 pour l’absence de symptômes externes, de 1 pour une décoloration des aiguilles allant jusqu’à 25 %, de 2 pour une décoloration des aiguilles comprise entre 25 % et 50 %, d’un score de 3 pour une décoloration de 50 % à 75 % et de 4 pour des pins dont les aiguilles sont complètement brunes (figure 2).
6. Maintenez la serre dans des conditions humides (60 % à 80 %) et arrosez fréquemment (maintenez à 70 % de la capacité maximale de rétention d’eau du sol), en évitant les températures extrêmes car les nématodes deviennent métaboliquement inactifs en dessous de 10 °C et le développement peut être affecté au-dessus de 30 °C.
7. 20 jours après l’inoculation, récoltez le matériel végétal pour l’extraction des substances volatiles en coupant les plantules à la base de la tige et en les congelant (-20 °C) dans des sacs en papier brun. Pour les composés volatils émis (fibres SMPE ou tubes emballés), échantillonner les plants de pin immédiatement, à température ambiante ^5,17.

4. Établissement et infection des cultures de pousses de pin in vitro

1. Avant la stérilisation de surface, laver les graines certifiées de P. pinaster dans l’eau courante du robinet pour enlever les plus gros débris, puis avec une solution détergente ordinaire (1 goutte par 40 ml d’eau), en agitant vigoureusement, pour laver les débris les plus fins.
2. Dans une hotte à flux, commencer la stérilisation de la surface des graines en ajoutant une solution d’eau de Javel commerciale (1:4, eau de Javel commerciale dans l’eau du robinet) jusqu’à ce que les graines lavées soient recouvertes, et mélanger vigoureusement pendant 15 min. Jetez la solution d’eau de Javel et rincez les graines 3 fois avec de l’eau du robinet stérilisée.
3. Plongez les graines dans une solution d’éthanol (80%, v/v) pendant 15 minutes avec une agitation vigoureuse, jetez l’éthanol et lavez-les 3 fois avec de l’eau ultrapure stérilisée.
4. Pour la germination du pin, cassez les témentages stérilisés avec un tour mécanique stérile dans une hotte d’écoulement, isolez les pignons de pin et placez-les dans un récipient fermé avec du papier filtre humide stérilisé pour hydrater les pignons de pin pendant la nuit⁶.
5. Stratification des pignons de pin hydratés à 4 °C pendant 7 jours, pour rompre la dormance et synchroniser la germination, puis maintenir à l’obscurité à 25 °C jusqu’à la germination.
   REMARQUE : L’étape de stratification est facultative.
6. Transférez les pins germés aseptiques, dans le récipient fermé, à une photopériode légère de 16 h, à une thermopériode de 24 °C / 18 °C et maintenez-les pendant 2 semaines ou jusqu’à ce que la tige principale commence à se développer.
7. Dans la hotte d’écoulement, coupez la partie aérienne de la plantule au-dessus de la racine à l’aide d’un scalpel et transférez-la dans un milieu de culture Schenk et Hildebrandt (SH)¹⁸ stérilisé (pH = 5,8) complété par 30 g/L de saccharose, 8 g/L de gélose, 0,5 mg/L de 6-benzylaminopurine (BAP, une cytokinine) et 0,1 mg/L d’acide indole-3-butyrique (IBA, une auxine)⁶, pour induire la multiplication des micropousses. Conservez les cultures dans les conditions décrites ci-dessus dans une chambre de culture in vitro .
8. Dans la hotte d’écoulement, sous-culture périodique (environ 4 semaines) en coupant le tissu calleux à la base de la pousse (portion en contact avec le milieu de culture) avec un scalpel stérile et en transférant la grappe de pousses avec une pince à épiler stérile dans un milieu de culture de multiplication frais.
9. Pour l’élongation des microtiges, transférez les micropousses dans le milieu de culture SH décrit ci-dessus, mais contenant 3 g/L de charbon actif au lieu de phytohormones.
   REMARQUE : Le charbon actif adsorbe les substances toxiques et empêche l’accumulation excessive de phytohormones induites sur le tissu sectionné¹⁹.
10. En cas d’infection par le NPD, transférez les pousses allongées dans un milieu de culture SH sans phytohormones ni charbon actif et ajoutez 100 à 150 NEPP stérilisés à des stades de vie mixtes au bas de la micropousse. Maintenir dans les conditions décrites ci-dessus jusqu’à ce que les symptômes du PWD commencent à être perceptibles (Figure 3)⁶.
11. Pour récolter du matériel végétal pour l’extraction des composés volatils, utiliser immédiatement les explants in vitro ou les congeler (-20 °C) jusqu’à l’analyse. Pour les volatils émis (fibres SMPE ou tubes emballés), analysez immédiatement les boîtes de micropousses.

5. Isolement des composés volatils

REMARQUE : L’isolement des substances volatiles peut être effectué à l’aide de plusieurs techniques. Ici, l’extraction des substances volatiles se fait par hydrodistillation, à l’aide d’un appareil Clevenger²⁰, par distillation-extraction, à l’aide d’un appareil Likens-Nickerson²¹, et par piégeage des substances volatiles de l’espace de tête par microextraction en phase solide (SPME) à l’aide de fibres enrobées ou de tubes garnis (sorbant polymère poreux)²².

1. Hydrodistillation
   1. Utilisez un appareil Clevenger pour l’isolement des huiles essentielles. Le système de distillation se compose a) de l’appareil Clevenger, b) d’une fiole à fond rond ou d’un erlenmeyer pour retenir l’eau et le pin, c) d’un équipement de chauffage approprié et d) d’un cadre de support pour maintenir le système en place (figure 4A).
   2. Nettoyez soigneusement la verrerie avant utilisation. Utilisez des pinces de cadre de laboratoire pour fixer l’appareil Clevenger au cadre en treillis. Réfrigérez le condenseur du système en faisant circuler de l’eau ou utilisez un circulateur réfrigéré si disponible.
   3. Enregistrez le poids de la pousse de pin et placez-le dans la fiole à fond rond ou l’Erlenmeyer. Ajustez la quantité d’eau pour vous assurer que le récipient n’est pas plus qu’à moitié plein.
   4. Placez l’équipement de chauffage sous le ballon, vérifiez qu’il n’y a pas de fuites et assurez-vous que toutes les pièces du système sont dans la bonne position et fixées au cadre de support.
      REMARQUE : Les pièces de connexion en verre dépoli du Clevenger et du flacon doivent être soigneusement nettoyées, dégraissées et séchées avant la connexion. Pour cela, utilisez un morceau de papier filtre légèrement humidifié avec de l’acétone. La graisse ne doit pas être utilisée dans ces pièces.
   5. Introduisez de l’eau à travers l’entonnoir de remplissage, situé dans le tube diagonal de retour dans la partie centrale de l’appareil Clevenger. Ajustez la position du robinet à trois voies de sorte que l’eau s’écoule uniformément dans les deux tubes (diagonal et gradué) jusqu’à ce que le ballon soit rempli, juste avant de s’écouler du tube diagonal de retour dans celui-ci (voir Figure 4).
   6. Allumez la source de chaleur et ajustez-la pour amener l’eau à ébullition à un taux de distillation de 2 à 3 ml/min.
   7. Démarrez le temps de distillation lorsque la première goutte d’eau distillée tombe dans le tube gradué sur le côté droit de l’appareil Clevenger. Le temps moyen de distillation est de 3 h²³, mais des périodes de distillation plus courtes ou plus longues peuvent être utilisées en fonction des exigences spécifiques. Les huiles essentielles sont généralement dans le liquide surnageant car elles sont généralement plus légères que l’eau aromatique distillée ci-dessous (hydrolat).
      ATTENTION : Lorsque la distillation est en cours, l’appareil Clevenger sera chaud au toucher.
   8. Une fois le temps de distillation terminé, arrêtez le chauffage et laissez reposer pendant environ 10 minutes pour permettre à la distillation et à l’ébullition de s’arrêter. Au bout de 10 min, ouvrez le robinet dans le sens des aiguilles d’une montre pour laisser l’hydrolat s’écouler jusqu’à ce que l’huile essentielle atteigne la partie graduée. Lire le volume d’huile essentielle isolée. Calculer le rendement en mL/g (poids frais ou sec), exprimé en pourcentage (%, v/p).
   9. Dans le cas des huiles essentielles d’un volume inférieur à 0,05 mL, la graduation la plus basse dans le tube gradué, le rendement ne peut pas être déterminé. Pour récupérer l’huile essentielle, utilisez du n-pentane distillé pour rincer l’appareil Clevenger.
   10. Pour récupérer l’huile essentielle à l’aide de n-pentane distillé, une fois la distillation terminée, attendez environ 10 à 15 min et ouvrez le robinet à trois voies dans le sens inverse des aiguilles d’une montre pour que l’hydrolat s’écoule hors du tube diagonal de retour jusqu’en dessous de l’entonnoir de remplissage. À l’aide d’un compte-gouttes propre, introduisez le n-pentane distillé dans l’entonnoir de remplissage jusqu’au côté supérieur gauche du tube diagonal de retour. Évitez de toucher l’entonnoir de remplissage pour éviter la contamination croisée.
