Infektion von In vivo und In Vitro Kiefern mit dem Kiefernfadenwurm Bursaphelenchus xylophilus und Isolierung von induzierten flüchtigen Bestandteilen

Zusammenfassung

Das Protokoll beschreibt die in vivo und in vitro Kiefernholznematodeninfektion von Pinus pinaster und deren Volatilomanalyse mittels Gaschromatographie (GC) und GC gekoppelt mit Massenspektrometrie (GC-MS).

Zusammenfassung

Der Kiefernfadenwurm (PWN) ist ein Phytoparasit, der bei Nadelbaumarten die Kiefernwelkekrankheit (PWD) verursacht. Dieser pflanzenparasitäre Nematode hat stark zur Abholzung von Kiefernwäldern in asiatischen Ländern wie Japan, China und Korea beigetragen. In den letzten zwei Jahrzehnten waren in Europa Portugal und Spanien stark betroffen. Die Erforschung der Mechanismen der Infektion und/oder des Fortschreitens des PWD-Virus bei anfälligen Wirtsarten stützt sich auf die kontrollierte Infektion von Kiefernsetzlingen unter Gewächshausbedingungen. Diese Technik ist aufwendig und mobilisiert erhebliche wirtschaftliche und personelle Ressourcen. Darüber hinaus kann sie anfällig für Variabilität sein, die sich aus der genetischen Vielfalt einiger Kiefernarten, aber auch aus der Einwirkung externer Faktoren ergibt. Als Alternative bieten In-vitro-Cokulturen von Kiefern mit Kiefernwurm ein vorteilhafteres System zur Untersuchung biochemischer Veränderungen, da sie a) die Kontrolle einzelner Umwelt- oder Ernährungsvariablen ermöglichen, b) weniger Platz beanspruchen, c) weniger Zeit für die Gewinnung benötigen und d) frei von Kontamination oder genetischer Variation des Wirts sind. Das folgende Protokoll beschreibt die standardmäßige in vivo PWN-Infektion von Pinus pinaster, der Seekiefer, und die Etablierung der neuartigen in vitro Co-Kulturen von Kiefernsprossen mit dem PWN als verbesserte Methodik zur Untersuchung dieses Phytoparasiteneinflusses auf flüchtige Bestandteile der Kiefer. PWN-induzierte flüchtige Bestandteile werden aus in vivo und in vitro infizierten Kiefern durch Hydrodestillation und Destillationsextraktion extrahiert, und die emittierten flüchtigen Bestandteile werden durch Festphasen-Mikroextraktion (SPME) unter Verwendung von Faser- oder Packungskolonnentechniken aufgefangen.

Einleitung

Der Kiefernfadenwurm (PWN), Bursaphelenchus xylophilus (Steiner & Bührer 1934) Nickle 1970, ist ein pflanzenparasitärer Fadenwurm, der hauptsächlich Pinus-Arten parasitiert. Dieser Phytoparasit wird von Insekten der Gattung Monochamus während der Reifung des Insekts in Bäume anfälliger Kiefernarten übertragen. Der Kiefernfadenschein tötet den Baum, indem er seine Harzkanäle angreift und den Harzfluss verringert und sein Gefäßgewebe schädigt, was zu Unterbrechungen in der Wassersäule führt. Wassermangel in den Baumkronen führt zu den ersten sichtbaren Symptomen der Kiefernwelkekrankheit (PWD), d.h. die Kiefernnadeln werden nach Beendigung der Photosynthese chlorotisch und hängen durch Austrocknung herab. Die Kiefer reagiert im Allgemeinen auf biotischen und abiotischen Stress durch die Produktion von Harz und flüchtigen Verbindungen¹. Daher ist es wichtig, die Mechanismen der Kiefernabwehr zu verstehen, um die spezifischen Auswirkungen von Kiefernbefall zu bestimmen und alternative Methoden zur Schädlingsbekämpfung zu finden².

Derzeit sind Experimente unter Feldbedingungen abhängig von der Verfügbarkeit infizierter Kiefern, der Bestätigung einer PWN-Infektion und unterschiedlichen Umweltbedingungen. Unter Gewächshausbedingungen können diese Parameter leichter kontrolliert werden; Die genetische Vielfalt des Wirts wird jedoch zu einer starken Quelle der Variabilität³. In einer Studie über die Resistenzreaktion von Pinus pinaster wurde beispielsweise die Produktion des Terpens Limonen und der Harzsäuren mit einer PWN-Infektion in Verbindung^{gebracht 4}. Aufgrund der geringen Anzahl von Proben und der Variabilität der natürlichen Bedingungen wurden jedoch nur bei der Hälfte der Proben nachweisbare Veränderungen registriert. In einer anderen Studie mit im Gewächshaus gezüchteten Kiefernsetzlingen führte die natürliche genetische Vielfalt der Kiefer zu einer großen Variabilität der extrahierten flüchtigen Bestandteile, obwohl die Umweltbedingungen leichter zu kontrollieren^{waren 5}. Da krankheitsinduzierte flüchtige Bestandteile der Kiefer stark durch umweltbedingte und genetische Variationen beeinflusst werden können, ist der Rückgriff auf In-vitro-Sprosskulturen eine gute Alternative für Studien zur chemischen und biochemischen Reaktion von Kieferngewebe auf eine Kiefernfadenwurzinfektion ^5,6. Durch die Vermehrung eines Pflanzengenotyps in vitro kann sein Erbgut erhalten und unbegrenzt kloniert werden, was dazu führt, dass eine größere Anzahl genetisch identischer Individuen auf weniger Raum und in kürzerer Zeit als unter In-vivo-Bedingungen etabliert wird. Diese Kulturen sind ein einfach funktionierendes System unter leicht manipulierbaren Ernährungs- und Umweltbedingungen, so dass sie gegenüber herkömmlichen Systemen zusätzliche Vorteile bei der Bewertung der Produktion und Emission flüchtiger Stoffe bieten ^7,8. Diese Systeme sind besonders vorteilhaft für die Forschung an Gehölzen, die meist erhebliche Ressourcen benötigen, d. h. Zielbäume befinden sich manchmal an schwer zugänglichen Standorten, erfordern teure Geräte, engagierte Arbeitskräfte und längere Analysezeiträume⁸. In vitro ermöglichen Co-Kulturen von Kiefern mit dem Kiefernfadenwurm die Beurteilung der metabolischen Wechselwirkungen zwischen dem Fadenwurm und der Pflanze in verschiedenen Stadien⁹. Für die Analyse flüchtiger Bestandteile ist dies sehr wichtig, da die Profilerstellungstechniken sehr genau geworden sind und kleinste Variationen bei der Probenahme zu erheblichen Änderungen der flüchtigen Profile führen können. Die Gaschromatographie in Verbindung mit der Massenspektrometrie (GC-MS) ist eine leistungsfähige Technik für die Analyse flüchtiger Bestandteile und ermöglicht eine schnelle und optimierte Profilierung von flüchtigen Bestandteilen¹⁰. Das hier vorgestellte Protokoll beschreibt Techniken zur Infektion von in vivo Kiefernsämlingen unter Gewächshausbedingungen und in vitro Sprosskulturen von genetisch identischen Kiefern, die für die Extraktion und Profilierung von induzierten flüchtigen Bestandteilen optimiert sind.

Protokoll

1. In-vitro-Anbau von Kiefernholznematoden

HINWEIS: Kiefernnematoden werden gezüchtet, indem sie sich von dem Pilzmyzel eines nicht sporulierenden Stammes von Botrytis cinerea (de Bary) Whetzel¹¹ ernähren.

1. Für routinemäßige Subkulturen wird ein Kulturpfropfen (0,5 cm Durchmesser) vom äußersten Rand der Pilzkolonie auf eine Platte mit sterilem Kartoffel-Dextrose-Agar (PDA) übertragen und 7 bis 10 Tage lang bei 25 ± 1 °C aufbewahrt oder bis die Pilzkolonie den Rand der Platte erreicht.
   HINWEIS: Andere Arten von allgemeinem Pilzwachstumsmedium können für das Pilzwachstum verwendet werden.
2. Um größere Mengen an Kiefernwurmarten zu erhalten, verwenden Sie B. cinerea , das in vitro auf dampfsterilisierten, hydratisierten, zertifizierten Bio-Gerstenkörnern (Hordeum vulgare L.) angebaut wird. 15 g Getreide auf 15 mL Reinstwasser in abgedeckte 250 mL Erlenmeyerkolben geben und sterilisieren. Anschließend mit einem B. cinerea-Kulturpfropfen inokulieren und 7 bis 10 Tage lang bei 25 ± 1 °C halten oder bis die Oberfläche des Getreides vollständig besiedelt ist¹².
   HINWEIS: Nematoden für Forschungszwecke können bei den nationalen Referenzlaboratorien für pflanzenparasitäre Nematoden angefordert werden.
3. Initiieren Sie Kiefernfadenwurmkulturen durch Beimpfung von In-vitro-Kulturen von B. cinerea mit einer wässrigen Kiefernfadenwund-Suspension (mit mindestens 20 männlichen und 30 weiblichen Sorten) und halten Sie sie unter den zuvor beschriebenen Bedingungen 7 bis 10 Tage lang im Dunkeln oder bis die Pilzkolonie vollständig aufgezehrt ist und die Kiefernfadenwurzpopulation beginnt, die Wände der Platte oder des Kolbens zu erklimmen (Abbildung 1). Verschließen Sie die Platten oder Kolben mit Plastikfolie, um ein Austrocknen zu vermeiden.
   HINWEIS: Weibchen können durch den Vulvalappen, den langen postuterinen Sack und einen im Allgemeinen runden Schwanzende unterschieden werden; Die Männchen haben einen ventral gebogenen, spitzen Schwanzende mit charakteristischen Stacheln¹³. Beim Pipettieren von PWN-Suspensionen ist die Pilzkolonie so zu streifen, dass die pipettierte Suspension keine Tröpfchen auf der Pilzoberfläche bildet und die PWNs durch die Oberflächenspannung einfängt.
4. Kiefernfadenschweifen werden isoliert, indem die Wände des Kolbens mit Leitungswasser abgespült, der Inhalt auf ein Papiertuch in einem Baermann-Trichter oder einer Schale gegossen und mit Wasser¹⁴ untergetaucht wird. Nach 24 bis 48 h wären die lebenden Nematoden aus dem infizierten Material in das Wasser übergegangen. Sie werden durch Sieben mit einem 38-μm-Sieb¹⁵ zurückgewonnen. Waschen Sie die angesammelten Kiefernwächse in einen Behälter mit Leitungswasser.
   HINWEIS: Jegliches Material, das mit dem Kiefernfadenschwamm in Berührung kommt, muss ordnungsgemäß dekontaminiert werden, da es sich um einen Quarantäneorganismus handelt. Ein Eintauchen in Ethanol für 10 bis 20 min ist in der Regel ausreichend. Ausgestoßene wässrige Suspensionen müssen sterilisiert oder mindestens 35 Minuten lang auf 60 °C erhitzt werden.
5. Die wässrige Suspension, die den Kiefernfadenwurm enthält, sofort verwenden oder für eine längere Lagerzeit (bis zu 2 Monate) bei 11 °C aufbewahren.

2. Sterilisation von Nematoden im gemischten Lebensstadium

1. In einer Strömungshaube wird ein Volumen der Kiefernfadendruck-Suspension mit etwa 5000 Kiefernfadenkiefern in ein steriles 38-μm-Maschensieb pipetiert und mit sterilem Wasser gewaschen.
   HINWEIS: Zählen Sie Nematoden unter einem binokularen Mikroskop (40x).
2. Tauchen Sie die untere Hälfte des Siebs mit den Kiefernkiefern in eine 20%ige Wasserstoffperoxidlösung (H₂O₂) und mischen Sie sie 15 Minuten lang manuell.
3. Waschen Sie die sterilen Kiefern, indem Sie steriles Wasser durch das Sieb geben. Wiederholen Sie diesen Schritt 3x. Kippen Sie bei der letzten Wäsche das Sieb so, dass sich der Kiefernschwamm am Siebrand sammelt. Die sterile Nematodensuspension wird durch Pipettieren von 1 ml sterilem Wasser in den Siebrand zurückgewonnen und bei 11 °C gelagert oder sofort verwendet.
   HINWEIS: Der Erfolg der Sterilisation kann beurteilt werden, indem ein 100 μl Aliquot der PWN-Suspension in einem PDA-Medium plattiert und etwa 1 Woche lang regelmäßig auf Kontaminationen überwacht wird.

3. Infektion von in vivo Pinus pinaster-Sämlingen

HINWEIS: Inokulationsversuche werden an ≥ 2-jährigen P. pinaster-Sämlingen durchgeführt. Bäume können im zertifizierten gewerblichen Fachhandel erworben werden, aber auch im Gewächshaus aus zertifiziertem Saatgut gezogen werden.

1. Entnehmen Sie das Kiefernfadenwurm-Inokulum wie in Schritt 1 beschrieben und setzen Sie die Suspensionen von gemischten Kiefernsticks im Lebensstadium auf 1000 PWNs/ml, indem Sie der Suspension Wasser hinzufügen oder warten, bis sich Nematoden abgesetzt haben (ca. 60 min) und das Volumen durch Dekantieren des Oberflächenwassers verringern. Führen Sie die Zählung bei Raumtemperatur in einem konkaven Objektträger unter dem Binokularmikroskop bei 40x durch.
2. Um mit der Inokulation zu beginnen, werden die Nadeln von Hand aus einem Abschnitt unterhalb der oberen 5 cm des Kiefernstamms entfernt und mit einem sterilisierten Skalpell¹⁶ ein oberflächlicher Längsschnitt (0,5 bis 1 cm Länge) vorgenommen.
   HINWEIS: Der Schnitt wird durchgeführt, um dem Fadenwurm Zugang zum inneren Kieferngewebe zu verschaffen.
3. Legen Sie ein Stück sterilisierte Watte in die Wundzone, um 0,5 ml der pipettierten PWN-Suspension aufzunehmen, und fixieren Sie es mit einem transparenten Streifen, um die Feuchtigkeit zu erhalten.
   HINWEIS: Mischen Sie die PWN-Suspension zwischen jeder Impfung kräftig, da sich Nematoden schnell absetzen. Wenn die Suspension an der Impfstelle trocknet, kann eine Nematodeninfektion erfolglos sein, also decken Sie die feuchte Baumwolle ausreichend ab.
4. Bei Kontrollkiefern die PWN-Suspension durch steriles Wasser ersetzen.
5. Verfolgen Sie das Fortschreiten der PWD regelmäßig und bewerten Sie die Symptomatik, indem Sie den Prozentsatz der verfärbten und welken Nadeln quantifizieren. Punktzahl 0 für keine äußeren Symptome, 1 für bis zu 25 % Nadelverfärbung, 2 für 25 % bis 50 % der Nadelverfärbung, 3 für 50 % bis 75 % der Nadelverfärbung und 4 für Kiefern mit vollständig braunen Nadeln (Abbildung 2).
6. Halten Sie das Gewächshaus unter feuchten Bedingungen (60 %-80 %) und gießen Sie häufig (halten Sie es bei 70 % der maximalen Wasserspeicherkapazität des Bodens), um extreme Temperaturen zu vermeiden, da Nematoden unterhalb von 10 °C metabolisch inaktiv werden und die Entwicklung über 30 °C beeinträchtigt werden kann.
7. 20 Tage nach der Inokulation das Pflanzenmaterial für die Extraktion flüchtiger Bestandteile ernten, indem die Sämlinge an der Basis des Stängels abgeschnitten und in braunen Papiertüten (-20 °C) eingefroren werden. Bei emittierten flüchtigen Bestandteilen (SMPE-Fasern oder Packungsröhrchen) sind die Kiefernsämlinge sofort bei Raumtemperatur ^5,17 zu beproben.

4. Etablierung und Infektion von in vitro Kiefernsprossenkulturen

1. Waschen Sie zertifizierte P. pinaster-Samen vor der Oberflächensterilisation in fließendem Leitungswasser, um die größten Ablagerungen zu entfernen, und dann mit einer üblichen Waschmittellösung (1 Tropfen pro 40 ml Wasser) unter kräftigem Rühren, um die feineren Ablagerungen zu waschen.
2. Beginnen Sie die Sterilisation der Saatgutoberfläche in einer Fließhaube, indem Sie eine handelsübliche Bleichlösung (1:4, handelsübliches Bleichmittel in Leitungswasser) hinzufügen, bis die gewaschenen Samen bedeckt sind, und 15 Minuten lang kräftig mischen. Entsorgen Sie die Bleichlösung und spülen Sie die Samen 3x mit sterilisiertem Leitungswasser aus.
3. Tauchen Sie die Samen 15 Minuten lang unter kräftigem Rühren in eine Ethanollösung (80%, v/v), entsorgen Sie das Ethanol und waschen Sie es 3x mit sterilisiertem Reinstwasser.
4. Für die Kiefernkekewimung brechen Sie die sterilisierten Samenschalen mit einer sterilen mechanischen Drehmaschine in einer Strömungshaube auf, isolieren Sie die Pinienkerne und legen Sie sie in einen geschlossenen Behälter mit sterilisiertem Nassfilterpapier, um die Pinienkerne über Nacht zu hydratisieren⁶.
5. Stratifizieren Sie hydratisierte Pinienkerne 7 Tage lang bei 4 °C, um die Ruhephase zu unterbrechen und die Keimung zu synchronisieren, und halten Sie sie dann bis zur Keimung dunkel bei 25 °C.
   HINWEIS: Der Schritt der Schichtung ist optional.
6. Übertragen Sie die aseptisch gekeimten Kiefern in den geschlossenen Behälter in eine 16 h leichte Photoperiode bei 24 °C/18 °C Thermoperiode und halten Sie sie 2 Wochen lang oder bis sich der Hauptstamm zu entwickeln beginnt.
7. Schneiden Sie in der Fließhaube den oberirdischen Teil des Sämlings oberhalb der Wurzel mit einem Skalpell ab und geben Sie es in ein sterilisiertes Schenk and Hildebrandt (SH)^{18-Kulturmedium} (pH = 5,8), das mit 30 g/l Saccharose, 8 g/l Agar, 0,5 mg/l 6-Benzylaminopurin (BAP, ein Cytokinin) und 0,1 mg/l Indol-3-buttersäure (IBA, ein Auxin)⁶, um die Vermehrung der Mikrosprossen zu induzieren. Bewahren Sie die Kulturen unter den oben beschriebenen Bedingungen in einer In-vitro-Kulturwachstumskammer auf.
8. In der Strömungshaube wird die Subkultur periodisch (ca. 4 Wochen) durchgeführt, indem das Kallusgewebe an der Basis des Sprosses (Teil, der mit dem Kulturmedium in Berührung kommt) mit einem sterilen Skalpell abgeschnitten und der Sprosscluster mit einer sterilen Pinzette auf ein frisches Multiplikationskulturmedium übertragen wird.
9. Zur Verlängerung des Mikrostamms werden die Mikrosprossen auf das oben beschriebene SH-Kulturmedium übertragen, das jedoch 3 g/l Aktivkohle anstelle von Phytohormonen enthält.
   HINWEIS: Aktivkohle adsorbiert Giftstoffe und verhindert eine übermäßige induzierte Ansammlung von Phytohormonen auf dem geschnittenen Gewebe¹⁹.
10. Bei einer PWN-Infektion werden längliche Triebe ohne Phytohormone oder Aktivkohle in ein SH-Kulturmedium überführt und 100-150 sterilisierte PWNs aus dem gemischten Lebensstadium am unteren Ende des Mikrosprosses hinzugefügt. Halten Sie die oben beschriebenen Bedingungen aufrecht, bis sich die Symptome einer Behinderung bemerkbar machen (Abbildung 3)⁶.
11. Zur Ernte von Pflanzenmaterial für die Extraktion flüchtiger Bestandteile sind In-vitro-Explantate sofort zu verwenden oder bis zur Analyse bei -20 °C einzufrieren. Bei emittierten flüchtigen Bestandteilen (SMPE-Fasern oder gepackte Röhrchen) ist die Mikrosproßkästen sofort zu analysieren.

5. Isolierung flüchtiger Verbindungen

HINWEIS: Die Isolierung von flüchtigen Bestandteilen kann durch verschiedene Techniken erfolgen. Hier erfolgt die Extraktion flüchtiger Stoffe durch Hydrodestillation unter Verwendung einer Clevenger-Vorrichtung²⁰, die Destillationsextraktion unter Verwendung einer Likens-Nickerson-Vorrichtung²¹ und das Einfangen von flüchtigen Bestandteilen im Kopfraum durch Festphasen-Mikroextraktion (SPME) unter Verwendung von beschichteten Fasern oder gepackten Röhrchen (poröses Polymersorbens)²².

1. Hydrodestillation
   1. Verwenden Sie ein Clevenger-Gerät zur Isolierung von ätherischen Ölen. Das Destillationssystem besteht aus a) dem Clevenger-Apparat, b) einem Rundkolben oder einem Erlenmeyer zum Halten des Wassers und des Kiefernmaterials, c) einer geeigneten Heizvorrichtung und d) einem Stützrahmen, um das System an Ort und Stelle zu halten (Abbildung 4A).
   2. Reinigen Sie die Gläser vor dem Gebrauch gründlich. Verwenden Sie Laborrahmenklemmen, um das Clevenger-Gerät am Gitterrahmen zu befestigen. Kühlen Sie den Systemkondensator durch Wasserumwälzung oder verwenden Sie einen gekühlten Umwälzthermostat, falls verfügbar.
   3. Registrieren Sie das Gewicht des Zirbentriebs und geben Sie es in den Rundkolben oder Erlenmeyerkolben. Passe die Wassermenge so an, dass der Behälter nicht mehr als halb voll ist.
   4. Positionieren Sie das Heizgerät unter dem Kolben, prüfen Sie, ob es keine Lecks gibt, und stellen Sie sicher, dass sich alle Teile des Systems in der richtigen Position befinden und am Stützrahmen befestigt sind.
      HINWEIS: Die Mattglas-Verbindungsteile des Clevenger und des Kolbens sollten vor dem Anschluss gründlich gereinigt, entfettet und getrocknet werden. Verwenden Sie dazu ein leicht mit Aceton angefeuchtetes Stück Filterpapier. In diesen Teilen sollte kein Fett verwendet werden.
   5. Führen Sie Wasser durch den Einfülltrichter ein, der sich im Rücklauf-Diagonalrohr im mittleren Teil des Clevenger-Geräts befindet. Die Position des Dreiwegehahns ist so einzustellen, dass das Wasser gleichmäßig in den beiden Rohren (diagonal und abgestuft) fließt, bis der Kolben gefüllt ist, kurz bevor er aus dem diagonalen Rücklaufrohr in den Kolben fließt (siehe Abbildung 4).
   6. Schalten Sie die Wärmequelle ein und stellen Sie sie so ein, dass das Wasser mit einer Destillationsrate von 2 - 3 mL/min zum Kochen gebracht wird.
   7. Beginnen Sie die Destillationszeit, wenn der erste Tropfen destillierten Wassers in das Messrohr auf der rechten Seite des Clevenger-Geräts fällt. Die durchschnittliche Destillationszeit beträgt 3 h²³, je nach den spezifischen Anforderungen können jedoch kürzere oder längere Destillationszeiten verwendet werden. Ätherische Öle befinden sich in der Regel in der überstehenden Flüssigkeit, da sie in der Regel leichter sind als das darunter liegende destillierte aromatische Wasser (Hydrolat).
      ACHTUNG: Wenn die Destillation läuft, fühlt sich das Clevenger-Gerät heiß an.
   8. Sobald die Destillationszeit abgelaufen ist, stoppen Sie das Erhitzen und lassen Sie es etwa 10 Minuten stehen, damit das Destillieren und Kochen gestoppt werden kann. Nach 10 Minuten den Hahn im Uhrzeigersinn öffnen, um das Hydrolat abfließen zu lassen, bis das ätherische Öl den abgestuften Teil erreicht. Lesen Sie die Menge des isolierten ätherischen Öls ab. Berechnen Sie die Ausbeute in mL/g (Frisch- oder Trockengewicht), ausgedrückt in % (% v/w).
   9. Bei ätherischen Ölen mit einem Volumen von weniger als 0,05 ml, der niedrigsten Teilung im Messrohr, kann die Ausbeute nicht bestimmt werden. Um das ätherische Öl zurückzugewinnen, verwenden Sie destilliertes n-Pentan, um das Clevenger-Gerät zu spülen.
   10. Um das ätherische Öl mit destilliertem n-Pentan zurückzugewinnen, warten Sie nach Beendigung der Destillation etwa 10 bis 15 Minuten und öffnen Sie den Dreiwegehahn gegen den Uhrzeigersinn, so dass das Hydrolat aus dem Rücklauf-Diagonalrohr bis knapp unter den Einfülltrichter fließt. Geben Sie mit einer sauberen Pipette destilliertes n-Pentan in den Einfülltrichter bis zur oberen linken Seite des diagonalen Rücklaufrohrs. Vermeiden Sie es, den Einfülltrichter zu berühren, um Kreuzkontaminationen zu vermeiden.
   11. Geben Sie mit einer Waschflasche aus destilliertem Wasser Wasser in den Einfülltrichter. n-Pentan fließt in den Destillationskolben und verdampft mit der Restwärme des Abkochwassers. Auf diese Weise durchläuft es das System, löst sich auf und zieht die flüchtigen Bestandteile an die Oberfläche des Hydrolats im Messrohr. Öffnen Sie den Drei-Wege-Tap im Uhrzeigersinn in die normale Position.
   12. Gehen Sie wie in 5.1.8 vor. um das in n-Pentan gelöste ätherische Öl zu sammeln.
   13. Das Gemisch aus ätherischem Öl und n-Pentan wird bei Raumtemperatur unter Stickstofffluss mit einem Abschlämmverdampfersystem auf ein Mindestvolumen von etwa 100 μl konzentriert. Bis zur Analyse bei -20 °C halten.
       HINWEIS: Nicht bis zum Trocknen konzentrieren, um den Verlust flüchtiger Verbindungen zu vermeiden.
2. Destillation-Extraktion
   1. Verwenden Sie das Likens-Nickerson-Gerät, um flüchtige Bestandteile aus Pflanzen zu extrahieren. Das Destillations-Extraktions-System besteht aus a) dem Likens-Nickerson-Gerät, b) einem Kolben mit rundem Boden zum Halten von Wasser und dem Kiefernmaterial (rechter Seitenarm der Destillationseinheit) und einem weiteren zum Halten eines nicht mischbaren organischen Lösungsmittels, wie z. B. destilliertem n-Pentan (linker Seitenarm der Destillationseinheit), c) zwei geeigneten Heizvorrichtungen, d) einem Kondensator, und e) einen Stützrahmen, um das System zu halten (Abbildung 4B).
      HINWEIS: Verwenden Sie im Labor destilliertes n-Pentan, um eine Kontamination der Probe mit lösungsmittelzugesetzten Stabilisatoren zu vermeiden.
   2. Beginnen Sie mit der Zirkulation von Wasser im gesicherten Kondensator oder verwenden Sie eine gekühlte Umwälzpumpe, falls verfügbar.
   3. Verwenden Sie Laborrahmenklemmen, um die Destillations-Extraktionseinheit am Gitterrahmen zu befestigen. Befüllen Sie den Rundkolben mit dem zu extrahierenden Kiefernmaterial und fügen Sie Wasser bis zur Hälfte hinzu. Der kleinere 100-ml-Rundkolben sollte zur Hälfte mit destilliertem n-Pentan gefüllt sein.
      HINWEIS: Vor dem Anschließen müssen die Mattglas-Verbindungsteile der Glaskomponenten gut gereinigt, entfettet und getrocknet werden. Zur Reinigung kann ein kurz mit Aceton benetztes Stück Filterpapier verwendet werden.
   4. Die Heizhauben unter jedem Kolben anbringen. Stellen Sie sicher, dass keine Lecks vorhanden sind und dass alle Komponenten des Systems korrekt positioniert und am Laborgitterrahmen befestigt sind. Schalten Sie die Wärmequellen ein und stellen Sie sie auf den jeweiligen Siedepunkt ein. Wasser sollte mit einer Destillationsgeschwindigkeit von 2-3 ml/min sieden.
      ACHTUNG: Während des Prozesses der Destillation-Extraktion fühlt sich das Likens-Nickerson-Gerät heiß an.
   5. Sobald die Destillationszeit abgelaufen ist, wird das Erhitzen des Kolbens mit Kiefernmaterial gestoppt und n-Pentan allein 10 Minuten lang destilliert. Nachdem sich n-Pentan in eine transparente Flüssigkeit verwandelt hat, stoppen Sie das Erhitzen und lassen Sie es ca. 10 min stehen. Die Farbänderung zeigt an, dass sich das Destillat nun mit n-Pentan im Kolben befindet.
   6. Konzentrieren Sie den n-Pentan-Extrakt unter reduziertem Druck (70 - 73 mmHg) auf einem Rotationsverdampfer bei Raumtemperatur. Den teilweise konzentrierten Extrakt in ein Fläschchen umfüllen und unter einem Stickstoffstrom in einem Abschlämmverdampfer bei Raumtemperatur auf ≈100 μl konzentrieren. Bewahren Sie die Proben nach der Extraktion bis zur Analyse bei -20 °C auf.
      HINWEIS: Der Extrakt sollte nicht bis zur Trockenheit konzentriert werden, da dies zum Verlust flüchtiger Verbindungen führt.
3. Headspace-Probenahme mit einer beschichteten Faser
   1. Der Aufbau der Festphasen-Mikroextraktion (SPME) umfasst a) einen manuell betriebenen SPME-Halter, b) eine beschichtete Faser und c) einen geeigneten Ständer zur Unterstützung des SPME-Halters (Abbildung 4C). Für das vorliegende Protokoll wird ein manuelles SPME-Headspace-System in der Fläschchen mit 100 μM Polydimethylsiloxan (PDMS)-beschichteter Faser zum Abfangen flüchtiger Stoffe verwendet.
      HINWEIS: Andere im Handel erhältliche Fasern haben Beschichtungen mit unterschiedlichen chemischen Eigenschaften und sollten entsprechend dem gewünschten Effekt ausgewählt werden.
   2. Konditionieren Sie jede SPME-Faser vor der Verwendung bis zu 20 min bei 250 °C thermisch, gemäß den Empfehlungen des Herstellers.
   3. Geben Sie das Kiefernmaterial oder den Kiefernteil in ein Durchstechzeug aus Klarglas und verschließen Sie es mit einem Lochschraubverschluss mit einer Auskleidung aus Polytetrafluorethylen (PTFE) (Septum). Das Material sollte mindestens 2 bis 3 cm von der Oberseite des Fläschchens entfernt sein, damit die Faser die Probe nicht berührt.
   4. Führen Sie gleichzeitig Kontrollexperimente mit SPME-Fasern durch, indem Sie leere Fläschchen beproben, um Systemverunreinigungen zu identifizieren oder um zu bestätigen, dass es keine Verschleppung durch wiederholte Verwendung der SPME-Fasern gibt.
   5. Bewahren Sie das Kiefernmaterial 1 Stunde lang in der Durchstechflasche auf, bevor sich flüchtige Bestandteile sammeln, um das Gleichgewicht der Atmosphäre zu gewährleisten.
      HINWEIS: Assays mit SPME können bei Raumtemperatur oder bei einer einstellbaren Temperatur durchgeführt werden, indem die Fläschchen in einem Stützgestell untergebracht und in ein Bain-Marie-Bad eingesetzt werden.
   6. Stellen Sie die Tiefe der Septum-Piercingnadel vom SPME-Halter aus so ein, dass das Septum durchstochen wird, aber nicht mit dem Material in Berührung kommt, wenn die Faser freigelegt wird.
   7. Führen Sie bei herausgezogener Faser die Halternadel durch die PTFE-Auskleidung ein. Drücke den Kolben nach unten, um die Faser freizulegen. Drehen Sie den Stößel im Uhrzeigersinn und halten Sie die Halteschraube an der horizontalen linken Seite der Z-Nut²⁴ fest. Legen Sie die Faser 1 Stunde lang frei.
   8. Ziehen Sie die Faser zurück, indem Sie den Kolben gegen den Uhrzeigersinn drehen, bis der Kolben die Oberseite des Z-Schlitzes erreicht. Die gesammelten flüchtigen Bestandteile sind nun bereit für die direkte GC- und/oder GC-MS-Analyse.
      HINWEIS: Bei Bedarf können die Fasern vor der Analyse bei Raumtemperatur gelagert werden, jedoch nicht länger als eine Woche.
4. Headspace-Trapping mit gepackten Röhrchen
   1. Bereiten Sie eine Einrichtung zum Abfangen von flüchtigen Bestandteilen im Headspace mit gepackten Edelstahlfallen vor, die aus a) einem Massendurchflusspumpsystem, b) PTFE-Schläuchen, c) Aktivkohle-Luftfiltern, d) porösen Harzpolymer-gefüllten Rohren und e) Glaswaren- oder Polyethylenterephthalat (PET)-Beuteln (Kochbeuteln) bestehen (Abbildung 4D)²⁵.
   2. Bewahren Sie Kiefernmaterial in abgedeckten Glaswaren oder in PET-Beuteln auf, um flüchtige Bestandteile im Headspace anzusammeln.
      HINWEIS: Beachten Sie, dass flüchtige Bestandteile von gewöhnlichem Kunststoff reichlich vorhanden sind und in großen Mengen durch GC-MS nachgewiesen werden können.
   3. Für ein geschlossenes Kreislaufsystem verbinden Sie den Kreislauf wie folgt: a) den Pumpenauslass mit dem PTFE-Schlauch, b) den PTFE-Schlauch mit den Aktivkohle-Luftfiltern, c) von den Luftfiltern mit den zusätzlichen Schläuchen, die mit den Glaswaren oder PET-Beuteln mit dem Kiefernmaterial verbunden sind, d) den verpackten Schlauch mit dem Auslass der Glaswaren oder des PET-Beutels, e) zusätzlicher PTFE-Schlauch vom Auslass des Edelstahlrohrs zum Einlass²² der Massendurchflusspumpe.
      HINWEIS: Poröse polymerverpackte Edelstahlrohre sollten vor der Verwendung in der thermischen Desorptionseinheit gemäß den Empfehlungen des Herstellers thermisch konditioniert werden, z. B. bis zu 15 min bei 100 °C. Achten Sie darauf, dass Rohre eine Strömungsrichtung haben, die eingehalten werden sollte.
   4. Sammeln Sie flüchtige Stoffe, indem Sie 100 l gefilterte Luft mit 0,6 l pro Minute durch das Kiefernsystem pumpen und die Massendurchflusspumpe verwenden, um die Menge und Rate der gefilterten Luft zu steuern.
      HINWEIS: Die Menge und/oder der Luftstrom aus dem Kopfraum, der durch die Säule strömt, kann die Menge der eingeschlossenen flüchtigen Bestandteile und anschließend das erhaltene Chromatogramm beeinflussen.
   5. Nach dem Auffangen flüchtiger Bestandteile verschließen Sie die gepackten Röhrchen an beiden Enden mit luftdichten Aufbewahrungskappen. Bei Raumtemperatur lagern (maximal 1 Woche) und so schnell wie möglich analysieren, da sich flüchtige Bestandteile zersetzen oder entweichen können.
   6. Spülen Sie zum Waschen alle PTFE-Schläuche und -Glaswaren mit 70 % Ethanol aus und erhitzen Sie sie mindestens 2 h²⁵ bei 230 °C im Ofen.

6. Analyse von flüchtigen Profilen

1. Führen Sie die Analyse flüchtiger Profile durch Gaschromatographie-Massenspektrometrie (GC-MS) oder routinemäßig durch Gaschromatographie mit Flammenionisationsdetektion (GC-FID) zur Quantifizierung zuvor identifizierter flüchtiger Bestandteile durch.
   HINWEIS: Die Beschreibung der Analysemethoden durch GC-FID und GC-MS ist umfangreich und geht über das Ziel der vorliegenden Arbeit hinaus. Dem Leser wird empfohlen, Laborverfahren oder -normen wie ISO 7609²⁶ zu verwenden, die relevante Betriebsbedingungen für die Quantifizierung einzelner Bestandteile und Literaturdaten zum Vergleich zweier Analysemethoden²⁷ liefern.
2. Verwenden Sie Analyten, die rein sind oder in einem Lösungsmittel transportiert werden, z. B. n-Pentan oder n-Hexan, und direkt in eine Faser injiziert oder adsorbiert werden, z. B. SPME, und direkt in den Chromatographen-Injektor desorbiert werden, oder unter Verwendung einer thermischen Desorptionseinheit (TD), die mit der GC-Einheit verbunden ist.
   HINWEIS: Trotz ihrer höheren Empfindlichkeit, höheren Auflösung und kürzeren Analysezeit haben Kapillarsäulen eine geringe Probenkapazität. Obwohl also fast alle Betriebsbedingungen ähnlich sein können, kann die Art des Analyten (rein, in Lösungsmittel, SPME usw.) unterschiedliche Split- / Splitless-Injektionsverfahren erfordern.
3. Durchführung der Identifizierung flüchtiger Komponenten durch Vergleich ihrer Retentionsindizes, die gemäß ISO 7609 bewertet wurden, mit GC-MS-Spektren aus einer im Labor erstellten Bibliothek unter Verwendung von Referenzproben, deren Identität durch RI, GC-MS und ¹³C-NMR, laborsynthetisierte und isolierte Verbindungen und kommerziell erhältliche Standards oder, falls solche nicht vorhanden sind, kommerziell erhältliche Massenspektrenbibliotheken.
4. Die Ergebnisse werden anhand einer grafischen Darstellung (Chromatogramm) und eines chromatographischen Profils ausgedrückt, das die relativen Mengen aller identifizierten Verbindungen in der Probe auflistet, wobei ihre Elutionsreihenfolge durch ihre Retentionsindizes in der geeigneten verwendeten Spalte angegeben wird.
5. Für eine große Anzahl von Proben ist eine geeignete statistische Analyseauswertung auf der Grundlage der chemischen Zusammensetzung zur Interpretation der Probenanordnung (Gruppierungen und/oder Trennungen) durchzuführen.

Ergebnisse

Der Kiefernkiefer vermehrt sich unter optimalen Bedingungen schnell, und die Generationszeiten können bis zu 4 Tage betragen, wobei jedes Weibchen im Laufe seines Lebens etwa 80 Eier legt²⁸. Mit der oben beschriebenen Methodik können je nach Pilzwachstum große Mengen an Kiefernfadenwurzeln gewonnen werden. Innerhalb einer 8-tägigen Wachstumsperiode können Kiefernfadenwürze einen 100-fachen Anstieg der Populationszahlen verzeichnen (Abbil...

Diskussion

Das hier vorgestellte Protokoll skizziert eine verbesserte Methodik zur Analyse flüchtiger Verbindungen in Seekiefern, die vom Kiefernfadenwurm befallen sind, bei denen die Umwelt- und genetische Variabilität reduziert ist und die Ergebnisse nicht beeinflusst. Unter Verwendung reiner Linien von in vitro maritimen Kieferngenotypen können extrahierte und emittierte flüchtige Bestandteile als Wirtsreaktion auf eine der schädlichsten biotischen Bedrohungen für Kiefernwälder a...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
38 mesh test sieve	Retsch	60.131.000038
6-Benzylaminopurine (6-BAP)	Duchefa Biochemie	B0904
Charcoal activated	Duchefa Biochemie	C1302
Clevenger apparatus	WINZER Laborglastechnik	25-000-02
Hydrogen peroxide solution	Sigma-Aldrich	H1009-500ML
Indole-3-butyric acid (IBA)	Duchefa Biochemie	I0902
Likens-Nickerson apparatus	VitriLab LDA.	c/IN29/32
Microbox round containers	Sac O2	O118/80+OD118
n-Pentane	Sigma-Aldrich	1.00882
PARAFILM M sealing film	BRAND	HS234526B-1EA
Phyto agar	Duchefa Biochemie	P1003
Potato Dextrose Agar	BD DIFCO	213400
Scalpel blade no. 24	Romed Holland	BLADE24
Schenk & Hildebrandt Basal salt medium	Duchefa Biochemie	S0225
Schenk & Hildebrandt vitamin mixture	Duchefa Biochemie	S0411
SPME fiber assembly Polydimethylsiloxane (PDMS)	Supelco	57300-U
SPME Fiber Holder	Supelco	57330-U
Sucrose	Duchefa Biochemie	S0809
Tenax TA- stainless steel tubes- conditioned + capped	Markes International	C1-AAXX-5003