松树线虫 Bursaphelenchus xylophilus 感染松树体内和体外及分离诱导挥发物

摘要

该方案描述了松树的 体内 和 体外 松木线虫 感染及其通过 气相色谱 （GC） 和 GC 与质谱联用 （GC-MS） 进行的挥发性分析。

摘要

松木线虫 （PWN） 是一种植物寄生虫，可在针叶树物种中引起松树枯萎病 （PWD）。这种植物寄生线虫严重导致了亚洲国家（例如日本、中国和韩国）的松树森林砍伐。在过去的二十年里，在欧洲，葡萄牙和西班牙受到了很大影响。对易感宿主物种 PWN 感染和/或 PWD 进展机制的研究依赖于温室条件下松树幼苗的受控感染。这种技术很费力，并且需要调动大量的经济和人力资源。此外，由于与某些松树物种相关的遗传多样性以及外部因素的干扰，它可能容易产生变异性。作为替代方案，松树与 PWN 的体外共培养为研究生化变化提供了更有利的系统，因为它们 a） 允许控制单一环境或营养变量，b） 占用更少的空间，c） 需要更少的时间来获得，以及 d） 不受污染或宿主遗传变异。以下方案详细介绍了海洋松树 Pinus pinaster 的标准体内 PWN 感染，以及使用 PWN 建立松芽的新型体外共培养，作为研究这种植物寄生虫对松树挥发物影响的改进方法。通过加氢蒸馏和蒸馏-萃取从体内和体外感染的松树中提取 PWN 诱导的挥发物，并使用纤维或填充柱技术通过固相微萃取 （SPME） 捕获排放的挥发物。

引言

松木线虫（PWN）， Bursaphelenchus xylophilus （Steiner & Bührer 1934） Nickle 1970，是一种主要寄生在 松树 物种上的植物寄生线虫。这种植物寄生虫在昆虫成熟取食期间由 Monochamus 属的昆虫传播到易感松树种的树木中。PWN 通过攻击树木的树脂管并减少树脂流动，并破坏其维管组织，导致水柱中断来杀死树木。树冠缺水会引起松树萎病 （PWD） 的第一个可见症状，即松针在光合作用停止后变得绿化，并因干燥而下垂。松树通常通过产生树脂和挥发性化合物来响应生物和非生物胁迫¹。因此，了解松树防御的机制对于确定 PWN 攻击的具体效果和寻找害虫防治的替代方法非常重要²。

目前，在田间条件下的实验取决于受感染松树的可用性、PWN 感染的确认和可变的环境条件。在温室条件下，这些参数可以更容易地控制;然而，宿主的遗传多样性成为变异性的重要来源³。例如，在一项关于 Pinus pinaster 抗性反应的研究中，萜烯柠檬烯和树脂酸的产生与 PWN 感染有关⁴。然而，由于样品数量少且自然条件多变，仅记录到一半样品的可检测变化。在另一项使用温室种植的松树幼苗的研究中，尽管环境条件更容易控制，但天然松树遗传多样性导致提取的挥发物具有很大的变异性⁵。由于疾病诱导的松树挥发物会受到环境和遗传变异的极大影响，因此求助于体外嫩芽培养是研究松树组织对 PWN 感染的化学和生化反应的良好替代方案 ^5,6。通过在体外繁殖植物基因型，其基因组成可以无限期地维持和克隆，从而在比体内条件下更小的空间和更短的时间内建立更多基因相同的个体。这些培养物在易于操纵的营养和环境条件下是一种简单的工作系统，因此在评估挥发物的产生和排放方面，它们比传统系统具有额外的优势 ^7,8。这些系统特别有利于木本物种的研究，因为大多数时候需要大量资源，即目标树木有时位于难以到达的地点，需要昂贵的设备、专门的劳动力和更长的分析时间⁸。在体外，松树与 PWN 的共培养能够评估线虫和植物在不同阶段的代谢相互作用⁹。对于挥发物的分析，这一点非常重要，因为分析技术已经变得非常准确，采样的微小变化会导致挥发性分布的重大变化。气相色谱-质谱联用 （GC-MS） 是一种用于分析挥发物的强大技术，可快速、简化挥发物的分析¹⁰。这里介绍的方案描述了在温室条件下感染体内松树幼苗的技术，以及为诱导挥发物的提取和分析而优化的基因相同松树的体外芽培养物的技术。

研究方案

1. 体外生长 松 木线虫

注意:松木线虫是通过以灰葡萄孢 （de Bary） Whetzel¹¹ 的非孢子菌株的真菌菌丝体为食而生长的。

1. 对于常规传代培养，将培养塞（直径 0.5 cm）从真菌菌落的最外缘转移到无菌马铃薯葡萄糖琼脂 （PDA） 板上，并在 25 ± 1°C 下保持 7 至 10 天，或直到真菌菌落到达板的边缘。
   注:其他类型的通用真菌生长培养基可用于真菌生长。
2. 为了获得更多的 PWN，请使用在蒸汽灭菌的水合认证有机大麦粒 （Hordeum vulgare L.） 上体外生长的灰葡萄孢杆菌。将 15 g 谷物加入 15 mL 超纯水中，放入有盖的宽口 250 mL 锥形瓶中，并消毒。随后，用灰葡萄孢杆菌培养塞接种，并在 25 ± 1°C 下保存 7 至 10 天或直到谷物表面完全定植¹²。
   注意:可向植物寄生线虫的国家参考实验室索取用于研究目的的线虫。
3. 通过用 PWN 水悬浮液（包含至少 20 只雄性和 30 只雌性）接种 灰葡萄孢芽孢杆菌体外 培养物来启动 PWN 培养物，并在先前描述的条件下在黑暗中保持 7 至 10 天，或直到真菌菌落完全消耗并且 PWN 种群开始爬上板或烧瓶的壁（图 1）。用塑料薄膜密封板或烧瓶，以避免干燥。
   注意:雌性可以通过外阴皮瓣、长子宫后囊和通常圆形的尾端来区分;雄性有一个腹侧弯曲的尖尾端，带有特征性针状突¹³。移液 PWN 悬液时，对真菌菌落进行划线，使移液管的悬液不会在真菌表面形成液滴，从而通过表面张力捕获 PWN。
4. 通过用自来水冲洗培养瓶壁，将内容物倒在 Baermann 漏斗或托盘中的纸巾上，然后浸入水中来分离^{PWN 14}。24 到 48 小时后，活的线虫会从受感染的物质转移到水中。通过使用 38 μm 筛¹⁵ 进行筛分来回收它们。将累积的 PWN 清洗到装有自来水的容器中。
   注意:任何与 PWN 接触的材料都必须进行适当的净化，因为它是一种检疫生物;在乙醇中浸泡 10 至 20 分钟通常就足够了。被剔除的水性悬浮液必须消毒或加热至 60 °C 至少 35 分钟。
5. 立即使用含有 PWN 的水悬浮液或将其保持在 11 °C 下更长的储存时间（长达 2 个月）。

2. 对混合生命阶段松木线虫进行杀菌

1. 在流动罩中，将含有约 5000 个 PWN 的体积 PWN 悬浮液移液到无菌 38 μm 网筛中，并用无菌水洗涤。
   注意:在双目显微镜 （40x） 下计数线虫。
2. 将含有 PWN 的筛子的下半部分浸入 20% 过氧化氢 （H₂O₂） 溶液中，并手动混合 15 分钟。
3. 通过筛子分配无菌水来清洗无菌 PWN。重复此步骤 3 次。在最后一次洗涤中，倾斜筛子，使 PWN 聚集在筛子边缘。通过在筛子边缘吸取 1 mL 无菌水来回收无菌线虫悬浮液，并在 11 °C 下储存或立即使用。
   注:通过将 100 μL 等分试样的 PWN 悬浮液接种在 PDA 培养基中，并定期监测污染约 1 周，可以评估灭菌是否成功。

3. 体内松树幼苗感染

注意:在 ≥ 2 年龄的 P. pinaster 幼苗中进行接种试验。树木可以从经过认证的商业零售商处获得，但也可以用经过认证的种子在温室中种植。

1. 如步骤 1 中所述获得 PWN 接种物，并通过向悬浮液中加水或等待线虫沉淀（约 60 分钟）并通过倾析地表水来降低体积，将混合生命阶段 PWN 的悬浮液设置为 1000 PWN/mL。在室温下，在双目显微镜下的凹面载玻片中以 40 倍进行计数。
2. 要开始接种，请手动从松树茎上部 5 厘米以下的切片上取下针头，并用消毒的手术刀¹⁶ 做一个浅表纵向切口（0.5 至 1 厘米长）。
   注意:进行切口是为了让线虫接触到内部松组织。
3. 在受伤区，放置一块消毒棉以容纳 0.5 mL 移液管 PWN 悬浮液，并用透明条固定以保持湿度。
   注意:在每次接种之间剧烈混合 PWN 悬浮液，因为线虫会迅速沉降。如果悬浮液在接种部位干燥，线虫感染可能不会成功，因此请充分覆盖潮湿的棉花。
4. 对于对照松树，用无菌水代替 PWN 悬浮液。
5. 定期跟踪 PWD 进展，并通过量化变色和枯萎针头的百分比来对症状进行评分。无外部症状评分为 0，针头变色高达 25% 评分为 1，针头变色为 25% 至 50%，针头变色为 50% 至 75% 为 3，针叶完全为棕色的松树评分为 4（图 2）。
6. 将温室保持在潮湿的条件下 （60%-80%） 并经常浇水（保持在土壤最大持水量的 70%），避免极端温度，因为线虫在 10 °C 以下代谢不活跃，而 30 °C 以上会影响发育。
7. 接种后 20 天，通过在茎的基部切割幼苗并在牛皮纸袋中冷冻 （-20 °C） 来收获用于挥发物提取的植物材料。对于排放的挥发物（SMPE 纤维或填充管），立即在室温下对松树幼苗进行采样 ^5,17。

4. 体外松芽培养物的建立和感染

1. 在表面灭菌之前，用流动的自来水中清洗经过认证的 P. pinaster 种子以去除最大的碎屑，然后用普通洗涤剂溶液（每 40 mL 水 1 滴）在剧烈搅拌下清洗较细的碎屑。
2. 在流动罩中，通过添加商业漂白剂溶液（1:4，自来水中的商业漂白剂）开始种子表面灭菌，直到洗涤过的种子被覆盖，然后剧烈混合 15 分钟。处理漂白剂溶液，用消毒的自来水冲洗种子 3 次。
3. 将种子浸入乙醇溶液 （80%， v/v） 中 15 分钟，剧烈搅拌，处理乙醇，并用灭菌的超纯水洗涤 3 次。
4. 对于松树发芽，在通风橱中用无菌机械车床打破消毒的种皮，分离松子，并将它们放在带有消毒湿滤纸的密闭容器中，使松子水合过夜⁶.
5. 将水松子在 4 °C 下分层 7 天，以打破休眠并同步发芽，然后在 25 °C 避光中保持直至发芽。
   注意:分层步骤是可选的。
6. 将无菌发芽的松树，在密闭容器中，以 24 °C/ 18 °C 的热周期转移到 16 小时的光照光周期中，并保持 2 周或直到主茎开始发育。
7. 在流动罩中，用手术刀切下根上方幼苗的地上部分，并转移到补充有 30 g/L 蔗糖、8 g/L 琼脂、0.5 mg/L 6-苄氨基嘌呤（BAP，一种细胞分裂素）和 0.1 mg/L 吲哚-3-丁酸（IBA、 一种生长素）⁶，以诱导微芽增殖。将培养物保持在体外培养生长室中的上述条件下。
8. 在流动罩中，通过用无菌手术刀切割芽基部（与培养基接触的部分）的 愈伤组织 ，并用无菌镊子将芽簇转移到新的增殖培养基中，定期（约 4 周）进行传代培养。
9. 对于微茎伸长，将微芽转移到上述 SH 培养基中，但含有 3 g/L 活性炭而不是植物激素。
   注意:活性炭吸附毒物并防止在切片组织上过度诱导植物激素积累¹⁹。
10. 对于 PWN 感染，将细长的芽转移到不含植物激素或活性炭的 SH 培养基中，并在微芽底部添加 100-150 个混合生命阶段灭菌的 PWN。保持上述条件，直到 PWD 的症状开始明显（图 3）⁶。
11. 要收获用于挥发物提取的植物材料，请立即使用 体外 外植体或冷冻 （-20 °C） 直至分析。对于发射的挥发物（SMPE 纤维或填充管），请立即分析 Microshoot 盒。

5. 挥发性化合物的分离

注:挥发物的分离可以通过多种技术进行。在这里，挥发物萃取是通过加氢蒸馏完成的，使用 Clevenger 装置²⁰，蒸馏萃取，使用 Likens-Nickerson 装置²¹，以及使用涂层纤维或填充管（多孔聚合物吸附剂）²² 通过固相微萃取 （SPME） 捕获顶空挥发物。

1. 加氢蒸馏
   1. 使用 Clevenger 装置分离精油。蒸馏系统由 a） Clevenger 装置，b） 圆底烧瓶或锥形瓶组成，用于盛放水和松树材料，c） 合适的加热设备，以及 d） 将系统固定到位的支撑框架（图 4A）。
   2. 使用前彻底清洁玻璃器皿。使用实验室框架夹将 Clevenger 装置固定到晶格框架上。通过循环水冷却系统冷凝器或使用冷冻循环器（如果有）。
   3. 记录松芽重量并将其放入圆底烧瓶或锥形瓶中。调整水量以确保容器不超过一半。
   4. 将加热设备放在烧瓶下方，检查是否有泄漏，并确保系统的所有部件都处于正确的位置并固定在支撑架上。
      注意:连接前，应彻底清洁 Clevenger 和烧瓶的毛玻璃连接部件，脱脂并干燥。为此，请使用一张略微蘸有丙酮的滤纸。这些部件不应使用润滑脂。
   5. 通过位于 Clevenger 装置中间部分回流对角管中的注水漏斗引入水。调整三通水龙头的位置，使水在两个管子（对角管和刻度管）中均匀流动，直到装满烧瓶，然后从回流对角管流入烧瓶（见 图 4）。
   6. 打开热源并进行调整，使水以 2 - 3 mL/min 的蒸馏速率沸腾。
   7. 当第一滴蒸馏水落入 Clevenger 装置右侧的刻度管时，开始蒸馏时间。平均蒸馏时间为 3 小时²³ 小时，但可根据具体要求使用更短或更长的蒸馏时间。精油通常存在于上清液中，因为它们通常比下面的蒸馏芳香水（水解）轻。
      注意:蒸馏运行时，Clevenger 仪摸起来很热。
   8. 蒸馏时间结束后，停止加热并静置约 10 分钟，让蒸馏和沸腾停止。10 分钟后，顺时针打开水龙头，让水液流出，直到精油到达刻度部分。读取分离的精油的体积。以 mL/g（鲜重或干重）计算产量，以百分比 （%、v/w） 表示。
   9. 对于体积低于 0.05 mL 的精油，即刻度管中的最低刻度，无法确定产量。要回收精油，请使用蒸馏的 正戊烷冲洗 Clevenger 装置。
   10. 要使用蒸馏的 正戊烷回收精油，蒸馏结束后，等待约 10 到 15 分钟，然后逆时针打开三向水龙头，使水浆从回流对角管流出，直到刚好在填充漏斗下方。用干净的滴管将蒸馏的 正戊烷引入进样漏斗中，直到回流对角管的左上角。避免触摸进样漏斗，以防止交叉污染。
   11. 使用蒸馏水清洗瓶，将水引入进样漏斗。 正戊烷会流到蒸馏瓶中，并随着煎剂水的余热蒸发。这样，它将穿过系统，溶解并将挥发物拖到刻度管中的水解物表面。顺时针打开三向水龙头至其常规位置。
   12. 按照 5.1.8 中的步骤进行操作。收集溶解在 N-戊烷中的精油。
   13. 使用排污蒸发器系统，在室温下，在氮气通量下将精油和 正戊烷的混合物浓缩至最小体积约 100 μL。将其保持在 -20 °C 直至分析。
       注意:不要浓缩至干燥，以免挥发性化合物损失。
2. 蒸馏萃取
   1. 使用 Likens-Nickerson 装置从植物中提取挥发物。蒸馏萃取系统由 a） Likens-Nickerson 装置，b） 一个圆底烧瓶，用于盛水和松木材料（蒸馏装置的右臂），以及另一个用于盛放不混溶的有机溶剂，例如蒸馏的 正戊烷（蒸馏装置的左臂），c） 两个合适的加热装置，d） 一个冷凝器， e） 用于固定系统的支撑框架（图 4B）。
      注:使用实验室内蒸馏的 正戊烷，以避免样品被添加溶剂的稳定剂污染。
   2. 首先在安全的冷凝器中循环水，或使用冷冻循环器（如果有）。
   3. 使用实验室框架夹将蒸馏萃取装置固定到晶格框架上。在圆底烧瓶中装入要提取的松木材料，并加水至半满。较小的 100 mL 圆底培养瓶应半满 蒸馏正戊烷。
      注意: 在连接之前，玻璃组件的磨砂玻璃连接部件需要彻底清洁、脱脂和干燥。可以使用一张用丙酮短暂润湿的滤纸进行清洁。
   4. 将加热套放在每个烧瓶下方。确认没有泄漏，并且系统的每个组件都已正确定位并固定在实验室晶格框架上。打开热源并将它们调整到各自的沸点。水应以 2-3 mL/min 的蒸馏速率沸腾。
      注意: 在蒸馏萃取过程中，Likens-Nickerson 装置摸起来会很热。
   5. 蒸馏时间结束后，停止用松木材料烧瓶加热，让 正戊烷单独蒸馏 10 分钟。 正戊烷变为透明液体后，停止加热，静置约 10 分钟。颜色变化表明馏出物现在在烧瓶中含有 正戊烷。
   6. 在室温下，在减压 （70 - 73 mmHg） 下将 正戊烷提取物浓缩在旋转蒸发器上。将部分浓缩的提取物转移到样品瓶中，并在室温下在排污蒸发器中的氮气流下将其浓缩至 ≈100 μL。提取后，将样品储存在 -20 °C 直至分析。
      注意:提取物不应浓缩至干燥，因为这会导致挥发性化合物的损失。
3. 使用涂层光纤进行顶空采样
   1. 固相微萃取 （SPME） 设置包括 a） 手动操作的 SPME 支架，b） 包被的纤维头，以及 c） 支撑 SPME 支架的合适支架（图 4C）。对于本方案，使用带有 100 μM 聚二甲基硅氧烷 （PDMS） 涂层纤维头的手动样品瓶内 SPME 顶空系统来捕获挥发物。
      注:其他市售纤维具有不同化学特性的涂层，应根据所需效果进行选择。
   2. 根据制造商的建议，使用前将每个 SPME 纤维头在 250 °C 下热处理长达 20 分钟。
   3. 将松木材料或松木部分插入透明玻璃瓶中，并用带有聚四氟乙烯 （PTFE） 衬里（隔膜）的孔螺帽密封。材料应距离样品瓶顶部至少 2 至 3 cm，以免纤维头接触样品。
   4. 使用 SPME 纤维头同时进行对照实验，方法是对空样品瓶进行采样，以鉴定系统污染物，或确认重复使用 SPME 纤维头时没有残留。
   5. 在挥发物收集之前，将松树材料在小瓶内保持 1 小时以实现气氛平衡。
      注:使用 SPME 的分析可以在室温下进行，也可以在可调节温度下进行，方法是将样品瓶放在支撑架中，然后将它们插入 Bain Marie 浴中。
   6. 调整隔膜穿刺针从 SPME 支架的深度，以刺穿隔膜，但在纤维头暴露时不要与材料接触。
   7. 取出纤维头后，将固定针插入 PTFE 衬垫。向下推柱塞以露出光纤。顺时针旋转柱塞，并将固定螺钉固定在 Z 槽²⁴ 的水平左侧。将纤维暴露 1 小时。
   8. 逆时针转动柱塞，直到柱塞到达 Z 型槽的顶部，以缩回光纤。收集的挥发物现在可用于 GC 和/或 GC-MS 直接分析。
      注:如果需要，纤维头可以在分析前在室温下储存，但不能超过一周。
4. 使用填充管的顶部空间捕获
   1. 准备一个装置，用填充的不锈钢捕集器捕集顶部空间挥发物，包括 a） 质量流量泵送系统，b） PTFE 管，c） 活性炭空气过滤器，d） 多孔树脂聚合物填充管，和 e） 玻璃器皿或聚对苯二甲酸乙二醇酯 （PET） 袋（烹饪袋）（图 4D）²⁵。
   2. 将松木材料固定在有盖的玻璃器皿中或 PET 袋中，以积累顶部空间挥发物。
      注意:请注意，普通塑料中的挥发物含量丰富，可通过 GC-MS 进行大量检测。
   3. 对于闭环系统，请按如下方式连接电路:a） 泵出口到 PTFE 管，b） PTFE 管到活性炭空气过滤器，c） 从空气过滤器到连接到带有松木材料的玻璃器皿或 PET 袋的附加管，d） 填充管到玻璃器皿或 PET 袋出口， e） 从不锈钢管出口到质量流量泵入口²² 的附加 PTFE 管。
      注:多孔聚合物填充的不锈钢管应根据制造商的建议在热脱附装置中进行热调节，例如，在使用前在 100 °C 下最多 15 分钟。请注意，管子的流向应该被尊重。
   4. 使用质量流量泵以每分钟 0.6 升的速度将 100 升过滤空气泵入松树系统，以控制过滤空气的数量和速率，从而收集挥发物。
      注:流经色谱柱的顶空空气量和/或流量会影响捕获挥发物的数量，从而影响获得的色谱图。
   5. 挥发物收集后，用气密储存盖封闭两端的填充管。在室温下储存（最长 1 周）并尽快分析，因为挥发物会降解或逸出。
   6. 清洗时，用 70% 乙醇冲洗所有 PTFE 管和玻璃器皿，并在 230 °C 的烘箱中加热至少 2 小时²⁵ 小时。

6. 挥发性分布分析

1. 通过气相色谱-质谱 （GC-MS） 或常规使用气相色谱-火焰电离检测 （GC-FID） 分析挥发性物质，以定量先前鉴定的挥发物。
   注:GC-FID 和 GC-MS 分析方法的描述非常广泛，超出了本研究的目标。建议读者使用实验室程序或标准品，例如 ISO 7609²⁶，这些程序或标准品提供了有关单个成分定量的相关操作条件以及两种分析方法比较的文献数据²⁷。
2. 使用纯分析物或携带在溶剂（例如 正戊烷或 正己烷）中的分析物，并直接进样或吸附到萃取头（例如 SPME）中，然后直接解吸到色谱进样器中，或使用与 GC 单元相连的热脱附 （TD） 装置。
   注:尽管毛细管柱的灵敏度更高、分离度更高、分析时间更短，但样品容量较低。因此，尽管几乎所有操作条件都相似，但分析物类型（纯分析物、溶剂分析物、SPME 分析物等）可能需要不同的分流/少分流进样程序。
3. 通过将挥发性组分的保留指数（根据 ISO 7609 评估）与实验室创建的库中的 GC-MS 谱图进行比较，使用参比样品（其组分的身份由 RI、GC-MS 和 ¹³C-NMR 确定）、实验室合成和分离的化合物以及市售标准品，或者在没有市售质谱库的情况下，比较挥发性组分的谱图谱。
4. 使用图形表示（色谱图）和色谱图来表示结果，其中列出了样品中所有已鉴定化合物的相对含量，它们的洗脱顺序由它们在所用色谱柱中的保留指数指示。
5. 对于大量样品，根据化学成分进行适当的统计分析评估，以解释样品排列（分组和/或分离）。

结果

PWN 在最佳条件下繁殖迅速，世代时间可低至 4 天，每只雌性一生中产卵约^{80 个 28} 个。使用上述方法，可以根据真菌的生长获得大量的 PWN。在 8 天的生长期内，PWN 的种群数量可以增加 100 倍（图 1）。为了提高 PWN 数量的一致性，请使用灭菌的 PWN，因为未知细菌或真菌的污染会对 PWN 种群产生负面影响。

成功感...

讨论

此处介绍的方案概述了一种增强的方法来分析受 PWN 感染的海松中的挥发性化合物，其中环境和遗传变异性减少，并且不会影响结果。使用 体外 海洋松树基因型的纯品系，提取和排放的挥发物可以作为宿主对松树林最具破坏性的生物威胁之一的反应进行分析。

通过在体外培养灰葡萄孢芽孢杆菌（非孢子菌株）并将其用作线虫的食...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
38 mesh test sieve	Retsch	60.131.000038
6-Benzylaminopurine (6-BAP)	Duchefa Biochemie	B0904
Charcoal activated	Duchefa Biochemie	C1302
Clevenger apparatus	WINZER Laborglastechnik	25-000-02
Hydrogen peroxide solution	Sigma-Aldrich	H1009-500ML
Indole-3-butyric acid (IBA)	Duchefa Biochemie	I0902
Likens-Nickerson apparatus	VitriLab LDA.	c/IN29/32
Microbox round containers	Sac O2	O118/80+OD118
n-Pentane	Sigma-Aldrich	1.00882
PARAFILM M sealing film	BRAND	HS234526B-1EA
Phyto agar	Duchefa Biochemie	P1003
Potato Dextrose Agar	BD DIFCO	213400
Scalpel blade no. 24	Romed Holland	BLADE24
Schenk & Hildebrandt Basal salt medium	Duchefa Biochemie	S0225
Schenk & Hildebrandt vitamin mixture	Duchefa Biochemie	S0411
SPME fiber assembly Polydimethylsiloxane (PDMS)	Supelco	57300-U
SPME Fiber Holder	Supelco	57330-U
Sucrose	Duchefa Biochemie	S0809
Tenax TA- stainless steel tubes- conditioned + capped	Markes International	C1-AAXX-5003