Заражение сосен in vivo и in vitro сосновой нематодой Bursaphelenchus xylophilus и выделение индуцированных летучих веществ

Резюме

В протоколе описывается инфекция сосновой нематодой Pinus pinaster in vivo и in vitro и анализ их волютилома с помощью газовой хроматографии (ГХ) и ГХ в сочетании с масс-спектрометрией (ГХ-МС).

Аннотация

Сосновая нематода (PWN) является фитопаразитом, вызывающим болезнь соснового увядания (PWD) у хвойных пород. Эта паразитическая на растениях нематода внесла значительный вклад в вырубку сосновых лесов в азиатских странах, таких как Япония, Китай и Корея. За последние два десятилетия в Европе сильно пострадали Португалия и Испания. Исследования механизмов инфицирования PWN и/или прогрессирования PWD у восприимчивых видов хозяев основаны на контролируемом заражении саженцев сосны в тепличных условиях. Этот метод является трудоемким и мобилизует значительные экономические и человеческие ресурсы. Кроме того, она может быть подвержена изменчивости, которая является результатом генетического разнообразия, связанного с некоторыми видами сосны, а также вмешательством внешних факторов. В качестве альтернативы, сокультуры сосны in vitro с PWN предлагают более выгодную систему для изучения биохимических изменений, поскольку они а) позволяют контролировать отдельные переменные окружающей среды или питания, б) занимают меньше места, в) требуют меньше времени для получения и г) свободны от загрязнения или генетической изменчивости хозяина. В следующем протоколе подробно описана стандартная in vivo инфекция PWN Pinus pinaster, морской сосны, и создание новых in vitro сокультур сосновых побегов с помощью PWN в качестве улучшенной методологии изучения влияния фитопаразита на летучие вещества сосны. Индуцированные PWN летучие вещества экстрагируются из инфицированных in vivo и in vitro сосен путем гидродистилляции и дистилляционной экстракции, а выделяемые летучие вещества улавливаются твердофазной микроэкстракцией (SPME) с использованием волоконных или колонных методов.

Введение

Сосновая нематода (PWN), Bursaphelenchus xylophilus (Steiner & Bührer 1934) Nickle 1970, является паразитической нематодой растений, которая в основном паразитирует на видах Pinus . Этот фитопаразит переносится насекомыми рода Monochamus на деревья восприимчивых видов сосны в период созревания пищи насекомого. PWN убивает дерево, атакуя его смоляные каналы и уменьшая поток смолы, а также повреждая его сосудистую ткань, вызывая перебои в толще воды. Недостаток воды в кронах деревьев вызывает первые видимые симптомы болезни соснового увядания (PWD), т.е. сосновая хвоя становится хлоротичной после прекращения ф....

протокол

1. Выращивание в пробирке нематоды сосны

ПРИМЕЧАНИЕ: Сосновые нематоды выращиваются путем кормления грибным мицелием неспорулирующего штамма Botrytis cinerea (de Bary) Whetzel¹¹.

1. Для рутинной субкультуры перенесите культуральную пробку (диаметром 0,5 см) с самой внешней границы колонии гриба на тарелку стерильного картофельного агара с декстрозой (КПК) и держите при температуре 25 ± 1 °C в течение 7-10 дней или до тех пор, пока колония грибов не достигнет края пластины.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Для роста грибов можно использовать другие тип....

Результаты

PWN быстро размножается в оптимальных условиях, а время генерации может составлять всего 4 дня, при этом каждая самка откладывает около 80 яиц в течение своей^{жизни 28}. Используя описанную выше методологию, можно получить большое количество PWN в зависимости от.......

Обсуждение

В представленном здесь протоколе изложена усовершенствованная методология анализа летучих соединений в морской кедре, инфицированной PWN, где экологическая и генетическая изменчивость снижена и не влияет на результаты. Используя чистые линии генотипов морской сосн?.......

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
38 mesh test sieve	Retsch	60.131.000038
6-Benzylaminopurine (6-BAP)	Duchefa Biochemie	B0904
Charcoal activated	Duchefa Biochemie	C1302
Clevenger apparatus	WINZER Laborglastechnik	25-000-02
Hydrogen peroxide solution	Sigma-Aldrich	H1009-500ML
Indole-3-butyric acid (IBA)	Duchefa Biochemie	I0902
Likens-Nickerson apparatus	VitriLab LDA.	c/IN29/32
Microbox round containers	Sac O2	O118/80+OD118
n-Pentane	Sigma-Aldrich	1.00882
PARAFILM M sealing film	BRAND	HS234526B-1EA
Phyto agar	Duchefa Biochemie	P1003
Potato Dextrose Agar	BD DIFCO	213400
Scalpel blade no. 24	Romed Holland	BLADE24
Schenk & Hildebrandt Basal salt medium	Duchefa Biochemie	S0225
Schenk & Hildebrandt vitamin mixture	Duchefa Biochemie	S0411
SPME fiber assembly Polydimethylsiloxane (PDMS)	Supelco	57300-U
SPME Fiber Holder	Supelco	57330-U
Sucrose	Duchefa Biochemie	S0809
Tenax TA- stainless steel tubes- conditioned + capped	Markes International	C1-AAXX-5003