A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.
Method Article
يصف هذا البروتوكول طريقة جديدة لإنشاء عضيات ثلاثية الأبعاد في الدماغ المتوسط من الخلايا الجذعية متعددة القدرات التي يسببها الإنسان ، وتوجيه تكوينها لتقليد أنسجة الدماغ المتوسط الأصلية ، وبالتالي المساعدة في دراسة التطور والاضطرابات.
يمثل تطوير عضيات الدماغ المتوسط (MOs) من الخلايا الجذعية البشرية متعددة القدرات (hPSCs) تقدما كبيرا في فهم نمو الدماغ ، وتسهيل النمذجة الدقيقة للأمراض ، وتطوير البحوث العلاجية. يحدد هذا البروتوكول طريقة لتوليد عضيات خاصة بالدماغ الأوسط باستخدام الخلايا الجذعية المستحثة متعددة القدرات (iPSCs) ، باستخدام نهج التمايز الاستراتيجي. وتشمل التقنيات الرئيسية تثبيط SMAD المزدوج لقمع إشارات SMAD, إدارة عامل نمو الخلايا الليفية 8 ب (FGF-8b), وتنشيط مسار القنفذ سونيك باستخدام بورمورفامين ناهض, توجيه iPSCs نحو مصير منتصف الدماغ.
تحقق العضيات التي تنتجها هذه الطريقة أقطار تصل إلى 2 مم وتتضمن مجموعة متنوعة من أنواع الخلايا الظهارية العصبية ، مما يعكس التنوع الخلوي المتأصل في الدماغ المتوسط. يتضمن التحقق من صحة هذه العضيات كهياكل أصلية للدماغ المتوسط التعبير عن علامات خاصة بالدماغ الأوسط ، مما يؤكد هويتها. نتيجة ملحوظة لهذه المنهجية هو التمايز الفعال من iPSCs إلى الخلايا العصبية الدوبامينية, التي هي سمة من سمات الدماغ المتوسط.
تكمن أهمية هذا البروتوكول في قدرته على إنتاج عضيات ناضجة وظيفيا خاصة بالدماغ الأوسط تكرر عن كثب الجوانب الأساسية للدماغ المتوسط ، مما يوفر نموذجا قيما للاستكشاف المتعمق لعمليات نمو الدماغ الأوسط والفيزيولوجيا المرضية للاضطرابات ذات الصلة مثل مرض باركنسون. وبالتالي ، فإن هذا البروتوكول بمثابة مورد مهم للباحثين الذين يسعون إلى تعزيز فهمنا للدماغ البشري وتطوير علاجات جديدة للأمراض التنكسية العصبية ، مما يجعله أداة لا غنى عنها في مجال البحوث العصبية.
يمثل الدماغ البشري ، بهندسته المعمارية المعقدة وتكوينه الخلوي والجزيئي المعقد ، تحديات هائلة في أبحاث علم الأعصاب ، لا سيما في سياق نمذجة الأمراض وتطوير العلاجالخلوي 1. تزداد هذه التحديات تعقيدا بسبب التوافر المحدود للنماذج المختبرية المتطورة التي تمثل حقا تعقيد الدماغ البشري. ومع ذلك ، فإن التطورات الحديثة في تقنية الخلايا الجذعية متعددة القدرات التي يسببها الإنسان (iPSC) ، والتي تتيح التمايز الخاضع للرتحكم إلى أنواع فرعية من الخلايا العصبية المحددة ، قد فتحت طرقا واعدة لاستكشاف نمو الدماغ البشري ، والتسبب في المرض ، والاستراتيجيات العلاجية القائمة على الخلايا.
تقليديا, ثنائي الأبعاد (2D) الثقافات العصبية المشتقة من iPSCs كانت حجر الزاوية في الدراسات في المختبر التي تهدف إلى محاكاة فسيولوجيا الخلايا العصبية البشرية وعلم الأمراض. لعبت هذه الثقافات أحادية الطبقة دورا أساسيا في تعزيز فهمنا للأمراض العصبية وفي اكتشاف عوامل الحماية العصبية2،3،4،5،6،7. على الرغم من فائدتها ، فإن هذه الأنظمة ثنائية الأبعاد تقصر في محاكاة التنوع الخلوي الحقيقي والبنية ثلاثية الأبعاد (ثلاثية الأبعاد) للدماغ البشري.