   11. Avec une bouteille de lavage d’eau distillée, introduisez de l’eau dans l’entonnoir de remplissage. Le n-pentane s’écoulera vers le ballon de distillation et s’évaporera avec la chaleur résiduelle de l’eau de décoction. De cette façon, il traversera le système, se dissoudra et entraînera les substances volatiles à la surface de l’hydrolat, dans le tube gradué. Ouvrez le robinet à trois voies dans le sens des aiguilles d’une montre jusqu’à sa position normale.
   12. Procédez comme au point 5.1.8. Pour recueillir l’huile essentielle dissoute dans le N-pentane.
   13. Concentrer le mélange d’huile essentielle et de n-pentane sur un volume minimum d’environ 100 μL à température ambiante sous flux d’azote à l’aide d’un système d’évaporateur de purge. Maintenez-le à -20 °C jusqu’à l’analyse.
       REMARQUE : Ne pas se concentrer à sec pour éviter la perte de composés volatils.
2. Distillation-extraction
   1. Utilisez l’appareil Likens-Nickerson pour extraire les substances volatiles des plantes. Le système de distillation-extraction est composé a) de l’appareil Likens-Nickerson, b) d’une fiole à fond rond pour retenir l’eau et le pin (bras latéral droit de l’unité de distillation), et d’un autre pour contenir un solvant organique non miscible, tel que le n-pentane distillé (bras latéral gauche de l’unité de distillation), c) deux dispositifs de chauffage appropriés, d) un condenseur, et e) un cadre de support pour maintenir le système (figure 4B).
      REMARQUE : Utilisez du n-pentane distillé en laboratoire pour éviter la contamination de l’échantillon par des stabilisants ajoutés à des solvants.
   2. Commencez par faire circuler de l’eau dans le condenseur sécurisé ou utilisez un circulateur réfrigéré si disponible.
   3. À l’aide de pinces de cadre de laboratoire, fixez l’unité de distillation-extraction au cadre en treillis. Chargez le ballon à fond rond avec le matériau de pin à extraire et ajoutez de l’eau à moitié plein. Le petit flacon à fond rond de 100 ml doit être à moitié rempli de n-pentane distillé.
      REMARQUE : Avant de se connecter, les pièces de connexion en verre dépoli des composants en verre doivent être bien nettoyées, dégraissées et séchées. Un morceau de papier filtre qui a été brièvement mouillé avec de l’acétone peut être utilisé pour le nettoyage.
   4. Placez les manchons chauffants sous chaque ballon. Vérifiez qu’il n’y a pas de fuites et que chaque composant du système est correctement positionné et fixé au cadre en treillis du laboratoire. Allumez les sources de chaleur et ajustez-les à leurs points d’ébullition respectifs. L’eau doit bouillir à un taux de distillation de 2 à 3 mL/min.
      ATTENTION : Pendant le processus de distillation-extraction, l’appareil Likens-Nickerson sera chaud au toucher.
   5. Une fois le temps de distillation terminé, arrêtez le chauffage du ballon avec du pin et laissez le n-pentane distiller seul pendant 10 min. Une fois que le n-pentane se transforme en un liquide transparent, arrêtez le chauffage et laissez-le reposer pendant environ 10 min. Le changement de couleur indique que le distillat est maintenant dans le flacon avec du n-pentane.
   6. Concentrez l’extrait de n-pentane sous pression réduite (70 - 73 mmHg) sur un évaporateur rotatif à température ambiante. Transférez l’extrait partiellement concentré dans un flacon et concentrez-le à ≈100 μL sous un courant d’azote dans un évaporateur à purge à température ambiante. Après l’extraction, conserver les échantillons à -20 °C jusqu’à l’analyse.
      REMARQUE : L’extrait ne doit pas être concentré à sec car cela induirait une perte de composés volatils.
3. Échantillonnage de l’espace de tête avec une fibre enrobée
   1. La configuration de microextraction en phase solide (SPME) implique a) un support SPME à commande manuelle, b) une fibre enrobée et c) un support approprié pour soutenir le support SPME (Figure 4C). Pour le protocole actuel, utilisez un système manuel d’espace de tête SPME dans le flacon avec une fibre enrobée de polydiméthylsiloxane (PDMS) de 100 μM pour piéger les substances volatiles.
      REMARQUE : D’autres fibres disponibles dans le commerce ont des revêtements avec des caractéristiques chimiques différentes et doivent être choisies en fonction de l’effet souhaité.
