JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

يصف هذا البروتوكول طريقة جديدة لإنشاء عضيات ثلاثية الأبعاد في الدماغ المتوسط من الخلايا الجذعية متعددة القدرات التي يسببها الإنسان ، وتوجيه تكوينها لتقليد أنسجة الدماغ المتوسط الأصلية ، وبالتالي المساعدة في دراسة التطور والاضطرابات.

Abstract

يمثل تطوير عضيات الدماغ المتوسط (MOs) من الخلايا الجذعية البشرية متعددة القدرات (hPSCs) تقدما كبيرا في فهم نمو الدماغ ، وتسهيل النمذجة الدقيقة للأمراض ، وتطوير البحوث العلاجية. يحدد هذا البروتوكول طريقة لتوليد عضيات خاصة بالدماغ الأوسط باستخدام الخلايا الجذعية المستحثة متعددة القدرات (iPSCs) ، باستخدام نهج التمايز الاستراتيجي. وتشمل التقنيات الرئيسية تثبيط SMAD المزدوج لقمع إشارات SMAD, إدارة عامل نمو الخلايا الليفية 8 ب (FGF-8b), وتنشيط مسار القنفذ سونيك باستخدام بورمورفامين ناهض, توجيه iPSCs نحو مصير منتصف الدماغ.

تحقق العضيات التي تنتجها هذه الطريقة أقطار تصل إلى 2 مم وتتضمن مجموعة متنوعة من أنواع الخلايا الظهارية العصبية ، مما يعكس التنوع الخلوي المتأصل في الدماغ المتوسط. يتضمن التحقق من صحة هذه العضيات كهياكل أصلية للدماغ المتوسط التعبير عن علامات خاصة بالدماغ الأوسط ، مما يؤكد هويتها. نتيجة ملحوظة لهذه المنهجية هو التمايز الفعال من iPSCs إلى الخلايا العصبية الدوبامينية, التي هي سمة من سمات الدماغ المتوسط.

تكمن أهمية هذا البروتوكول في قدرته على إنتاج عضيات ناضجة وظيفيا خاصة بالدماغ الأوسط تكرر عن كثب الجوانب الأساسية للدماغ المتوسط ، مما يوفر نموذجا قيما للاستكشاف المتعمق لعمليات نمو الدماغ الأوسط والفيزيولوجيا المرضية للاضطرابات ذات الصلة مثل مرض باركنسون. وبالتالي ، فإن هذا البروتوكول بمثابة مورد مهم للباحثين الذين يسعون إلى تعزيز فهمنا للدماغ البشري وتطوير علاجات جديدة للأمراض التنكسية العصبية ، مما يجعله أداة لا غنى عنها في مجال البحوث العصبية.

Introduction

يمثل الدماغ البشري ، بهندسته المعمارية المعقدة وتكوينه الخلوي والجزيئي المعقد ، تحديات هائلة في أبحاث علم الأعصاب ، لا سيما في سياق نمذجة الأمراض وتطوير العلاجالخلوي 1. تزداد هذه التحديات تعقيدا بسبب التوافر المحدود للنماذج المختبرية المتطورة التي تمثل حقا تعقيد الدماغ البشري. ومع ذلك ، فإن التطورات الحديثة في تقنية الخلايا الجذعية متعددة القدرات التي يسببها الإنسان (iPSC) ، والتي تتيح التمايز الخاضع للرتحكم إلى أنواع فرعية من الخلايا العصبية المحددة ، قد فتحت طرقا واعدة لاستكشاف نمو الدماغ البشري ، والتسبب في المرض ، والاستراتيجيات العلاجية القائمة على الخلايا.

تقليديا, ثنائي الأبعاد (2D) الثقافات العصبية المشتقة من iPSCs كانت حجر الزاوية في الدراسات في المختبر التي تهدف إلى محاكاة فسيولوجيا الخلايا العصبية البشرية وعلم الأمراض. لعبت هذه الثقافات أحادية الطبقة دورا أساسيا في تعزيز فهمنا للأمراض العصبية وفي اكتشاف عوامل الحماية العصبية2،3،4،5،6،7. على الرغم من فائدتها ، فإن هذه الأنظمة ثنائية الأبعاد تقصر في محاكاة التنوع الخلوي الحقيقي والبنية ثلاثية الأبعاد (ثلاثية الأبعاد) للدماغ البشري.

يمثل ظهور التكنولوجيا العضوية للدماغ قفزة كبيرة في النمذجة المختبرية ، مما يوفر أداة تحاكي عن كثب البيولوجيا المعقدة للدماغ البشري ضمن إطار ذي صلة من الناحية الفسيولوجية8. التقنيات المبكرة في تطوير العضوية في الدماغ استفادت من الخصائص التنظيمية المتأصلة في iPSCs لتشكيل مشتقات الأديم الظاهر تلقائيا, وبالتالي محاكاة المراحل المبكرة من نموالدماغ 5,9,10,11,12. بالنظر إلى الشبكات المعقدة التي تشكلها الخلايا العصبية مع الخلايا العصبية وغير العصبية الأخرى ، تصبح النمذجة ثلاثية الأبعاد ضرورية لدراسة الأمراض التنكسية العصبية بدقة. توفر الثقافات ثلاثية الأبعاد بيئة أكثر تمثيلا في الجسم الحي ، مما يسهل التمايز العصبي المتسارع وتكوين الشبكة12،13،14 ، وتعزز تعبيرا أوسع عن الجينات العصبية مقارنة بالثقافات ثنائية الأبعاد15. تحقق الخلايا العصبية التي تم تطويرها في سياقات ثلاثية الأبعاد مورفولوجيا وسمات فسيولوجية تذكرنا أكثر بنظيراتها في الجسم الحي 16.

كانت التطورات الحديثة في نماذج الدماغ ثلاثية الأبعاد محورية في التقاط التعقيد المكاني والوظيفي للدماغ البشري بشكل أكثر فعالية. على مدى العقد الماضي ، أثبت تقدم البروتوكولات المتنوعة لتوليد كل من عضيات الدماغ بالكامل ونماذج الدماغ الخاصةبالمنطقة 11،17،18،19،20،21،22 أنه لا يقدر بثمن في نمذجة الاضطرابات العصبية مثل صغر الرأس11 ، ومرض الزهايمر14،23 ، ومرض باركنسون24. الهدف من هذا البروتوكول هو تطوير وتحسين طريقة لإنشاء MOs بشرية ثلاثية الأبعاد مشتقة من iPSCs البشرية. يهدف هذا البروتوكول على وجه التحديد إلى توليد العضيات المخصبة بالخلايا العصبية الدوبامين والمنظمة مكانيا بطريقة تحاكي عن كثب الهيكل الطبيعي ووظائف الدماغ المتوسط البشري. الغرض الأساسي من هذه العضيات هو العمل كنماذج متقدمة في المختبر لدراسة مرض باركنسون ، مما يوفر نظاما أكثر دقة وذات صلة من الناحية الفسيولوجية لاستكشاف عمليات النمو العصبي والأمراض المرتبطة بهذه الحالة. من خلال الاستفادة من iPSCs المشتقة من المريض لتوليد هذه العضيات الخاصة بالدماغ المتوسط, يسعى البروتوكول إلى تعزيز فهم آليات مرض باركنسون, تسهيل اكتشاف الأهداف العلاجية المحتملة, وتحسين تطوير العلاجات القائمة على الخلايا. من خلال هذا النهج المبتكر ، يهدف البروتوكول إلى التغلب على قيود الثقافات العصبية التقليدية ثنائية الأبعاد والمساهمة بشكل كبير في مجال أبحاث الأمراض التنكسية العصبية من خلال تقديم أداة فعالة لنمذجة الأمراض في المختبر واستكشاف استراتيجيات علاج جديدة.

على مدى السنوات العشر الماضية ، طورت فرق بحثية مختلفة عضيات الدماغ المتوسط (MOs) 8،21،25،26،27،28 ، باستخدام المنهجيات التي تظهر العديد من أوجه التشابه الرئيسية. في سعينا لتعميق فهم مرض باركنسون ، قمنا بتطوير بروتوكول لإنشاء MOs بشرية ثلاثية الأبعاد مشتقة من iPSCs البشرية. تقدم هذه العضيات ، المخصبة بالخلايا العصبية الدوبامينية المرتبة مكانيا ، نموذجا مثاليا لدراسة مرض باركنسون. لقد أسفر تطويرنا وتحسيننا لبروتوكولات العضوية الخاصة بالدماغ الأوسط عن نماذج متقدمة في المختبر ساهمت بشكل كبير في فهمنا لعمليات النمو العصبي والأمراض التنكسية العصبية. أثبتت هذه النماذج ، خاصة عند تطبيقها على MOs المشتقة من المريض ، فعاليتها كأدوات قوية لنمذجة الأمراض في المختبر ، وتقدم وجهات نظر ومنهجيات جديدة في مجال زراعة الخلايا ثلاثية الأبعاد المتقدمة.

Protocol

iPSCs المتولدة من الخلايا الليفية البشرية الطبيعية ديترويت 551 والخلايا الجذعية الجنينية البشرية (ESCs) خط hESC 360 كما هو موضحسابقا 4. تم الحصول على iPSCs بموافقة لجنة غرب النرويج لبحوث الصحة الأخلاقية REK nr. 2012/919. تمت مراقبة جميع الخلايا بانتظام بحثا عن تلوث الميكوبلازما باستخدام مجموعة MycoAlert Mycoplasma Detect. يحتوي جدول المواد على معلومات حول جميع المواد والكواشف والمعدات المستخدمة في هذا البروتوكول. يصف الجدول 1 الوسائط وغيرها من المخزونات المستخدمة.

1. ذوبان iPSCs

  1. صفيحة مطلية بالمصفوفة وإعداد متوسط أساسي 8 (E8)
    1. قم بإذابة قارورة مصفوفة الغشاء القاعدي على الجليد طوال الليل. خفف 1: 100 في وسط النسر المعدل المتقدم المتقدم البارد (DMEM) / Ham's F12 DMEM / F12 (تركيز نهائي 1٪) (انظر جدول المواد والجدول 1). قم بتخزين الحصص عند -20 درجة مئوية للاستخدام طويل الأمد.
    2. قم بإذابة الغشاء القاعدي المخفف عند 4 درجات مئوية ؛ قم بتغطية صفيحة من 6 آبار ب 1 مل من المحلول لكل بئر. احتضان عند 37 درجة مئوية لمدة 1 ساعة.
    3. قم بإزالة اللوحة من الحاضنة واتركها تتوازن مع درجة حرارة الغرفة (RT).
      ملاحظة: يمكن تبريد الأطباق لمدة أقصاها أسبوعين (تأكد من التسخين إلى RT قبل الاستخدام). للتخزين المطول ، أضف 1 مل من E8 Medium (انظر جدول المواد والجدول 1) إلى اللوحة المطلية لتجنب جفاف الجل.
  2. إعداد E8 متوسط
    1. في بيئة معقمة ، امزج الوسط القاعدي E8 مع مكمل E8 (انظر جدول المواد والجدول 1).
      ملاحظة: يمكن تخزينه في درجة حرارة 4 درجات مئوية لمدة أسبوعين. قم بإذابة مكمل E8 المجمد طوال الليل عند 4 درجات مئوية قبل تحضير الوسط الكامل. لا تذوب عند 37 درجة مئوية ، فقد يضر ذلك باستقرارها. قبل الاستخدام، قم بتسخين الحجم المطلوب فقط من E8 من درجة حرارة الغرفة المتوسطة إلى الغرفة (RT) حتى يختفي من البرودة عند لمسها.

2. بذر iPSCs

  1. قم بتسخين الألواح المطلية بالمصفوفة و E8 Medium في RT أو الحاضنة عند 37 درجة مئوية.
  2. وسط ثقافة الشفط ؛ شطف iPSCs, التي هي في 60٪ -70٪ التقاء, مع Dulbecco's محلول ملحي مخزن الفوسفات بدون الكالسيوم والمغنيسيوم (DPBS Ca2+/Mg2+-free,4 مل لكل بئر في 6 آبار صفيحة).
  3. أضف حمض الإيثيلين ديامين تترا أسيتيك (EDTA ، 0.5 ملي مولار ، 1 مل لكل بئر ، انظر جدول المواد والجدول 1) ؛ احتضن عند 37 درجة مئوية حتى تنفصل حواف المستعمرة (3-5 دقائق).
  4. استنشاق حل التفكك. لفصل المستعمرات ، قم بسحب ماصة E8 Medium الدافئة مسبقا بعناية (4 مل لكل بئر) مباشرة على المستعمرات بقوة أقوى من المعتاد من الماصة ، مما يولد حركة سائلة موضعية على سطح الخلية.
  5. قم بتقسيم الخلايا بنسبة 1: 2 عن طريق نقلها إلى بئرين جديدين من صفيحة 6 آبار مطلية بالمصفوفة ، مع إضافة 2 مل من الوسط لكل بئر. ثم احتضن عند 37 درجة مئوية.
  6. تبادل وسائل الإعلام يوميا حتى تصل المستعمرات إلى 80٪ من التقاء.
  7. باستخدام مجهر بتكبير 10 أضعاف ، راقب المستعمرات للتأكد من أنها ذات حجم مناسب ، وتتميز عادة بشكل دائري مميز يتراوح قطره من 0.5 إلى 1 مم. تأكد من أن المستعمرات عبارة عن هياكل كثيفة ومضغوطة تتميز بحدود محددة وناعمة.

3. الحث العصبي

  1. إعداد متوسط وإعداد اليوم 0
    1. قم بإعداد 500 مل لكل من وسط محدد كيميائيا (CDM) ، ووسط الحث العصبي (NIM) ، ووسط مصل الخلايا الجذعية العصبية (NSC SF) ، مع الإشارة إلى جدول المواد والجدول 1.
    2. اشطف الخلايا في طبق مكون من 6 آبار مع 4 مل من DPBS (1x) (Ca2 +/Mg2+- مجانا) لكل بئر ، متبوعا بإضافة 3 مل من NIM لكل بئر لإعداد اليوم 0.
    3. استبدال NIM (3 مل لكل بئر) في الأيام 1 و 3 و 5 ؛ راقب يوميا تحت المجهر.
    4. في اليوم 6 ، افصل الوريدات العصبية في ثقافة التعليق باستخدام الخطوات التالية.
      1. يغسل برفق مرة واحدة باستخدام DPBS (1x) (Ca2 + / Mg2 + - مجانا) (4 مل لكل بئر في طبق 6 آبار). أضف الكولاجيناز الرابع (1 مل لكل بئر في طبق 6 آبار) واحتضنه لمدة 1 دقيقة. قم بإزالة الكولاجيناز IV ، واشطفه برفق مرة واحدة باستخدام DPBS (1x) (Ca2 + / Mg2 + - مجاني) (4 مل لكل بئر في طبق من 6 آبار).
      2. أضف 2 مل من NSC SF Medium إلى كل بئر من صفيحة 6 آبار. افصل الخلايا عن طريق كشط قيعان الآبار ، وإنشاء شبكات بطرف ماصة 200 ميكرولتر.
      3. انقل معلق الخلية من اللوحة المكونة من 6 آبار إلى طبق غير ملتصق مقاس 10 سم. اضبط مستوى الصوت على 12 مل باستخدام NSC SF Medium.
      4. ضع الطبق غير اللاصق على شاكر (شاكر مداري صغير الحجم ssm1) عند 85 دورة في الدقيقة بزاوية 0 درجة في حاضنة مضبوطة على 37 درجة مئوية مع 5٪ ثاني أكسيدالكربون 2 لمنع التجميع.

4. زخرفة الدماغ المتوسط

  1. في اليوم 7 ، أضف 12 مل من آلية التنمية النظيفة مع 100 نانوغرام / مل FGF-8b ؛ ضعها على حاضنة شاكر المدارية.
  2. في الأيام 8-13 ، قم بتغيير الوسيط كل يومين ؛ راقب تحت المجهر يوميا.
  3. في اليوم 14 ، أضف 12 مل من آلية التنمية النظيفة مع 100 نانوغرام / مل FGF-8b و 1 ميكرومتر بورمورفامين (PM) ؛ ضعها على شاكر مداري.
  4. في الأيام 15-20 ، قم بتغيير الوسيط كل يومين ؛ راقب تحت المجهر يوميا.

5. تضمين Matrigel وإنهاء MO والنضج

  1. قم بإذابة Matrigel على الجليد عند درجة حرارة تتراوح بين 2 درجة مئوية و 8 درجات مئوية لمدة 1-2 ساعة.
    ملاحظة: قم بإذابة كمية كافية من Matrigel لتوفير 15 ميكرولتر لكل جسم جنيني (EB). حافظ على Matrigel مبردا على الجليد لتجنب البلمرة المبكرة. قم بتبريد جميع الأواني البلاستيكية التي ستكون على اتصال ب Matrigel عند -20 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة على الأقل قبل الاستخدام.
  2. ضع ورقة تضمين عضوية معقمة في طبق فارغ.
  3. باستخدام طرف ماصة عريض التجويف سعة 200 ميكرولتر، أخرج العضوي برفق من الطبق وانقله إلى سطح التضمين باستخدام عضو واحد لكل بئر. كرر هذه العملية حتى يتم جمع 12-16 EBs على سطح التضمين.
  4. قم بإزالة الوسط الزائد بعناية من كل EB ثم أضف 15 ميكرولتر من Matrigel البارد بالتنقيط على كل EB. بمساعدة ماصة، أعد وضع EB إلى مركز قطرة Matrigel.
  5. احتضان اللوحة في حاضنة مثبتة على درجة حرارة 37 درجة مئوية لمدة 15-20 دقيقة للسماح ل Matrigel بالبلمرة.
  6. باستخدام ملقط معقم ، ارفع ورقة التضمين بقطرات Matrigel. أمسك الورقة مباشرة فوق بئر واحد في صفيحة ملتصقة منخفضة للغاية مكونة من 6 آبار. ماصة تصل إلى 3 مل من CDM مع 10 نانوغرام / مل من عامل التغذية العصبية المشتق من الدماغ (BDNF) و 10 نانوغرام / مل عامل التغذية العصبية المشتق من خط الخلايا الدبقية (GDNF) وشطف قطرات Matrigel برفق من الورقة في كل بئر. كرر هذه العملية حتى يتم نقل جميع قطرات Matrigel 6-8 إلى بئر واحد.
  7. ضع الألواح على شاكر مداري في حاضنة 37 درجة مئوية عند 85 دورة في الدقيقة وقم بتغيير آلية التنمية النظيفة ب 10 نانوغرام / مل BDNF و 10 نانوغرام / مل GDNF كل 3 أيام.
    ملاحظة: الحفاظ على الثقافات المميزة لمدة تصل إلى 3 أشهر. يظهر التشكل العصبي بعد أسبوعين من الإنهاء. BDNF و GDNF ليسا ضروريين للزراعة بعد 3 أشهر.

6. تلطيخ التألق المناعي

  1. استخدم ماصة سعة 1,000 ميكرولتر لاسترداد العضوية برفق من الوسط ووضعها برفق على شريحة مجهرية بأقل قدر من الوسط.
  2. اتركه يجف تماما في الهواء عند RT. أضف 4٪ بارافورمالدهيد (PFA) (300 ميكرولتر لكل عينة) لمدة 30 دقيقة.
    ملاحظة: PFA خطير وقد يكون له خصائص مسرطنة. تعامل معها بحذر ، وامتنع عن الاتصال المباشر بالجلد والعينين ، وتأكد من الاستخدام داخل غطاء الدخان الكيميائي.
  3. أضف 30٪ محلول سكروز (300 ميكرولتر لكل عينة) إلى الشرائح واتركها تحتضن طوال الليل عند 4 درجات مئوية.
  4. قم بحظر العضيات وتغلغلها عن طريق إضافة المخزن المؤقت المانع (BB) (300 ميكرولتر لكل عينة) ، والذي يتضمن PBS (مع Ca2 + / Mg2+) ، و 0.3٪ Triton X-100 ، و 10٪ مصل الماعز العادي ، لمدة ساعتين في RT (أو بين عشية وضحاها عند 4 درجات مئوية). استخدم قلم حاجز كاره للماء لتحديد العضيات وحصر المخزن المؤقت على الشريحة.
  5. قم بتغطية العينات بحجم مناسب من الأجسام المضادة الأولية في المخزن المؤقت المانع (300 ميكرولتر لكل عينة) ، وبروتين الصندوق المضاد للرأس الشوكي G1 (FOXG1 ، 1: 200) ، وصندوق هوميوبوكس مضاد لتقويم الأسنان 2 (OTX2 ، 1: 100) ، وصندوق مضاد للرأس الشوكي A2 (FOXA2 ، 1: 100) ، ومضاد للتيروزين هيدروكسيلاز (TH ، 1: 100) ، ومضاد SRY (منطقة تحديد الجنس Y) - مربع 2 (SOX2 ، 1: 100) ، بروتين صندوق مضاد للاقتران (PAX6 ، 1: 100) ، والبروتين المرتبط بمضاد للأنابيب الدقيقة 2 (MAP2 1: 500) ، وتحتضن بين عشية وضحاها عند 4 درجات مئوية في الظلام (انظر جدول المواد).
  6. اغسل العينات في 1x PBS لمدة 3 ساعات مع تغييرين إلى ثلاثة تغييرات في المخزن المؤقت على منصة هزازة برفق.
  7. احتضن بالجسم المضاد الثانوي (300 ميكرولتر لكل عينة) ، ومضاد لأليكسا فلور 488 (1: 800) ، ومضاد أليكسا فلور 594 (1: 800) ، ومضاد أليكسا فلور 647 (1: 800) بين عشية وضحاها عند 4 درجات مئوية في غرفة مظلمة رطبة. أضف وصمة عار نووية Hoechst 33342 (1: 5,000) في وقت واحد (انظر جدول المواد).
  8. قم بإزالة الجسم المضاد ، واشطفه بسرعة باستخدام PBS ، ثم أضف PBS الذي يحتوي على 0.01٪ أزيد الصوديوم لمدة 1-2 أيام عند 4 درجات مئوية لمنع التلوث.
  9. قم بشفط PBS ، وإزالة أي محلول زائد ، وتركيب العضيات باستخدام وسيط تركيب (راجع جدول المواد). ضع غطاء ، مع التأكد من منع تكوين فقاعة الهواء ، وقم بتخزينه في غرفة مظلمة في RT لمدة 12 ساعة على الأقل للسماح لوسط التركيب بالبلمرة بالكامل.
    ملاحظة: العينة جاهزة الآن للمراقبة باستخدام المجهر الفلوري.

النتائج

في هذه الدراسة, نقدم بروتوكولا رائدا لاشتقاق MOs من iPSCs. من الأمور الأساسية في منهجيتنا الاستخدام المبتكر لتثبيط SMAD المزدوج ، جنبا إلى جنب بشكل تآزري مع FGF-8b ومسار القنفذ الصوتي (SHH) بورمورفامين (PM). تم تصوير هذا النهج في الشكل 1. تبدأ عملية التمايز بتوجيه iPSCs ن?...

Discussion

في هذا التحقيق, لقد طورنا منهجية للتمييز بين MO و iPSCs. يستخدم بروتوكولنا استراتيجية تثبيط SMAD المزدوجة المعززة بالعوامل المورفولوجية ، بما في ذلك FGF-8b و SHH ناهض PM. يحاكي هذا النهج عن كثب الإشارات التنموية الحاسمة لتطور الدماغ المتوسط. يدفع مسار التمايز الذي أنشأناه إلى تكوين...

Disclosures

ليس لدى المؤلفين أي تضارب في المصالح للإفصاح عنه.

Acknowledgements

تم إنشاء الشكل 1 باستخدام BioRender.com. نشكر جامعة بيرغن ميلتزرز هويسكولفوندز (رقم المشروع: 103517133) ، وجيردا ماير نيكويست جولدبراندسون ، وجيردت ماير نيكويست (رقم المشروع: 103816102) على التمويل.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
CCD Microscope Camera Leica DFC3000 GLeica Microsystems, Germany
Chemically Defined Lipid ConcentrateThermo Fisher Scientific11905031CDM ingredient
Collagenase  IVThermo Fisher Scientific17104019Reagent for gentle dissociation of human iPSCs
Corning non-treated culture dishesSigma-AldrichCLS430589Suspension culture 
DMEM/F-12, GlutaMAX supplementThermo Fisher Scientific10565018Astrocyte differentiation basal Medium
DPBSThermo Fisher Scientific14190250Used for a variety of cell culture wash
EDTAThermo Fisher Scientific15575020Reagent for gentle dissociation of human iPSCs
Essential 8 Basal MediumThermo Fisher ScientificA1516901Basal medium for iPSC culture
Essential 8 Supplement (50x)Thermo Fisher ScientificA1517101Supplement for iPSC culture
FCCPAbcamab120081Eliminates mitochondrial membrane potential and TMRE staining
FGF-basicPeproTech100-18BAstrocyte differentiation medium ingredient
Fluid aspiration system BVC controlVacuubrand, Germany
Formaldehyde (PFA) 16%Thermo Fisher Scientific28908Cell fixation 
GDNFPeprotech450-10DA neurons medium ingredient
Geltrex (Basement membrane matrix)Thermo Fisher ScientificA1413302Used for attachment and maintenance of human iPSCs
GlutaMAX SupplementThermo Fisher Scientific35050061Supplement for NSC culture
Heracell 150i CO2 IncubatorsFisher Scientific, USA
IMDMThermo Fisher Scientific21980032Basal medium for CDM
InSolution AMPK InhibitorSigma-Aldrich171261Neural induction medium ingredient
InsulinRoche1376497CDM ingredient
iPSCs derived from Detroit 551 fibroblats ATCCCCL-110
Leica TCS SP8 STED confocal microscopeLeica Microsystems, Germany
MatrigelLife Science354230Matrigel embedding
MonothioglycerolSigma-AldrichM6145CDM ingredient
Normal goat serumThermo Fisher ScientificPCN5000Used for blocking buffer
Orbital shakers - SSM1Stuart Equipment, UK
Organoid Embedding SheetSTEMCELL Technologies8579Matrigel embedding
Organoid Embedding SheetSTEMCELL Technologies 8579
PBS 1xThermo Fisher Scientific18912014Used for a variety of washes
Poly-D-lysine hydrobromideSigma-AldrichP7405Promotes attachment and growth of neural cells in vitro
Poly-L-ornithine solutionSigma-AldrichP4957Promotes attachment and growth of neural cells in vitro
ProLong Gold Antifade MountantThermo Fisher ScientificP36930Mounting the coverslip for confocal image
PurmorphamineSTEMCELL Technologies72204Promotes DA neuron differentiation
Recombinant Human/Mouse FGF-8b Protein R&D Systems423-F8-025/CFPromotes DA neuron differentiation 
SB 431542Tocris BioscienceTB1614-GMPNeural Induction Medium ingredient
TRITON X-100VWR International9002-93-1Used for cells permeabilization in immunostaining assays
SSM1 compact orbital shaker Norrscope51901-10 SSM1 Shaker, orbital, mini 230VRotator for organoid culturing.
Water Bath Jb Academy Basic Jba5 JBA5 Grant InstrumentsGrant Instruments, USA
Antibodies used for immunostaining
Primary antibody
anti-DATAbcamab128848, RRID:AB_2665470Rabbit; 1:100 
anti-FOXA2ProteinTech22474-1-AP, RRID:AB_2879110Rabbit; 1:100 
anti-FOXG1Abcamab196868, RRID:AB_2892604Rabbit; 1:200
anti-LMX1Abcamab139726, RRID:AB_2827684Rabbit; 1:100 
anti-MAP2Abcamab5392 ,RRID:AB_2138153Chicken; 1:500
anti-OTX2ProteinTech13497-1-AP, RRID:AB_2157176Rabbit; 1:100 
anti-THAbcamab75875, RRID:AB_1310786Rabbit; 1:100 
Secondary antibodyDilution (μL)
 Alexa Fluor  594 goat anti-rabbit IgGThermo Fisher ScientificA-11012 1:400
Alexa Fluor  488 goat anti-rabbit IgGThermo Fisher ScientificA- 11008 1:400
Alexa Fluor  488 goat anti-rabbit IgGThermo Fisher ScientificA- 11008 1:400
Alexa Fluor  488 goat anti-rabbit IgGThermo Fisher ScientificA- 11008 1:400
Alexa Fluor  594 goat anti-rabbit IgG Thermo Fisher ScientificA-11012 1:400
Alexa Fluor  594 goat anti-rabbit IgG Thermo Fisher ScientificA-11012 1:400
Alexa Fluor  647 goat anti-chicken IgG Thermo Fisher ScientificA-21469 1:400

References

  1. Markram, H. Seven challenges for neuroscience. Funct Neurol. 28 (3), 145-151 (2013).
  2. Liang, K. X., et al. N-acetylcysteine amide ameliorates mitochondrial dysfunction and reduces oxidative stress in hiPSC-derived dopaminergic neurons with POLG mutation. Exp Neurol. 33 (7), 113-536 (2021).
  3. Chen, A., et al. Nicotinamide riboside and metformin ameliorate mitophagy defect in induced pluripotent stem cell-derived astrocytes with POLG mutations. Front Cell Dev Biol. 9, 304-737 (2021).
  4. Liang, K. X., et al. Disease-specific phenotypes in iPSC-derived neural stem cells with POLG mutations. EMBO Mol Med. 12 (10), 121-146 (2020).
  5. Xu, P., et al. Human midbrain dopaminergic neuronal differentiation markers predict cell therapy outcomes in a Parkinson's disease model. J Clin Invest. 132 (14), 156-768 (2022).
  6. Cooper, O., et al. Pharmacological rescue of mitochondrial deficits in iPSC-derived neural cells from patients with familial Parkinson's disease. Sci Transl Med. 4 (141), 141-190 (2012).
  7. Nguyen, H. N., et al. LRRK2 mutant iPSC-derived DA neurons demonstrate increased susceptibility to oxidative stress. Cell Stem Cell. 8 (3), 267-280 (2011).
  8. Fiorenzano, A., et al. Single-cell transcriptomics captures features of human midbrain development and dopamine neuron diversity in brain organoids. Nat Commun. 12 (1), 73-102 (2021).
  9. Velasco, S., et al. Individual brain organoids reproducibly form cell diversity of the human cerebral cortex. Nature. 570 (7762), 523-527 (2019).
  10. Qian, X., Song, H., Ming, G. L. Brain organoids: advances, applications and challenges. Development. 146 (8), dev166074 (2019).
  11. Lancaster, M. A., et al. Cerebral organoids model human brain development and microcephaly. Nature. 501 (7467), 373-379 (2013).
  12. Shariati, L., Esmaeili, Y., Haghjooy Javanmard, S., Bidram, E., Amini, A. Organoid technology: Current standing and future perspectives. Stem Cells. 39 (12), 1625-1649 (2021).
  13. Haycock, J. W. 3D cell culture: a review of current approaches and techniques. Methods Mol Biol. 695, 1-15 (2011).
  14. D'Avanzo, C., et al. Alzheimer's in 3D culture: challenges and perspectives. Bioessays. 37 (10), 1139-1148 (2015).
  15. Sun, A. X., Ng, H. H., Tan, E. K. Translational potential of human brain organoids. Ann Clin Transl Neurol. 5 (2), 226-235 (2018).
  16. Del Dosso, A., Urenda, J. P., Nguyen, T., Quadrato, G. Upgrading the physiological relevance of human brain organoids. Neuron. 107 (6), 1014-1028 (2020).
  17. Pasca, A. M., et al. Functional cortical neurons and astrocytes from human pluripotent stem cells in 3D culture. Nat Methods. 12 (7), 671-678 (2015).
  18. Asgrimsdottir, E. S., Arenas, E. Midbrain dopaminergic neuron development at the single cell level: In vivo and in stem cells. Front Cell Dev Biol. 8, 463 (2020).
  19. Zagare, A., et al. Midbrain organoids mimic early embryonic neurodevelopment and recapitulate LRRK2-p.Gly2019Ser-associated gene expression. Am J Hum Genet. 109 (2), 311-327 (2022).
  20. Mohamed, N. V., et al. Midbrain organoids with an SNCA gene triplication model key features of synucleinopathy. Brain Commun. 3 (4), fcab223 (2021).
  21. Jo, J., et al. Midbrain-like organoids from human pluripotent stem cells contain functional dopaminergic and neuromelanin-producing neurons. Cell Stem Cell. 19 (2), 248-257 (2016).
  22. Kwak, T. H., et al. Generation of homogeneous midbrain organoids with in vivo-like cellular composition facilitates neurotoxin-based Parkinson's disease modeling. Stem Cells. 38 (6), 727-740 (2020).
  23. Karmirian, K., et al. Modeling Alzheimer's disease using human brain organoids. Methods Mol Biol. 2561, 135-158 (2023).
  24. Smits, L. M., et al. Modeling Parkinson's disease in midbrain-like organoids. NPJ Parkinsons Dis. 5, 5 (2019).
  25. Qian, X., et al. Brain-region-specific organoids using mini-bioreactors for modeling ZIKV exposure. Cell. 165 (5), 1238-1254 (2016).
  26. Smits, L. M., et al. Single-cell transcriptomics reveals multiple neuronal cell types in human midbrain-specific organoids. Cell Tissue Res. 382 (3), 463-476 (2020).
  27. Sozzi, E., Nilsson, F., Kajtez, J., Parmar, M., Fiorenzano, A. Generation of human ventral midbrain organoids derived from pluripotent stem cells. Curr Protoc. 2 (9), 555 (2022).
  28. Tieng, V., et al. Engineering of midbrain organoids containing long-lived dopaminergic neurons. Stem Cells Dev. 23 (13), 1535-1547 (2014).
  29. Chambers, S. M., et al. Highly efficient neural conversion of human ES and iPS cells by dual inhibition of SMAD signaling. Nat Biotechnol. 27 (3), 275-280 (2009).
  30. Mercurio, S., Serra, L., Pagin, M., Nicolis, S. K. Deconstructing Sox2 function in brain development and disease. Cells. 11 (10), 1604 (2022).
  31. Hettige, N. C., Ernst, C. FOXG1 dose in brain development. Front Pediatr. 7, 482 (2019).
  32. Cooper, O., et al. Differentiation of human ES and Parkinson's disease iPS cells into ventral midbrain dopaminergic neurons requires a high activity form of SHH, FGF8a and specific regionalization by retinoic acid. Mol Cell Neurosci. 45 (3), 258-266 (2010).
  33. Millet, S., Bloch-Gallego, E., Simeone, A., Alvarado-Mallart, R. M. The caudal limit of Otx2 gene expression as a marker of the midbrain/hindbrain boundary: a study using in situ hybridisation and chick/quail homotopic grafts. Development. 122 (12), 3785-3797 (1996).
  34. Surmeier, D. J. Determinants of dopaminergic neuron loss in Parkinson's disease. FEBS J. 285 (19), 3657-3668 (2018).
  35. Chen, A., Yangzom, T., Sullivan, G. J., Liang, K. X. Mitochondrial dysfunction and neuronal anomalies in POLG mutant midbrain organoids. bioRxiv. , (2023).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

SMAD 8

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved