Infektion von In vivo und In Vitro Kiefern mit dem Kiefernfadenwurm Bursaphelenchus xylophilus und Isolierung von induzierten flüchtigen Bestandteilen

Zusammenfassung

Das Protokoll beschreibt die in vivo und in vitro Kiefernholznematodeninfektion von Pinus pinaster und deren Volatilomanalyse mittels Gaschromatographie (GC) und GC gekoppelt mit Massenspektrometrie (GC-MS).

Zusammenfassung

Der Kiefernfadenwurm (PWN) ist ein Phytoparasit, der bei Nadelbaumarten die Kiefernwelkekrankheit (PWD) verursacht. Dieser pflanzenparasitäre Nematode hat stark zur Abholzung von Kiefernwäldern in asiatischen Ländern wie Japan, China und Korea beigetragen. In den letzten zwei Jahrzehnten waren in Europa Portugal und Spanien stark betroffen. Die Erforschung der Mechanismen der Infektion und/oder des Fortschreitens des PWD-Virus bei anfälligen Wirtsarten stützt sich auf die kontrollierte Infektion von Kiefernsetzlingen unter Gewächshausbedingungen. Diese Technik ist aufwendig und mobilisiert erhebliche wirtschaftliche und personelle Ressourcen. Darüber hinaus kann sie anfällig für Variabilität sein, die sich aus der genetischen Vielfalt einiger Kiefernarten, aber auch aus der Einwirkung externer Faktoren ergibt. Als Alternative bieten In-vitro-Cokulturen von Kiefern mit Kiefernwurm ein vorteilhafteres System zur Untersuchung biochemischer Veränderungen, da sie a) die Kontrolle einzelner Umwelt- oder Ernährungsvariablen ermöglichen, b) weniger Platz beanspruchen, c) weniger Zeit für die Gewinnung benötigen und d) frei von Kontamination oder genetischer Variation des Wirts sind. Das folgende Protokoll beschreibt die standardmäßige in vivo PWN-Infektion von Pinus pinaster, der Seekiefer, und die Etablierung der neuartigen in vitro Co-Kulturen von Kiefernsprossen mit dem PWN als verbesserte Methodik zur Untersuchung dieses Phytoparasiteneinflusses auf flüchtige Bestandteile der Kiefer. PWN-induzierte flüchtige Bestandteile werden aus in vivo und in vitro infizierten Kiefern durch Hydrodestillation und Destillationsextraktion extrahiert, und die emittierten flüchtigen Bestandteile werden durch Festphasen-Mikroextraktion (SPME) unter Verwendung von Faser- oder Packungskolonnentechniken aufgefangen.

Einleitung

Der Kiefernfadenwurm (PWN), Bursaphelenchus xylophilus (Steiner & Bührer 1934) Nickle 1970, ist ein pflanzenparasitärer Fadenwurm, der hauptsächlich Pinus-Arten parasitiert. Dieser Phytoparasit wird von Insekten der Gattung Monochamus während der Reifung des Insekts in Bäume anfälliger Kiefernarten übertragen. Der Kiefernfadenschein tötet den Baum, indem er seine Harzkanäle angreift und den Harzfluss verringert und sein Gefäßgewebe schädigt, was zu Unterbrechungen in der Wassersäule führt. Wassermangel in den Baumkronen führt zu den ersten sichtbaren Symptomen der Kiefernwelkekrankheit (PWD), d.h. die Kiefer....

Protokoll

1. In-vitro-Anbau von Kiefernholznematoden

HINWEIS: Kiefernnematoden werden gezüchtet, indem sie sich von dem Pilzmyzel eines nicht sporulierenden Stammes von Botrytis cinerea (de Bary) Whetzel¹¹ ernähren.

1. Für routinemäßige Subkulturen wird ein Kulturpfropfen (0,5 cm Durchmesser) vom äußersten Rand der Pilzkolonie auf eine Platte mit sterilem Kartoffel-Dextrose-Agar (PDA) übertragen und 7 bis 10 Tage lang bei 25 ± 1 °C aufbewahrt oder bis die Pilzkolonie den Rand der Platte erreicht.
   HINWEIS: Andere Arten von allgemeinem Pilzwa....

Diskussion

Das hier vorgestellte Protokoll skizziert eine verbesserte Methodik zur Analyse flüchtiger Verbindungen in Seekiefern, die vom Kiefernfadenwurm befallen sind, bei denen die Umwelt- und genetische Variabilität reduziert ist und die Ergebnisse nicht beeinflusst. Unter Verwendung reiner Linien von in vitro maritimen Kieferngenotypen können extrahierte und emittierte flüchtige Bestandteile als Wirtsreaktion auf eine der schädlichsten biotischen Bedrohungen für Kiefernwälder a.......

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
38 mesh test sieve	Retsch	60.131.000038
6-Benzylaminopurine (6-BAP)	Duchefa Biochemie	B0904
Charcoal activated	Duchefa Biochemie	C1302
Clevenger apparatus	WINZER Laborglastechnik	25-000-02
Hydrogen peroxide solution	Sigma-Aldrich	H1009-500ML
Indole-3-butyric acid (IBA)	Duchefa Biochemie	I0902
Likens-Nickerson apparatus	VitriLab LDA.	c/IN29/32
Microbox round containers	Sac O2	O118/80+OD118
n-Pentane	Sigma-Aldrich	1.00882
PARAFILM M sealing film	BRAND	HS234526B-1EA
Phyto agar	Duchefa Biochemie	P1003
Potato Dextrose Agar	BD DIFCO	213400
Scalpel blade no. 24	Romed Holland	BLADE24
Schenk & Hildebrandt Basal salt medium	Duchefa Biochemie	S0225
Schenk & Hildebrandt vitamin mixture	Duchefa Biochemie	S0411
SPME fiber assembly Polydimethylsiloxane (PDMS)	Supelco	57300-U
SPME Fiber Holder	Supelco	57330-U
Sucrose	Duchefa Biochemie	S0809
Tenax TA- stainless steel tubes- conditioned + capped	Markes International	C1-AAXX-5003