يمثل ظهور التكنولوجيا العضوية للدماغ قفزة كبيرة في النمذجة المختبرية ، مما يوفر أداة تحاكي عن كثب البيولوجيا المعقدة للدماغ البشري ضمن إطار ذي صلة من الناحية الفسيولوجية8. التقنيات المبكرة في تطوير العضوية في الدماغ استفادت من الخصائص التنظيمية المتأصلة في iPSCs لتشكيل مشتقات الأديم الظاهر تلقائيا, وبالتالي محاكاة المراحل المبكرة من نموالدماغ 5,9,10,11,12. بالنظر إلى الشبكات المعقدة التي تشكلها الخلايا العصبية مع الخلايا العصبية وغير العصبية الأخرى ، تصبح النمذجة ثلاثية الأبعاد ضرورية لدراسة الأمراض التنكسية العصبية بدقة. توفر الثقافات ثلاثية الأبعاد بيئة أكثر تمثيلا في الجسم الحي ، مما يسهل التمايز العصبي المتسارع وتكوين الشبكة12،13،14 ، وتعزز تعبيرا أوسع عن الجينات العصبية مقارنة بالثقافات ثنائية الأبعاد15. تحقق الخلايا العصبية التي تم تطويرها في سياقات ثلاثية الأبعاد مورفولوجيا وسمات فسيولوجية تذكرنا أكثر بنظيراتها في الجسم الحي 16.
كانت التطورات الحديثة في نماذج الدماغ ثلاثية الأبعاد محورية في التقاط التعقيد المكاني والوظيفي للدماغ البشري بشكل أكثر فعالية. على مدى العقد الماضي ، أثبت تقدم البروتوكولات المتنوعة لتوليد كل من عضيات الدماغ بالكامل ونماذج الدماغ الخاصةبالمنطقة 11،17،18،19،20،21،22 أنه لا يقدر بثمن في نمذجة الاضطرابات العصبية مثل صغر الرأس11 ، ومرض الزهايمر14،23 ، ومرض باركنسون24. الهدف من هذا البروتوكول هو تطوير وتحسين طريقة لإنشاء MOs بشرية ثلاثية الأبعاد مشتقة من iPSCs البشرية. يهدف هذا البروتوكول على وجه التحديد إلى توليد العضيات المخصبة بالخلايا العصبية الدوبامين والمنظمة مكانيا بطريقة تحاكي عن كثب الهيكل الطبيعي ووظائف الدماغ المتوسط البشري. الغرض الأساسي من هذه العضيات هو العمل كنماذج متقدمة في المختبر لدراسة مرض باركنسون ، مما يوفر نظاما أكثر دقة وذات صلة من الناحية الفسيولوجية لاستكشاف عمليات النمو العصبي والأمراض المرتبطة بهذه الحالة. من خلال الاستفادة من iPSCs المشتقة من المريض لتوليد هذه العضيات الخاصة بالدماغ المتوسط, يسعى البروتوكول إلى تعزيز فهم آليات مرض باركنسون, تسهيل اكتشاف الأهداف العلاجية المحتملة, وتحسين تطوير العلاجات القائمة على الخلايا. من خلال هذا النهج المبتكر ، يهدف البروتوكول إلى التغلب على قيود الثقافات العصبية التقليدية ثنائية الأبعاد والمساهمة بشكل كبير في مجال أبحاث الأمراض التنكسية العصبية من خلال تقديم أداة فعالة لنمذجة الأمراض في المختبر واستكشاف استراتيجيات علاج جديدة.
على مدى السنوات العشر الماضية ، طورت فرق بحثية مختلفة عضيات الدماغ المتوسط (MOs) 8،21،25،26،27،28 ، باستخدام المنهجيات التي تظهر العديد من أوجه التشابه الرئيسية. في سعينا لتعميق فهم مرض باركنسون ، قمنا بتطوير بروتوكول لإنشاء MOs بشرية ثلاثية الأبعاد مشتقة من iPSCs البشرية. تقدم هذه العضيات ، المخصبة بالخلايا العصبية الدوبامينية المرتبة مكانيا ، نموذجا مثاليا لدراسة مرض باركنسون. لقد أسفر تطويرنا وتحسيننا لبروتوكولات العضوية الخاصة بالدماغ الأوسط عن نماذج متقدمة في المختبر ساهمت بشكل كبير في فهمنا لعمليات النمو العصبي والأمراض التنكسية العصبية. أثبتت هذه النماذج ، خاصة عند تطبيقها على MOs المشتقة من المريض ، فعاليتها كأدوات قوية لنمذجة الأمراض في المختبر ، وتقدم وجهات نظر ومنهجيات جديدة في مجال زراعة الخلايا ثلاثية الأبعاد المتقدمة.
iPSCs المتولدة من الخلايا الليفية البشرية الطبيعية ديترويت 551 والخلايا الجذعية الجنينية البشرية (ESCs) خط hESC 360 كما هو موضحسابقا 4. تم الحصول على iPSCs بموافقة لجنة غرب النرويج لبحوث الصحة الأخلاقية REK nr. 2012/919. تمت مراقبة جميع الخلايا بانتظام بحثا عن تلوث الميكوبلازما باستخدام مجموعة MycoAlert Mycoplasma Detect. يحتوي جدول المواد على معلومات حول جميع المواد والكواشف والمعدات المستخدمة في هذا البروتوكول. يصف الجدول 1 الوسائط وغيرها من المخزونات المستخدمة.
1. ذوبان iPSCs
2. بذر iPSCs
3. الحث العصبي
4. زخرفة الدماغ المتوسط
5. تضمين Matrigel وإنهاء MO والنضج
6. تلطيخ التألق المناعي
في هذه الدراسة, نقدم بروتوكولا رائدا لاشتقاق MOs من iPSCs. من الأمور الأساسية في منهجيتنا الاستخدام المبتكر لتثبيط SMAD المزدوج ، جنبا إلى جنب بشكل تآزري مع FGF-8b ومسار القنفذ الصوتي (SHH) بورمورفامين (PM). تم تصوير هذا النهج في الشكل 1. تبدأ عملية التمايز بتوجيه iPSCs ن?...
في هذا التحقيق, لقد طورنا منهجية للتمييز بين MO و iPSCs. يستخدم بروتوكولنا استراتيجية تثبيط SMAD المزدوجة المعززة بالعوامل المورفولوجية ، بما في ذلك FGF-8b و SHH ناهض PM. يحاكي هذا النهج عن كثب الإشارات التنموية الحاسمة لتطور الدماغ المتوسط. يدفع مسار التمايز الذي أنشأناه إلى تكوين...
ليس لدى المؤلفين أي تضارب في المصالح للإفصاح عنه.
تم إنشاء الشكل 1 باستخدام BioRender.com. نشكر جامعة بيرغن ميلتزرز هويسكولفوندز (رقم المشروع: 103517133) ، وجيردا ماير نيكويست جولدبراندسون ، وجيردت ماير نيكويست (رقم المشروع: 103816102) على التمويل.
Name | Company | Catalog Number | Comments |
CCD Microscope Camera Leica DFC3000 G | Leica Microsystems, Germany | ||
Chemically Defined Lipid Concentrate | Thermo Fisher Scientific | 11905031 | CDM ingredient |
Collagenase IV | Thermo Fisher Scientific | 17104019 | Reagent for gentle dissociation of human iPSCs |
Corning non-treated culture dishes | Sigma-Aldrich | CLS430589 | Suspension culture |
DMEM/F-12, GlutaMAX supplement | Thermo Fisher Scientific | 10565018 | Astrocyte differentiation basal Medium |
DPBS | Thermo Fisher Scientific | 14190250 | Used for a variety of cell culture wash |
EDTA | Thermo Fisher Scientific | 15575020 | Reagent for gentle dissociation of human iPSCs |
Essential 8 Basal Medium | Thermo Fisher Scientific | A1516901 | Basal medium for iPSC culture |
Essential 8 Supplement (50x) | Thermo Fisher Scientific | A1517101 | Supplement for iPSC culture |
FCCP | Abcam | ab120081 | Eliminates mitochondrial membrane potential and TMRE staining |
FGF-basic | PeproTech | 100-18B | Astrocyte differentiation medium ingredient |
Fluid aspiration system BVC control | Vacuubrand, Germany | ||
Formaldehyde (PFA) 16% | Thermo Fisher Scientific | 28908 | Cell fixation |
GDNF | Peprotech | 450-10 | DA neurons medium ingredient |
Geltrex (Basement membrane matrix) | Thermo Fisher Scientific | A1413302 | Used for attachment and maintenance of human iPSCs |
GlutaMAX Supplement | Thermo Fisher Scientific | 35050061 | Supplement for NSC culture |
Heracell 150i CO2 Incubators | Fisher Scientific, USA | ||
IMDM | Thermo Fisher Scientific | 21980032 | Basal medium for CDM |
InSolution AMPK Inhibitor | Sigma-Aldrich | 171261 | Neural induction medium ingredient |
Insulin | Roche | 1376497 | CDM ingredient |
iPSCs derived from Detroit 551 fibroblats | ATCC | CCL-110 | |
Leica TCS SP8 STED confocal microscope | Leica Microsystems, Germany | ||
Matrigel | Life Science | 354230 | Matrigel embedding |
Monothioglycerol | Sigma-Aldrich | M6145 | CDM ingredient |
Normal goat serum | Thermo Fisher Scientific | PCN5000 | Used for blocking buffer |
Orbital shakers - SSM1 | Stuart Equipment, UK | ||
Organoid Embedding Sheet | STEMCELL Technologies | 8579 | Matrigel embedding |
Organoid Embedding Sheet | STEMCELL Technologies | 8579 | |
PBS 1x | Thermo Fisher Scientific | 18912014 | Used for a variety of washes |
Poly-D-lysine hydrobromide | Sigma-Aldrich | P7405 | Promotes attachment and growth of neural cells in vitro |
Poly-L-ornithine solution | Sigma-Aldrich | P4957 | Promotes attachment and growth of neural cells in vitro |
ProLong Gold Antifade Mountant | Thermo Fisher Scientific | P36930 | Mounting the coverslip for confocal image |
Purmorphamine | STEMCELL Technologies | 72204 | Promotes DA neuron differentiation |
Recombinant Human/Mouse FGF-8b Protein | R&D Systems | 423-F8-025/CF | Promotes DA neuron differentiation |
SB 431542 | Tocris Bioscience | TB1614-GMP | Neural Induction Medium ingredient |
TRITON X-100 | VWR International | 9002-93-1 | Used for cells permeabilization in immunostaining assays |
SSM1 compact orbital shaker | Norrscope | 51901-10 SSM1 Shaker, orbital, mini 230V | Rotator for organoid culturing. |
Water Bath Jb Academy Basic Jba5 JBA5 Grant Instruments | Grant Instruments, USA | ||
Antibodies used for immunostaining | |||
Primary antibody | |||
anti-DAT | Abcam | ab128848, RRID:AB_2665470 | Rabbit; 1:100 |
anti-FOXA2 | ProteinTech | 22474-1-AP, RRID:AB_2879110 | Rabbit; 1:100 |
anti-FOXG1 | Abcam | ab196868, RRID:AB_2892604 | Rabbit; 1:200 |
anti-LMX1 | Abcam | ab139726, RRID:AB_2827684 | Rabbit; 1:100 |
anti-MAP2 | Abcam | ab5392 ,RRID:AB_2138153 | Chicken; 1:500 |
anti-OTX2 | ProteinTech | 13497-1-AP, RRID:AB_2157176 | Rabbit; 1:100 |
anti-TH | Abcam | ab75875, RRID:AB_1310786 | Rabbit; 1:100 |
Secondary antibody | Dilution (μL) | ||
Alexa Fluor 594 goat anti-rabbit IgG | Thermo Fisher Scientific | A-11012 | 1:400 |
Alexa Fluor 488 goat anti-rabbit IgG | Thermo Fisher Scientific | A- 11008 | 1:400 |
Alexa Fluor 488 goat anti-rabbit IgG | Thermo Fisher Scientific | A- 11008 | 1:400 |
Alexa Fluor 488 goat anti-rabbit IgG | Thermo Fisher Scientific | A- 11008 | 1:400 |
Alexa Fluor 594 goat anti-rabbit IgG | Thermo Fisher Scientific | A-11012 | 1:400 |
Alexa Fluor 594 goat anti-rabbit IgG | Thermo Fisher Scientific | A-11012 | 1:400 |
Alexa Fluor 647 goat anti-chicken IgG | Thermo Fisher Scientific | A-21469 | 1:400 |
Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article
Request PermissionThis article has been published
Video Coming Soon
Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved