Заражение сосен in vivo и in vitro сосновой нематодой Bursaphelenchus xylophilus и выделение индуцированных летучих веществ

Резюме

В протоколе описывается инфекция сосновой нематодой Pinus pinaster in vivo и in vitro и анализ их волютилома с помощью газовой хроматографии (ГХ) и ГХ в сочетании с масс-спектрометрией (ГХ-МС).

Аннотация

Сосновая нематода (PWN) является фитопаразитом, вызывающим болезнь соснового увядания (PWD) у хвойных пород. Эта паразитическая на растениях нематода внесла значительный вклад в вырубку сосновых лесов в азиатских странах, таких как Япония, Китай и Корея. За последние два десятилетия в Европе сильно пострадали Португалия и Испания. Исследования механизмов инфицирования PWN и/или прогрессирования PWD у восприимчивых видов хозяев основаны на контролируемом заражении саженцев сосны в тепличных условиях. Этот метод является трудоемким и мобилизует значительные экономические и человеческие ресурсы. Кроме того, она может быть подвержена изменчивости, которая является результатом генетического разнообразия, связанного с некоторыми видами сосны, а также вмешательством внешних факторов. В качестве альтернативы, сокультуры сосны in vitro с PWN предлагают более выгодную систему для изучения биохимических изменений, поскольку они а) позволяют контролировать отдельные переменные окружающей среды или питания, б) занимают меньше места, в) требуют меньше времени для получения и г) свободны от загрязнения или генетической изменчивости хозяина. В следующем протоколе подробно описана стандартная in vivo инфекция PWN Pinus pinaster, морской сосны, и создание новых in vitro сокультур сосновых побегов с помощью PWN в качестве улучшенной методологии изучения влияния фитопаразита на летучие вещества сосны. Индуцированные PWN летучие вещества экстрагируются из инфицированных in vivo и in vitro сосен путем гидродистилляции и дистилляционной экстракции, а выделяемые летучие вещества улавливаются твердофазной микроэкстракцией (SPME) с использованием волоконных или колонных методов.

Введение

Сосновая нематода (PWN), Bursaphelenchus xylophilus (Steiner & Bührer 1934) Nickle 1970, является паразитической нематодой растений, которая в основном паразитирует на видах Pinus . Этот фитопаразит переносится насекомыми рода Monochamus на деревья восприимчивых видов сосны в период созревания пищи насекомого. PWN убивает дерево, атакуя его смоляные каналы и уменьшая поток смолы, а также повреждая его сосудистую ткань, вызывая перебои в толще воды. Недостаток воды в кронах деревьев вызывает первые видимые симптомы болезни соснового увядания (PWD), т.е. сосновая хвоя становится хлоротичной после прекращения фотосинтеза и поникает из-за высыхания. Сосна обычно реагирует на биотический и абиотический стресс путем производства смолы и летучих соединений¹. Таким образом, понимание механизмов защиты сосны важно для определения конкретных эффектов атак PWN и поиска альтернативных^{методов борьбы с} вредителями.

В настоящее время эксперименты в полевых условиях зависят от наличия зараженных сосен, подтверждения инфекции PWN и изменяющихся условий окружающей среды. В тепличных условиях эти параметры можно легче контролировать; Тем не менее, генетическое разнообразие хозяина становится сильным источником изменчивости³. Например, в исследовании реакции на резистентность Pinus pinaster выработка терпенового лимонена и смоляных кислот была связана с инфекцией PWN⁴. Однако из-за небольшого количества образцов и изменчивости природных условий обнаруживаемые изменения были зарегистрированы только в половине образцов. В другом исследовании с использованием саженцев сосны, выращенных в теплицах, несмотря на то, что условия окружающей среды легче контролировать, природное генетическое разнообразие сосны вызывало большую изменчивость извлекаемых летучих веществ^. Поскольку вызванные болезнями летучие вещества сосны могут в значительной степени зависеть от окружающей среды и генетических вариаций, обращение к культурам побегов in vitro является хорошей альтернативой для исследований химической и биохимической реакции тканей сосны на инфекцию PWN ^5,6. Размножая генотип растения in vitro, его генетический состав может быть сохранен и клонирован на неопределенный срок, что приводит к созданию большего количества генетически идентичных особей в меньшем пространстве и за меньшее время, чем в условиях in vivo. Эти культуры представляют собой простую рабочую систему в легко манипулируемых условиях питания и окружающей среды, поэтому они предлагают дополнительные преимущества по сравнению с обычными системами при оценке производства и эмиссии летучих^{веществ.} Эти системы особенно полезны для исследований древесных пород, которые в большинстве случаев требуют значительных ресурсов, т.е. целевые деревья иногда расположены в труднодоступных местах, требуют дорогостоящего оборудования, специальной рабочей силы и более длительных периодов анализа⁸. In vitro сокультуры сосны с PWN позволяют оценить метаболические взаимодействия между нематодой и растением на разных стадиях⁹. Для анализа летучих веществ это очень важно, поскольку методы профилирования стали высокоточными, и незначительные изменения в выборке могут привести к существенным изменениям профилей летучих веществ. Газовая хроматография в сочетании с масс-спектрометрией (ГХ-МС) является мощным методом анализа летучих веществ и позволяет быстро и упорядочить профилирование летучих веществ^. Представленный здесь протокол описывает методы заражения in vivo саженцев сосны в тепличных условиях и культур in vitro побегов генетически идентичных сосен, оптимизированных для экстракции и профилирования индуцированных летучих веществ.

протокол

1. Выращивание в пробирке нематоды сосны

ПРИМЕЧАНИЕ: Сосновые нематоды выращиваются путем кормления грибным мицелием неспорулирующего штамма Botrytis cinerea (de Bary) Whetzel¹¹.

1. Для рутинной субкультуры перенесите культуральную пробку (диаметром 0,5 см) с самой внешней границы колонии гриба на тарелку стерильного картофельного агара с декстрозой (КПК) и держите при температуре 25 ± 1 °C в течение 7-10 дней или до тех пор, пока колония грибов не достигнет края пластины.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Для роста грибов можно использовать другие типы общих грибковых питательных сред.
2. Для получения большего количества PWN используйте B. cinerea, выращенную in vitro на стерилизованных паром гидратированных сертифицированных органических зернах ячменя (Hordeum vulgare L.). Добавьте 15 г крупы в 15 мл сверхчистой воды, в крытые колбы Эрленмейера с широким горлышком объемом 250 мл и простерилизуйте. После этого инокулируйте пробкой для культуры B. cinerea и выдерживайте при температуре 25 ± 1 °C в течение 7-10 дней или до тех пор, пока поверхность злака полностью не колонизируется¹².
   ПРИМЕЧАНИЕ: Нематоды для исследовательских целей могут быть запрошены в национальных референс-лабораториях по паразитическим нематодам на растениях.
3. Инициируйте посевы PWN путем инокуляции культур B. cinerea in vitro водной суспензией PWN (содержащей минимум 20 самцов и 30 самок) и выдерживайте в темноте в описанных выше условиях в течение 7–10 дней или до тех пор, пока колония грибов не будет полностью поглощена и популяция PWN не начнет карабкаться по стенкам планшета или колбы (рис. 1). Запечатайте тарелки или колбы полиэтиленовой пленкой, чтобы избежать высыхания.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Самок можно отличить по лоскуту вульвы, длинному постматочному мешочку и в целом круглому концу хвоста; Самцы имеют вентрально изогнутый заостренный конец хвоста с характерными спикулами¹³. При пипетировании суспензий PWN просейте колонию грибов так, чтобы пипетированная суспензия не образовывала капли на поверхности гриба, захватывая PWN через поверхностное натяжение.
4. Изолируйте PWN, промыв стенки колбы водопроводной водой, вылив содержимое на бумажное полотенце в воронке или лотке Бермана и погрузив в воду¹⁴. Через 24-48 ч живые нематоды должны были переместиться из зараженного материала в воду. Восстанавливают их путем просеивания с помощью сита с ячеями^{38 мкм 15}. Скопившиеся PWN смойте в емкость с водой из-под крана.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Любой материал, вступающий в контакт с PWN, должен быть надлежащим образом обеззаражен, так как он является карантинным организмом; Обычно достаточно погружения в этанол на 10-20 минут. Отбракованные водные суспензии должны быть стерилизованы или нагреты до 60 °С в течение не менее 35 минут.
5. Используйте водную суспензию, содержащую PWN, немедленно или храните ее при температуре 11 °C в течение более длительного периода хранения (до 2 месяцев).

2. Стерилизация нематод сосны смешанной жизненной стадии

1. В проточном колпаке дозируйте объем суспензии PWN, содержащей около 5000 PWN, в стерильное сетчатое сито размером 38 мкм и промойте стерильной водой.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Подсчитайте нематод под бинокулярным микроскопом (40x).
2. Погрузите нижнюю половину сита, содержащего PWN, в 20% раствор перекиси водорода (H₂O₂) и перемешайте вручную в течение 15 минут.
3. Промойте стерильные PWN, пропустив стерильную воду через сито. Повторите этот шаг 3 раза. В последней промывке наклоните сито так, чтобы PWN собрались на границе сита. Стерильную суспензию нематоды восстановить, пипетируя 1 мл стерильной воды в рамку сита, и хранить при температуре 11 °C или использовать немедленно.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Успех стерилизации можно оценить, поместив 100 мкл аликвоты суспензии PWN в среду PDA и регулярно контролируя загрязнения в течение примерно 1 недели.

3. Заражение in vivo рассады Pinus pinaster

ПРИМЕЧАНИЕ: Испытания прививки проводятся на ≥ 2-летних саженцах P. pinaster . Деревья можно приобрести у сертифицированных коммерческих розничных продавцов, но также можно вырастить в теплице из сертифицированных семян.

1. Получите инокулюм PWN, как описано в шаге 1, и установите суспензию смешанных PWN на стадии жизни до 1000 PWNs/мл, добавив воду в суспензию или дождавшись оседания нематод (около 60 мин) и уменьшив объем путем сцеживания поверхностных вод. Проводите подсчет при комнатной температуре на вогнутом предметном стекле под бинокулярным микроскопом при 40-кратном увеличении.
2. Чтобы начать прививку, вручную удалите иголки с участка ниже верхних 5 см ствола сосны и сделайте поверхностный продольный надрез (длиной от 0,5 до 1 см) стерилизованным скальпелем¹⁶.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Разрез выполняется для того, чтобы дать нематоде доступ к внутренним тканям сосны.
3. В зону ранения положите кусок стерилизованной ваты для удержания 0,5 мл пипетированной суспензии PWN и зафиксируйте его прозрачной полоской для поддержания влажности.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Энергично перемешивайте суспензию PWN между каждой инокуляцией, потому что нематоды быстро осядут. Если суспензия высохнет в месте прививки, заражение нематодой может быть безуспешным, поэтому накройте влажную вату соответствующим образом.
4. Для борьбы с соснами замените суспензию PWN стерильной водой.
5. Регулярно следите за прогрессированием PWD и оценивайте симптоматику, количественно оценивая процент обесцвеченных и увядших игл. Оценка 0 баллов за отсутствие внешних симптомов, 1 балл за изменение цвета хвои до 25%, 2 балла за изменение цвета хвои от 25% до 50%, 3 балла за изменение цвета хвои от 50% до 75% и 4 балла за сосны с полностью коричневой хвоей (Рисунок 2).
6. Поддерживайте теплицу во влажных условиях (60%-80%) и часто поливайте (поддерживайте 70% от максимальной влагоудерживающей способности почвы), избегая перепадов температур, поскольку нематоды становятся метаболически неактивными при температуре ниже 10 °C, а развитие может быть нарушено при температуре выше 30 °C.
7. Через 20 дней после инокуляции соберите растительный материал для извлечения летучих веществ, разрезав рассаду у основания стебля и заморозив (-20 °C) в коричневых бумажных пакетах. Для выявления выделяемых летучих веществ (волокна SMPE или набитые пробирки) пробоотбор образцов саженцев сосны следует отбирать немедленно, при комнатной температуре ^5,17.

4. Приживаемость и заражение культур побегов сосны in vitro

1. Перед поверхностной стерилизацией сертифицированные семена P. pinaster промыть в проточной водопроводной воде для удаления самого крупного мусора, а затем обычным раствором моющего средства (1 капля на 40 мл воды), при энергичном перемешивании, промыть более мелкие загрязнения.
2. В проточном колпаке начните стерилизацию поверхности семян, добавив раствор коммерческого отбеливателя (1:4, коммерческий отбеливатель в водопроводной воде) до тех пор, пока промытые семена не будут покрыты, и энергично перемешивайте в течение 15 минут. Утилизируйте раствор отбеливателя и промойте семена 3 раза стерилизованной водой из-под крана.
3. Погрузите семена в раствор этанола (80%, v/v) на 15 минут при энергичном перемешивании, утилизируйте этанол и промойте 3 раза стерилизованной ультрачистой водой.
4. Для проращивания кедровой оболочки стерилизованных семян разбейте стерильным механическим токарным станком в проточном колпаке, изолируйте кедровые орехи и положите их в закрытый контейнер со стерилизованной влажной фильтровальной бумагой, чтобы увлажнить кедровые орехи на ночь⁶.
5. Стратифицировать гидратированные кедровые орехи при температуре 4 °C в течение 7 дней, чтобы выйти из состояния покоя и синхронизировать прорастание, а затем выдерживать в темноте при температуре 25 °C до появления всходов.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Шаг стратификации является необязательным.
6. Перенесите асептически пророщенные сосны в закрытом контейнере на световой фотопериод 16 часов, при термопериоде 24 °C / 18 °C и выдерживайте в течение 2 недель или до тех пор, пока не начнет развиваться основной стебель.
7. В проточном колпаке надземную часть саженца надрезают скальпелем над корнем и переносят в стерилизованную питательную среду Schenk and Hildebrandt (SH)¹⁸ (pH = 5,8) с добавлением 30 г/л сахарозы, 8 г/л агара, 0,5 мг/л 6-бензиламинопурина (BAP, цитокинин) и 0,1 мг/л индол-3-масляной кислоты (IBA, ауксин)⁶, чтобы вызвать размножение микропобегов. Храните культуры в описанных выше условиях в камере для выращивания культур in vitro .
8. В проточном колпаке периодически (около 4 недель) проводят субкультурацию, разрезая ткань каллуса у основания побега (часть, соприкасающаяся с питательной средой) стерильным скальпелем и перенося кластер побегов стерильным пинцетом в свежую питательную среду для размножения.
9. Для удлинения микростебля микропобеги переносят в описанную выше культуральную среду SH, содержащую 3 г/л активированного угля вместо фитогормонов.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Активированный уголь адсорбирует токсиканты и предотвращает чрезмерное накопление фитогормонов на разрезанной ткани¹⁹.
10. При заражении PWN перенесите удлиненные побеги в культуральную среду SH без фитогормонов и активированного угля и добавьте 100-150 смешанных стерилизованных PWN на дне микропобега. Поддерживайте в описанных выше условиях до тех пор, пока симптомы PWD не начнут становиться заметными (Рисунок 3)⁶.
11. Чтобы собрать растительный материал для экстракции летучих веществ, используйте экспланты in vitro немедленно или заморозьте (-20 °C) до анализа. На предмет выделения летучих веществ (волокна SMPE или упакованные пробирки) немедленно проанализируйте коробки с микропобегами.

5. Выделение летучих соединений

Примечание: Выделение летучих веществ может быть выполнено с помощью нескольких методов. В данном случае экстракцию летучих веществ осуществляют путем гидродистилляции с использованием аппарата Клевенджера²⁰, дистилляцию-экстракцию с использованием аппарата²¹ Лайкенса-Никерсона и улавливание летучих веществ в надземном пространстве с помощью твердофазной микроэкстракции (SPME) с использованием волокон с покрытием или насадочных трубок (пористый полимерный сорбент)²².

1. Гидродистилляция
   1. Используйте аппарат Клевенджера для выделения эфирных масел. Система дистилляции состоит из: а) аппарата Клевенджера, б) колбы с круглым дном или колбы Эрленмейера для удержания воды и соснового материала, в) подходящего нагревательного оборудования и г) опорной рамы для удержания системы на месте (рис. 4А).
   2. Перед использованием тщательно очистите стеклянную посуду. Используйте лабораторные зажимы для крепления аппарата Клевенджера к решетчатой раме. Охладите системный конденсатор с помощью циркуляционной воды или используйте охлаждаемый циркуляционный насос, если таковой имеется.
   3. Зарегистрируйте вес соснового побега и поместите его в колбу с круглым дном или Эрленмейера. Регулируйте количество воды, чтобы емкость была заполнена не более чем наполовину.
   4. Расположите отопительное оборудование под колбой, проверьте отсутствие утечек и убедитесь, что все части системы находятся в правильном положении и закреплены на опорной раме.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Матовое стекло, соединяющее детали клевенджера и колбы, должно быть тщательно очищено, обезжирено и высушено перед соединением. Для этой цели используют лист фильтровальной бумаги, слегка смоченный ацетоном. В этих деталях нельзя использовать смазку.
   5. Введите воду через заливную воронку, расположенную в обратной диагональной трубке в средней части аппарата Клевенджера. Отрегулируйте положение трехстороннего крана так, чтобы вода равномерно текла по двум трубкам (диагональной и градуированной) до наполнения колбы, непосредственно перед тем, как стекать в нее из обратной диагональной трубки (см. рисунок 4).
   6. Включите источник тепла и отрегулируйте его так, чтобы вода закипела со скоростью дистилляции 2 - 3 мл/мин.
   7. Начните время дистилляции, когда первая капля дистиллированной воды попадет в градуированную трубку с правой стороны аппарата Клевенджера. Среднее время дистилляции составляет 3 часа²³ минуты, но в зависимости от конкретных требований могут использоваться более короткие или более длительные периоды дистилляции. Эфирные масла обычно находятся в надосадочной жидкости, поскольку они обычно легче, чем дистиллированная ароматическая вода ниже (гидролат).
      ВНИМАНИЕ: Когда дистилляция запущена, аппарат Клевенджера будет горячим на ощупь.
   8. Как только время дистилляции закончится, остановите нагрев и дайте ему постоять около 10 минут, чтобы дистилляция и кипячение прекратились. Через 10 минут откройте кран по часовой стрелке, чтобы гидролат вытекал, пока эфирное масло не достигнет градуированной части. Считайте объем эфирного масла изолированно. Рассчитайте выход в мл/г (свежая или сухая масса), выраженный в процентах (%, v/w).
   9. В случае эфирных масел с объемом менее 0,05 мл, наименьшей градуировкой в градуированной пробирке, выход не может быть определен. Чтобы восстановить эфирное масло, используйте дистиллированный н-пентан для промывки аппарата Клевенджера.
   10. Чтобы восстановить эфирное масло с помощью дистиллированного н-пентана, после окончания дистилляции подождите от 10 до 15 минут и откройте трехсторонний кран против часовой стрелки, чтобы гидролат вытек из обратной диагональной трубки прямо под заливной воронкой. С помощью чистой пипетки введите дистиллированный н-пентан в заливную воронку до верхней левой стороны обратной диагональной трубки. Избегайте прикосновения к заправочной воронке, чтобы предотвратить перекрестное загрязнение.
   11. С помощью бутылки для мытья дистиллированной водой введите воду в заливную воронку. Н-пентан будет стекать в дистилляционную колбу и испаряться с остаточным теплом отварной воды. Таким образом, он проходит через систему, растворяется и тянет летучие вещества к поверхности гидролата в градуированной трубке. Откройте трехсторонний кран по часовой стрелке в исходное положение.
   12. Действуйте, как в пункте 5.1.8. Для сбора эфирное масло растворено в N-пентане.
   13. Сконцентрируйте смесь эфирного масла и н-пентана до минимального объема около 100 мкл при комнатной температуре под флюсом азота с помощью системы продувочного испарителя. Держите его при -20 °C до анализа.
       ПРИМЕЧАНИЕ: Не концентрируйтесь до полного высыхания, чтобы избежать потери летучих соединений.
2. Дистилляция-экстракция
   1. Используйте аппарат Лайкенса-Никерсона для извлечения летучих веществ из растений. Дистилляционно-экстракционная система состоит из: а) аппарата Лайкенса-Никерсона, б) колбы с круглым дном для хранения воды и соснового материала (правый боковой рычаг дистилляционной установки) и еще одной для хранения несмешивающегося органического растворителя, такого как дистиллированный н-пентан (левый боковой рычаг дистилляционной установки), в) двух подходящих нагревательных устройств, г) конденсатора, и д) опорная рама для удержания системы (рисунок 4B).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте дистиллированный н-пентан в лаборатории, чтобы избежать загрязнения образца стабилизаторами, добавленными растворителем.
   2. Начните с циркуляции воды в защищенном конденсаторе или используйте охлаждающий циркуляционный насос, если он доступен.
   3. Используйте зажимы лабораторной рамы для крепления дистилляционно-экстракционной установки к решетчатой раме. Наполните колбу с круглым дном сосновым материалом, который нужно извлечь, и долейте воду до половины заполненной емкости. Меньшая колба с круглым дном объемом 100 мл должна быть наполовину заполнена дистиллированным н-пентаном.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Перед подключением соединительные детали компонентов из матового стекла должны быть хорошо очищены, обезжирены и высушены. Для очистки можно использовать лист фильтровальной бумаги, который был кратковременно намочен ацетоном.
   4. Расположите нагревательные кожухи под каждой колбой. Убедитесь в отсутствии утечек и в том, что каждый компонент системы правильно расположен и закреплен на решетчатой раме лаборатории. Включите источники тепла и отрегулируйте их до соответствующей точки кипения. Вода должна кипеть со скоростью дистилляции 2-3 мл/мин.
      ВНИМАНИЕ: В процессе дистилляции-экстракции аппарат Лайкенса-Никерсона будет горячим на ощупь.
   5. Как только время дистилляции закончится, прекратите нагрев колбы с сосновым материалом и дайте н-пентану дистиллироваться отдельно в течение 10 минут. После того, как н-пентан превратится в прозрачную жидкость, остановите нагрев и дайте ему постоять около 10 минут. Изменение цвета говорит о том, что дистиллят теперь находится в колбе с н-пентаном.
   6. Сконцентрируйте экстракт н-пентана при пониженном давлении (70 - 73 мм рт.ст.) на ротационном испарителе при комнатной температуре. Переложите частично концентрированный экстракт во флакон и сконцентрируйте его до ≈100 мкл под потоком азота в продувочном испарителе при комнатной температуре. После экстракции образцы хранят при температуре -20 °C до анализа.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Экстракт не должен быть концентрированным до сухости, так как это приведет к потере летучих соединений.
3. Отбор проб в свободном пространстве с волокном с покрытием
   1. Установка твердофазной микроэкстракции (SPME) включает в себя: а) держатель SPME с ручным управлением, b) волокно с покрытием и c) подходящую подставку для поддержки держателя SPME (Рисунок 4C). Для использования настоящего протокола используйте ручную систему SPME-headspace с покрытием из 100 мкМ полидиметилсилоксана (PDMS) для улавливания летучих веществ.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Другие коммерчески доступные волокна имеют покрытия с различными химическими характеристиками и должны выбираться в соответствии с желаемым эффектом.
   2. Перед использованием каждое волокно SPME термически выдержите в течение 20 минут при температуре 250 °C в соответствии с рекомендациями производителя.
   3. Вставьте сосновый материал или сосновую часть в прозрачный стеклянный флакон и запечатайте его дырчатой завинчивающейся крышкой с вкладышем (перегородкой) из политетрафторэтилена (ПТФЭ). Материал должен находиться на расстоянии не менее 2 – 3 см от верха флакона, чтобы волокно не касалось образца.
   4. Одновременное проведение контрольных экспериментов с использованием волокон SPME путем отбора проб из пустых флаконов для выявления системных загрязнителей или подтверждения отсутствия уноса от повторного использования волокон SPME.
   5. Сосновый материал необходимо хранить внутри флакона в течение 1 ч перед сбором летучих веществ для обеспечения равновесия атмосферы.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Анализы с SPME можно проводить при комнатной температуре или при регулируемой температуре, поместив флаконы в опорный штатив и вставив их в ванну Bain Marie.
   6. Отрегулируйте глубину иглы для прокалывания перегородки с держателя SPME, чтобы проколоть перегородку, но не соприкасаться с материалом при обнажении волокна.
   7. Когда волокно извлечено, вставьте иглу держателя через вкладыш из ПТФЭ. Нажмите на поршень, чтобы обнажить волокно. Поверните поршень по часовой стрелке и удерживайте стопорный винт на горизонтальной левой стороне Z-образного паза²⁴. Выставьте волокно на 1 ч.
   8. Втяните волокно, поворачивая поршень против часовой стрелки, пока поршень не достигнет верхней части Z-образного паза. Собранные летучие вещества теперь готовы к прямому анализу GC и/или GC-MS.
      ПРИМЕЧАНИЕ: При необходимости волокна можно хранить при комнатной температуре перед анализом, но не дольше недели.
4. Захват свободного пространства с помощью набивных труб
   1. Подготовьте установку для улавливания летучих веществ в свободном пространстве с помощью насадочных ловушек из нержавеющей стали, состоящих из: а) насосной системы массового потока, б) трубок из ПТФЭ, в) воздушных фильтров с активированным углем, г) трубок с полимерной насадкой из пористой смолы и д) стеклянной посуды или мешков из полиэтилентерефталата (ПЭТ) (мешки для приготовления пищи) (Рисунок 4D)²⁵.
   2. Храните сосновый материал в закрытой стеклянной посуде или в ПЭТ-пакетах, чтобы не накопить летучие вещества.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Имейте в виду, что летучие вещества из обычного пластика широко распространены и могут быть обнаружены в больших количествах с помощью ГХ-МС.
   3. Для системы с замкнутым контуром соедините контур следующим образом: а) выход насоса к трубке из ПТФЭ, б) трубка из ПТФЭ к воздушным фильтрам с активированным углем, в) от воздушных фильтров с воздушным углем к дополнительной трубке, соединенной со стеклянной посудой или ПЭТ-мешками с сосновым материалом, г) упакованная трубка к выходному отверстию стеклянной посуды или ПЭТ-пакета, д) дополнительные трубки из ПТФЭ от выхода трубки из нержавеющей стали до входа насоса массового расхода²².
      ПРИМЕЧАНИЕ: Пористые полимерные насадки из нержавеющей стали должны быть термически выдержаны в установке термической десорбции в соответствии с рекомендациями производителя, например, до 15 минут при 100 °C перед использованием. Имейте в виду, что трубки имеют направление потока, которое следует соблюдать.
   4. Собирайте летучие вещества, прокачивая 100 л отфильтрованного воздуха через сосновую систему со скоростью 0,6 л в минуту, используя насос массового расхода для контроля количества и скорости отфильтрованного воздуха.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Количество и/или поток воздуха в свободном пространстве, который проходит через колонку, может влиять на количество захваченных летучих веществ и, следовательно, на получаемую хроматограмму.
   5. После сбора летучих веществ закройте упакованные пробирки с обоих концов герметичными крышками для хранения. Хранить при комнатной температуре (максимум 1 неделю) и как можно скорее провести анализ, так как летучие вещества могут разлагаться или улетучиваться.
   6. Для мытья промойте все трубки из ПТФЭ и стеклянную посуду 70% этанолом и нагрейте в духовке при температуре 230 °C в течение не менее 2 часов²⁵ минут.

6. Анализ летучих профилей

1. Выполняйте анализ профилей летучих веществ с помощью газовой хромато-масс-спектрометрии (GC-MS) или рутинной газовой хроматографии с детектированием пламенной ионизации (GC-FID) для количественного определения ранее идентифицированных летучих веществ.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Описание методов анализа с помощью ГХ-ФИД и ГХ-МС является обширным и выходит за рамки цели настоящей работы. Читателю рекомендуется использовать лабораторные процедуры или стандарты, такие как ISO 7609²⁶, которые обеспечивают соответствующие рабочие условия для количественной оценки отдельных составляющих и литературные данные по сравнению двух аналитических методов²⁷.
2. Используйте аналиты, которые являются чистыми или переносятся в растворителе, например, н-пентан или н-гексан, и непосредственно впрыскиваются или адсорбируются в волокно, например, SPME и десорбируются непосредственно в инжекторе хроматографа или с помощью установки термической десорбции (TD), связанной с блоком GC.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Несмотря на большую чувствительность, более высокое разрешение и более короткое время анализа, капиллярные колонки имеют низкую емкость образца. Таким образом, хотя почти все условия эксплуатации могут быть схожими, тип аналита (чистый, в растворителе, SPME и т.д.) может требовать различных процедур расщепления/расщепления введения.
3. Проводить идентификацию летучих компонентов путем сравнения их индексов удержания, оцененных в соответствии со стандартом ISO 7609, со спектрами ГХ-МС из библиотеки, созданной в лаборатории, с использованием эталонных образцов, идентичность компонентов которых установлена с помощью RI, GC-MS и ¹³C-NMR, лабораторно синтезированных и выделенных соединений и коммерчески доступных стандартов, или, при их отсутствии, коммерчески доступных библиотек масс-спектров.
4. Выразите результаты с помощью графического представления (хроматограммы) и хроматографического профиля, в котором перечислены относительные количества всех идентифицированных соединений в образце, а порядок их элюирования обозначен индексами удержания в подходящем используемом столбце.
5. Для большого количества образцов выполните подходящий статистический анализ на основе химического состава для интерпретации расположения образцов (группировки и/или разделения).

Результаты

PWN быстро размножается в оптимальных условиях, а время генерации может составлять всего 4 дня, при этом каждая самка откладывает около 80 яиц в течение своей^{жизни 28}. Используя описанную выше методологию, можно получить большое количество PWN в зависимости от...

Обсуждение

В представленном здесь протоколе изложена усовершенствованная методология анализа летучих соединений в морской кедре, инфицированной PWN, где экологическая и генетическая изменчивость снижена и не влияет на результаты. Используя чистые линии генотипов морской сосн?...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
38 mesh test sieve	Retsch	60.131.000038
6-Benzylaminopurine (6-BAP)	Duchefa Biochemie	B0904
Charcoal activated	Duchefa Biochemie	C1302
Clevenger apparatus	WINZER Laborglastechnik	25-000-02
Hydrogen peroxide solution	Sigma-Aldrich	H1009-500ML
Indole-3-butyric acid (IBA)	Duchefa Biochemie	I0902
Likens-Nickerson apparatus	VitriLab LDA.	c/IN29/32
Microbox round containers	Sac O2	O118/80+OD118
n-Pentane	Sigma-Aldrich	1.00882
PARAFILM M sealing film	BRAND	HS234526B-1EA
Phyto agar	Duchefa Biochemie	P1003
Potato Dextrose Agar	BD DIFCO	213400
Scalpel blade no. 24	Romed Holland	BLADE24
Schenk & Hildebrandt Basal salt medium	Duchefa Biochemie	S0225
Schenk & Hildebrandt vitamin mixture	Duchefa Biochemie	S0411
SPME fiber assembly Polydimethylsiloxane (PDMS)	Supelco	57300-U
SPME Fiber Holder	Supelco	57330-U
Sucrose	Duchefa Biochemie	S0809
Tenax TA- stainless steel tubes- conditioned + capped	Markes International	C1-AAXX-5003