松树线虫 Bursaphelenchus xylophilus 感染松树体内和体外及分离诱导挥发物

摘要

该方案描述了松树的 体内 和 体外 松木线虫 感染及其通过 气相色谱 （GC） 和 GC 与质谱联用 （GC-MS） 进行的挥发性分析。

摘要

松木线虫 （PWN） 是一种植物寄生虫，可在针叶树物种中引起松树枯萎病 （PWD）。这种植物寄生线虫严重导致了亚洲国家（例如日本、中国和韩国）的松树森林砍伐。在过去的二十年里，在欧洲，葡萄牙和西班牙受到了很大影响。对易感宿主物种 PWN 感染和/或 PWD 进展机制的研究依赖于温室条件下松树幼苗的受控感染。这种技术很费力，并且需要调动大量的经济和人力资源。此外，由于与某些松树物种相关的遗传多样性以及外部因素的干扰，它可能容易产生变异性。作为替代方案，松树与 PWN 的体外共培养为研究生化变化提供了更有利的系统，因为它们 a） 允许控制单一环境或营养变量，b） 占用更少的空间，c） 需要更少的时间来获得，以及 d） 不受污染或宿主遗传变异。以下方案详细介绍了海洋松树 Pinus pinaster 的标准体内 PWN 感染，以及使用 PWN 建立松芽的新型体外共培养，作为研究这种植物寄生虫对松树挥发物影响的改进方法。通过加氢蒸馏和蒸馏-萃取从体内和体外感染的松树中提取 PWN 诱导的挥发物，并使用纤维或填充柱技术通过固相微萃取 （SPME） 捕获排放的挥发物。

引言

松木线虫（PWN）， Bursaphelenchus xylophilus （Steiner & Bührer 1934） Nickle 1970，是一种主要寄生在 松树 物种上的植物寄生线虫。这种植物寄生虫在昆虫成熟取食期间由 Monochamus 属的昆虫传播到易感松树种的树木中。PWN 通过攻击树木的树脂管并减少树脂流动，并破坏其维管组织，导致水柱中断来杀死树木。树冠缺水会引起松树萎病 （PWD） 的第一个可见症状，即松针在光合作用停止后变得绿化，并因干燥而下垂。松树通常通过产生树脂和挥发性化合物来响应生物和非生物胁迫¹。因此，了解松树防御的机制对于确定 PWN 攻击的具体效果和寻找害虫防治的替代方法非常重要²。

目前，在田间条件下的实验取决于受感染松树的可用性、PWN 感染的确认和可变的环境条件。在温室条件下，这些参数可以更容易地控制;然而，宿主的遗传多样性成为变异性的重要来源³。例如，在一项关于 Pinus pinaster 抗性反应的研究中，萜烯柠檬烯和树脂酸的产生与 PWN 感染有关⁴。然而，由于样品数量少且自然条件多变，仅记录到一半样....

研究方案

1. 体外生长 松 木线虫

注意：松木线虫是通过以灰葡萄孢 （de Bary） Whetzel¹¹ 的非孢子菌株的真菌菌丝体为食而生长的。

1. 对于常规传代培养，将培养塞（直径 0.5 cm）从真菌菌落的最外缘转移到无菌马铃薯葡萄糖琼脂 （PDA） 板上，并在 25 ± 1°C 下保持 7 至 10 天，或直到真菌菌落到达板的边缘。
   注：其他类型的通用真菌生长培养基可用于真菌生长。
2. 为了获得更多的 PWN，请使用在蒸汽灭菌的水合认证有机大麦粒 （Hordeum vulgare L.） 上体外生长的灰葡萄孢杆菌。将 15 g 谷物加入 15 mL 超纯水中，放入有盖的宽口 250 mL 锥形瓶中，并消毒。随后，用灰葡萄孢杆菌培养塞接种，并在 25 ± 1°C 下保存 7 至 10 天或直到谷物表面完全定植¹²。
   注意：可向植物寄生线虫的国家参考实验室索取用于研究目的的线虫。
3. 通过用 PWN 水悬浮液（包含至少 20 只雄性和 30 只雌性）接种 灰葡萄孢芽孢杆菌体外 培养物来....

讨论

此处介绍的方案概述了一种增强的方法来分析受 PWN 感染的海松中的挥发性化合物，其中环境和遗传变异性减少，并且不会影响结果。使用 体外 海洋松树基因型的纯品系，提取和排放的挥发物可以作为宿主对松树林最具破坏性的生物威胁之一的反应进行分析。

通过在体外培养灰葡萄孢芽孢杆菌（非孢子菌株）并将其用作线虫的食.......

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
38 mesh test sieve	Retsch	60.131.000038
6-Benzylaminopurine (6-BAP)	Duchefa Biochemie	B0904
Charcoal activated	Duchefa Biochemie	C1302
Clevenger apparatus	WINZER Laborglastechnik	25-000-02
Hydrogen peroxide solution	Sigma-Aldrich	H1009-500ML
Indole-3-butyric acid (IBA)	Duchefa Biochemie	I0902
Likens-Nickerson apparatus	VitriLab LDA.	c/IN29/32
Microbox round containers	Sac O2	O118/80+OD118
n-Pentane	Sigma-Aldrich	1.00882
PARAFILM M sealing film	BRAND	HS234526B-1EA
Phyto agar	Duchefa Biochemie	P1003
Potato Dextrose Agar	BD DIFCO	213400
Scalpel blade no. 24	Romed Holland	BLADE24
Schenk & Hildebrandt Basal salt medium	Duchefa Biochemie	S0225
Schenk & Hildebrandt vitamin mixture	Duchefa Biochemie	S0411
SPME fiber assembly Polydimethylsiloxane (PDMS)	Supelco	57300-U
SPME Fiber Holder	Supelco	57330-U
Sucrose	Duchefa Biochemie	S0809
Tenax TA- stainless steel tubes- conditioned + capped	Markes International	C1-AAXX-5003