   2. Conditionnez thermiquement chaque fibre SPME jusqu’à 20 min à 250 °C avant de l’utiliser, conformément aux recommandations du fabricant.
   3. Insérez le matériau en pin, ou la partie en pin, dans un flacon en verre transparent et scellez-le avec un bouchon à vis à trous avec une doublure en polytétrafluoroéthylène (PTFE) (septum). Le matériau doit être à au moins 2 à 3 cm du haut du flacon, afin que la fibre ne touche pas l’échantillon.
   4. Effectuez simultanément des expériences de contrôle à l’aide de fibres SPME en échantillonnant des flacons vides pour identifier les contaminants du système ou pour confirmer l’absence de transfert dû à l’utilisation répétée des fibres SPME.
   5. Conservez le pin à l’intérieur du flacon pendant 1 h avant de recueillir les substances volatiles pour l’équilibre de l’atmosphère.
      REMARQUE : Les tests avec SPME peuvent être exécutés à température ambiante ou à une température réglable en logeant les flacons dans un support et en les insérant dans un bain Marie.
   6. Ajustez la profondeur de l’aiguille de perçage du septum à partir du support SPME pour percer le septum mais pour ne pas entrer en contact avec le matériau lorsque la fibre est exposée.
   7. Une fois la fibre retirée, insérez l’aiguille du support dans la doublure en PTFE. Appuyez sur le piston pour exposer la fibre. Tournez le piston dans le sens des aiguilles d’une montre et maintenez la vis de fixation sur le côté horizontal gauche de la rainure en Z²⁴. Exposez la fibre pendant 1 h.
   8. Rétractez la fibre en tournant le piston dans le sens inverse des aiguilles d’une montre jusqu’à ce que le piston atteigne le haut de la rainure en Z. Les volatiles collectés sont maintenant prêts pour l’analyse directe GC et/ou GC-MS.
      REMARQUE : Si nécessaire, les fibres peuvent être stockées à température ambiante avant l’analyse, mais pas plus d’une semaine.
4. Piégeage de l’espace de tête avec des tubes compacts
   1. Préparez un dispositif de piégeage des substances volatiles de l’espace de tête à l’aide de pièges en acier inoxydable garnis composés a) d’un système de pompage à débit massique, b) de tubes en PTFE, c) de filtres à air à charbon actif, d) de tubes remplis de polymère en résine poreuse et e) de sacs en verrerie ou en polyéthylène téréphtalate (sacs de cuisson) (figure 4D)²⁵.
   2. Gardez le matériau en pin dans la verrerie couverte ou à l’intérieur de sacs en PET pour accumuler les substances volatiles de l’espace de tête.
      REMARQUE : Sachez que les substances volatiles provenant du plastique courant sont abondantes et peuvent être détectées en grandes quantités par GC-MS.
   3. Pour un système en boucle fermée, connectez le circuit comme suit : a) la sortie de la pompe au tube en PTFE, b) le tube en PTFE aux filtres à air à charbon actif, c) des filtres à air à un tube supplémentaire reliant la verrerie ou les sacs en PET avec le matériau en pin, d) le tube garni à la sortie de la verrerie ou du sac en PET, e) un tube PTFE supplémentaire de la sortie du tube en acier inoxydable à l’entrée de la pompe à débit massique²².
      REMARQUE : Les tubes en acier inoxydable poreux remplis de polymère doivent être conditionnés thermiquement dans l’unité de désorption thermique conformément aux recommandations du fabricant, par exemple, jusqu’à 15 min à 100 °C, avant utilisation. Attention, les tubes ont un sens d’écoulement qu’il faut respecter.
   4. Recueillir les substances volatiles en pompant 100 L d’air filtré à travers le système de pin à raison de 0,6 L par minute, à l’aide de la pompe à débit massique pour contrôler la quantité et le taux d’air filtré.
      REMARQUE : La quantité et/ou le débit d’air de l’espace de tête qui circule dans la colonne peuvent influencer la quantité de substances volatiles piégées et, par conséquent, le chromatogramme obtenu.
   5. Après la collecte des substances volatiles, fermez les tubes emballés aux deux extrémités avec des bouchons de stockage hermétiques. Conserver à température ambiante (pour 1 semaine maximum) et analyser dès que possible, car les volatils peuvent se dégrader ou s’échapper.
   6. Pour le lavage, rincez tous les tubes et verreries en PTFE avec de l’éthanol à 70 % et faites-les chauffer dans un four à 230 °C pendant au moins 2 h²⁵.

6. Analyse des profils volatils

1. Effectuer l’analyse des profils volatils par chromatographie en phase gazeuse couplée spectrométrie de masse (GC-MS), ou régulièrement par chromatographie en phase gazeuse avec détection par ionisation de flamme (GC-FID) pour quantifier les composés volatils précédemment identifiés.
   REMARQUE : La description des méthodes d’analyse par le GC-FID et le GC-MS est exhaustive et dépasse l’objectif du présent travail. Il est conseillé au lecteur d’utiliser des procédures ou des normes en laboratoire, telles que l’ISO 7609²⁶, qui fournissent des conditions de fonctionnement pertinentes pour la quantification des constituants individuels et des données de la littérature sur la comparaison de deux méthodes d’analyse²⁷.
2. Utilisez des analytes purs ou transportés dans un solvant, par exemple le n-pentane ou le n-hexane, et directement injectés ou adsorbés dans une fibre, par exemple le SPME et désorbés directement dans l’injecteur du chromatographe ou en utilisant une unité de désorption thermique (TD) reliée à l’unité GC.
   REMARQUE : Malgré leur sensibilité accrue, leur résolution plus élevée et leur temps d’analyse plus court, les colonnes capillaires ont une faible capacité d’échantillonnage. Ainsi, bien que presque toutes les conditions de fonctionnement puissent être similaires, le type d’analyte (pur, en solvant, SPME, etc.) peut nécessiter des procédures d’injection différentes fractionnées / sans fractionnement.
3. Effectuer l’identification des composants volatils en comparant leurs indices de rétention, évalués conformément à l’ISO 7609, avec les spectres GC-MS d’une bibliothèque créée en laboratoire à partir d’échantillons de référence dont l’identité du composant a été établie par RI, GC-MS et ¹³C-RMN, de composés synthétisés et isolés en laboratoire, et d’étalons disponibles dans le commerce, ou, à défaut, de bibliothèques de spectres de masse disponibles dans le commerce.
4. Exprimer les résultats à l’aide d’une représentation graphique (chromatogramme) et d’un profil chromatographique qui répertorie les quantités relatives de tous les composés identifiés dans l’échantillon, avec leur ordre d’élution indiqué par leurs indices de rétention dans la colonne appropriée utilisée.
5. Pour un grand nombre d’échantillons, effectuer une évaluation d’analyse statistique appropriée basée sur la composition chimique pour l’interprétation de la disposition des échantillons (regroupements et/ou séparations).

Résultats

Le néant du népht se reproduit rapidement dans des conditions optimales, et les temps de génération peuvent être aussi bas que 4 jours, chaque femelle pondant environ 80 œufs au cours de^{sa vie.} En utilisant la méthodologie décrite ci-dessus, de grandes quantités de PWN peuvent être obtenues en fonction de la croissance fongique. Au cours d’une période de croissance de 8 jours, les nombres de population des nécrophages peuvent être multipliés par 10...

Discussion

Le protocole présenté ici décrit une méthodologie améliorée pour analyser les composés volatils du pin maritime infecté par le PWN, où la variabilité environnementale et génétique est réduite et n’influence pas les résultats. À l’aide de lignées pures de génotypes in vitro de pin maritime, les substances volatiles extraites et émises peuvent être analysées en tant que réponse de l’hôte à l’une des menaces biotiques les plus dommageables pour les fo...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
38 mesh test sieve	Retsch	60.131.000038
6-Benzylaminopurine (6-BAP)	Duchefa Biochemie	B0904
Charcoal activated	Duchefa Biochemie	C1302
Clevenger apparatus	WINZER Laborglastechnik	25-000-02
Hydrogen peroxide solution	Sigma-Aldrich	H1009-500ML
Indole-3-butyric acid (IBA)	Duchefa Biochemie	I0902
Likens-Nickerson apparatus	VitriLab LDA.	c/IN29/32
Microbox round containers	Sac O2	O118/80+OD118
n-Pentane	Sigma-Aldrich	1.00882
PARAFILM M sealing film	BRAND	HS234526B-1EA
Phyto agar	Duchefa Biochemie	P1003
Potato Dextrose Agar	BD DIFCO	213400
Scalpel blade no. 24	Romed Holland	BLADE24
Schenk & Hildebrandt Basal salt medium	Duchefa Biochemie	S0225
Schenk & Hildebrandt vitamin mixture	Duchefa Biochemie	S0411
SPME fiber assembly Polydimethylsiloxane (PDMS)	Supelco	57300-U
SPME Fiber Holder	Supelco	57330-U
Sucrose	Duchefa Biochemie	S0809
Tenax TA- stainless steel tubes- conditioned + capped	Markes International	C1-AAXX-5003